Name: 폐 상피 세포에 있는 슈도모나스 감염에 담배 연기의 효력 공부 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 배우세요 폐 상피 세포에서 담배 연기 추출물이 Pseudomonas 세균 감염에 미치는 영향을 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 세균 부하 측정과 세포 배양 기술을 포함하며 호흡기 건강 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 건강 R01의 국가 학회에 의해 부분적으로 지원되었다 HL125435 및 HL142997 (CZ에).

1. 100% CSE 준비
<ol><li>60 mL 주사기로 혈청 없는 세포 배양 매체(BEAS-2B 세포를 위한 DMEM/F12; HSAEC 세포를 위한 기도 상피 세포 기저 배지)를 10mL로 그립니다.</li>
	<li>적절하게 다듬어진 1mL 파이펫 팁을 주사기노즐에 전자담배(3R4F)를 고정시키는 어댑터로 부착합니다.</li>
	<li>담배의 필터를 제거합니다. 팁 어댑터에 담배를 부착하고 담배를 연소.</li>
	<li>40mL의 연기가 함유된 공기를 10mL의 혈청 프리 미디어에 그립니다. 격렬하게 흔들어 서 중간과 연기를 혼합 (30 무승부 당).</li>
	<li>담배가 완전히 소진 될 때까지 ~ 7 분 에서 약 11x에 대해 1.4 단계를 반복하십시오.</li>
	<li>0.22 μm 필터로 훈제 매체의 10mL를 필터링하여 미생물및 용해성 입자를 제외합니다. 폐쇄된 멸균 튜브로 옮김합니다. 후속 분석 전에 30분 이상 100% CSE를 준비합니다.</li>
</ol>2. 슈도모나스 문화
<ol><li>37°C에서 야간 배양을 위한 트립틱 콩 육수(TSB) 한농어판으로 냉동 P. aeruginosa(균주 PAO143) 또는 P. 형광미굴라(균주 PAO143)를 접종하였다. 참고 : 배양에 대한 충분한 박테리아를 얻으려면 가능한 한 TSB 한천 접시에 많은 박테리아를 퍼 뜨리세요.</li>
	<li>세균 얼룩을 수집하고 탄소 공급원으로 글리세롤의 5 %와 TSB의 20 mL에서 배양.</li>
	<li>1h에 대해 200 rpm에서 37°C 인큐베이터에서 세균 현탁액을 흔들어 OD600 값 = 0.6까지 흔들어주세요. 주의: 흔들림 속도가 200rpm을 초과하지 않도록 하십시오. 더 높은 흔들림 속도는 세균 성 기색의 형태를 손상시키고 폐 상피에 세균 성 침략에 영향을 미칠 수 있습니다. 마찬가지로, 매우 침습성 박테리아를 얻기 위해 1 h로 흔들림 시간을 제한합니다. OD600 값을 측정하여 박테리아 수를 추정합니다. OD600 = 1은 ~109 콜로니 성형 유닛(CFU)/mL에 해당합니다.</li>
</ol>3. 인간 폐 상피 세포 배양 및 CSE 치료
<ol><li>히테스 배지에서 인간 BEAS-2B 세포 배양 (DMEM/F12의 500mL, 2.5 mg 인슐린, 2.5 mg 트랜스퍼린, 2.5 mg 의 나트륨 셀레니트, 2.5 mg 이송린, 10 μM 하이드로코르티손, 10 μM β-estradiol, 10 mMHE, 2 mM L-글루타민)으로 보충된10%태아 소 세루(FBS)가 이전에 설명되었다.</li>
	<li>기도 상피 세포 배양 배지(500mL의 기도 세포 기저배지, 500 μg/mL HSA) 에서 인간 1차 소형기도 상피 세포(HSAEC)를 배양하고, 0.6 μM 리놀레산, 0.6 μg/mL 레시틴, 6mM L-글루타민, 0.4% 추출물 P, 1.0 μM 에피네프린, 5 μg/mL 트랜스퍼린, 10nM T3, 1 μg/mL 하이드로코르티손, Rh EGF 5 ng/mL, 및 5g ll.인슐린 세포를 37°C에서 5% CO2로배양한다.</li>
	<li>세포가 플레이트 의 바닥에서 완전히 분리 될 때까지 5 분 동안 0.25 % 트립신의 1 mL로 세포를 분리합니다.</li>
	<li>트립신을 중화하고 15 mL 튜브에서 세포를 수집하기 위해 완전한 HITES 매체10 mL을 추가하십시오. 300 x g에서 4 °C에서 원심 분리기는 5 분 동안. 주의: 과다소화가 세포 사망을 일으킬 수 있기 때문에 현미경 검사법에 의한 트립신 소화 시간을 주의 깊게 모니터링합니다.</li>
	<li>10% FBS로 치테스 배지의 2mL에서 수퍼를 버리고 세포를 다시 중단한다.</li>
	<li>상기 셀 서스펜션의 파이펫 10 μL을 플레이트에 삽입하여 자동 셀 카운터에 삽입하여 세포/mL의 농도를 얻습니다.</li>
	<li>플레이트 BEAS-2B 세포는 3× 105 세포/mL의 농도에서 HITES 배지에서 총 2mL의 총 부피로 6개의 웰 플레이트로 하룻밤 배양을 위한 FBS의 10%를 보충하였다.</li>
	<li>셀을 약 80% 인플루엔티지 또는 5 x 105 세포/mL로 치료하고, 3h의 경우 4%의 CSE를 갖는다. CSE 치료 전에, FBS의 1%로 HITES 매체로 배지를 변경합니다.</li>
</ol>4. 세균 감염
<ol><li>P. aeruginosa 또는 P. 플루오레스향 미굴라 (~1 × 107 CFU/mL)를 CSE 처리 된 세포의 각 우물에 추가하고 5 % CO2에서37 °C에서 1 시간 동안 배양한다.</li>
	<li>수퍼나티를 흡인하고 신선한 HITES 배지 2mL로 교체하여 4% CSE 및 100 μg/mL 젠타미신으로 처리합니다. 참고: 겐타미신은 인간의 폐 상피 세포막을 관통할 수 없기 때문에 사용됩니다. 따라서, 그것은 매체에 있는 모든 박테리아를 죽일 수 있습니다 그러나 폐 상피 세포를 침략한 박테리아는 아닙니다.</li>
	<li>CSE/겐타미신 처리 후 37°C에서 5%CO2에서,슈퍼나티를 흡인하고 후속 세균 농도 측정을 위해 PBS로 세포 3배를 세척한다. 참고: 내재된 박테리아를 확인하기 위해 GFP 표지P. 형광미굴라에 감염된 세포는 형광 현미경 검사의 밑에 관찰되었다.</li>
</ol>5. 드롭 플레이트 방법을 사용하여 세균 농도의 결정
<ol><li>낙하 플레이트 방법으로 감염된 세포에서 세균 부하를 결정하려면, 감기 PBS의 2mL로 gentamycin 처리 된 세포를 2 x로 세척하십시오.</li>
	<li>각 웰에 셀 리시스 버퍼 1mL(PBS에서 0.5% 트리톤 X-100)를 추가합니다.</li>
	<li>TSB 한천 판에 다음 접종을 위해 그라데이션(1:10, 1:100, 1:1,000 및 1:10,000)에서 내부화된 박테리아를 함유한 세포 용액을 희석시 희석시.</li>
	<li>16h의 배양 후 세균성 식민지를 세어 CFU의 결과를 얻습니다.</li>
</ol>6. 세균 성 16S rRNA의 RT-qPCR 검출
<ol><li>상기와 같이 슈도모나스-감염된폐 상피 세포(~1 x 106 세포/mL)를 젠타마이신으로 치료한다. 매체를 흡인하고 감기 PBS2mL로 세포를 2x로 세척합니다.</li>
	<li>구아니듐 티오세네이트 리시스 버퍼의 0.35 mL을 6 웰 플레이트의 웰 당 추가합니다. 셀 스크레이퍼로 세포를 수집합니다. 리세이트 파이펫은 마이크로센심심분리기 튜브에 넣고 파이펫과 부드럽게 섞습니다.</li>
	<li>리자이트에 70% 에탄올을 새로 준비한 것과 동일한 볼륨(0.35mL)을 첨가하고 잘 섞는다. 모든 샘플을 2mL 수집 튜브에 배치된 스핀 컬럼으로 전송합니다. 20-25°C에서 30s용 10,000 x g의 원심분리기. 그런 다음 컬렉션 튜브에서 버퍼를 폐기합니다.</li>
	<li>0.7 mL의 세척 버퍼 1로 컬럼을 씻으시다. 30초동안 10,000 x g의 원심분리기입니다. 0.5mL의 완충액으로 컬럼 2x를 세척하여 멤브레인 바운드 RNA를 세척합니다. 원심분리를 10,000 x g에서 2분 동안 반복합니다.</li>
	<li>컬럼을 새로운 1.5mL 수집 튜브에 넣습니다. 30-50 μL RNase가 없는 물을 추가합니다. 원심 분리기 10,000 x g에서 1 분 동안. 흐름을 수집하고 RNA 농도를 측정합니다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 역전사 반응을 수행합니다. 총 RNA 1 μg을 반응 버퍼 10mL, 역전사 1μL 및 RNase 없는 물과 혼합하여 20μL 반응을 합니다. 역전사 반응을 37°C에서 1시간 동안 수행한 다음 5분 동안 95°C를 수행한다.</li>
	<li>cDNA 템플릿(위의 각 역전사 반응의 1 μL), SYBR 염료를 함유한 마스터 믹스의 5μL, 각 200nM 특이 프라이머의 1μL, 다음 PCR 분석을 위한 20 μL 혼합물에 물을 혼합합니다. 참고 : 다음은 P. aeruginosa의16S rRNA를 대상으로 프라이머입니다 : 앞으로 5′-CAAAACTACTGAGCTAGAGTACG-3′; 역 5′-타가트CTCAAG GATCCCAACGGC-3′. GAPDH는 다음과 같은 프라이머와 로딩 컨트롤로 사용되었다: 앞으로: 5′-GGCATGGGGACTTCATGA-3′; 역: 5'-TTCACCATGGAGAAGGC-3′.</li>
	<li>비교 CT 메서드를 사용하여 식을 결정합니다.</li>
</ol>7. 유동 세포측정을 가진 형광 성구 성구의 검출
<ol><li>상기 형광 슈도모나스-감염된폐 상피 세포(~1 x 106 세포/mL)를 이전에 설명한 대로 젠타마이신으로 치료한다. 매체를 흡인하고 감기 PBS2mL로 세포를 2x로 세척합니다.</li>
	<li>GFP의 검출을 위해 509 nm의 파장에서 유동 세포계로 샘플을 분석합니다. 각 읽기를 100,000 개에서 종료합니다. 획득한 데이터를 관련 소프트웨어로 분석합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Vogelmeier, C. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Strategy+for+the+Diagnosis%2C+Management%2C+and+Prevention+of+Chronic+Obstructive+Lung+Disease+2017+Report.+GOLD+Executive+Summary%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).</li>
<li>Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risk+factors+for+lung+cancer+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Care+Journal%22%5BJournal%5D)">Risk factors for lung cancer worldwide.</a> European Respiratory Care Journal. 48 (3), 889-902 (2016).</li>
<li>Lugade, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+exposure+exacerbates+lung+inflammation+and+compromises+immunity+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke exposure exacerbates lung inflammation and compromises immunity to bacterial infection.</a> Journal of Immunology. 192 (11), 5226-5235 (2014).</li>
<li>Strzelak, A., Ratajczak, A., Adamiec, A., Feleszko, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+Smoke+Induces+and+Alters+Immune+Responses+in+the+Lung+Triggering+Inflammation%2C+Allergy%2C+Asthma+and+Other+Lung+Diseases%3A+A+Mechanistic+Review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Tobacco Smoke Induces and Alters Immune Responses in the Lung Triggering Inflammation, Allergy, Asthma and Other Lung Diseases: A Mechanistic Review.</a> International Journal of Environmental Research Public Health. 15 (5), (2018).</li>
<li>Zuo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelated+role+of+cigarette+smoking%2C+oxidative+stress%2C+and+immune+response+in+COPD+and+corresponding+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Interrelated role of cigarette smoking, oxidative stress, and immune response in COPD and corresponding treatments.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 307 (3), 205-218 (2014).</li>
<li>Morse, D., Rosas, I. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke-induced+lung+fibrosis+and+emphysema%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke-induced lung fibrosis and emphysema.</a> Annual Review of Physiology. 76, 493-513 (2014).</li>
<li>Rigotti, N. A., Clair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+tobacco+use%3A+the+neglected+cardiovascular+disease+risk+factor%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Managing tobacco use: the neglected cardiovascular disease risk factor.</a> European Heart Journal. 34 (42), 3259-3267 (2013).</li>
<li>Jethwa, A. R., Khariwala, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco-related+carcinogenesis+in+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Review%22%5BJournal%5D)">Tobacco-related carcinogenesis in head and neck cancer.</a> Cancer Metastasis Review. 36 (3), 411-423 (2017).</li>
<li>Papi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infections+and+airway+inflammation+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease+severe+exacerbations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infections and airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease severe exacerbations.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 173 (10), 1114-1121 (2006).</li>
<li>Garcia-Vidal, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+patients+hospitalised+for+COPD+exacerbation%3A+a+prospective+study%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in patients hospitalised for COPD exacerbation: a prospective study.</a> European Respiratory Journal. 34 (5), 1072-1078 (2009).</li>
<li>Murphy, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+in+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa in chronic obstructive pulmonary disease.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (8), 853-860 (2008).</li>
<li>Wedzicha, J. A., Seemungal, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPD+exacerbations%3A+defining+their+cause+and+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">COPD exacerbations: defining their cause and prevention.</a> Lancet. 370 (9589), 786-796 (2007).</li>
<li>Pavord, I. D., Jones, P. W., Burgel, P. R., Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbations+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Chronic+Obstructive+Pulmonary+Disease%22%5BJournal%5D)">Exacerbations of COPD.</a> International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease. 11, Spec Iss 21-30 (2016).</li>
<li>Sethi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+infection+and+the+pathogenesis+of+COPD%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Bacterial infection and the pathogenesis of COPD.</a> Chest. 117 (5), Suppl 1 286-291 (2000).</li>
<li>Weinreich, U. M., Korsgaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+colonisation+of+lower+airways+in+health+and+chronic+lung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Bacterial colonisation of lower airways in health and chronic lung disease.</a> Clinical Respiratory Journal. 2 (2), 116-122 (2008).</li>
<li>Hook, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+staphylococcal+aggregation+protects+against+lethal+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Disruption of staphylococcal aggregation protects against lethal lung injury.</a> Journal of Clinical Investigation. 128 (3), 1074-1086 (2018).</li>
<li>Ross, K. F., Herzberg, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+immunity+in+mucosal+epithelial+cells%3A+fortifying+the+barrier+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infection%22%5BJournal%5D)">Autonomous immunity in mucosal epithelial cells: fortifying the barrier against infection.</a> Microbes Infection. 18 (6), 387-398 (2016).</li>
<li>Bedi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor-gamma+agonists+attenuate+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists attenuate biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa.</a> FASEB Journal. 31 (8), 3608-3621 (2017).</li>
<li>Tomita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+p21%28CIP1%2FWAF1%29+and+B+cell+lymphoma+leukemia-x%28L%29+expression+and+reduced+apoptosis+in+alveolar+macrophages+from+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased p21(CIP1/WAF1) and B cell lymphoma leukemia-x(L) expression and reduced apoptosis in alveolar macrophages from smokers.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 166 (5), 724-731 (2002).</li>
<li>Gally, F., Chu, H. W., Bowler, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+decreases+airway+epithelial+FABP5+expression+and+promotes+Pseudomonas+aeruginosa+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke decreases airway epithelial FABP5 expression and promotes Pseudomonas aeruginosa infection.</a> PLoS One. 8 (1), 51784(2013).</li>
<li>Thorne, D., Adamson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+in+vitro+cigarette+smoke+exposure+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">A review of in vitro cigarette smoke exposure systems.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 65 (7-8), 1183-1193 (2013).</li>
<li>Keyser, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+method+for+assessment+of+dose+in+in+vitro+evaluations+using+a+VITROCELL%28R%29+VC10%28R%29+smoke+exposure+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative method for assessment of dose in in vitro evaluations using a VITROCELL(R) VC10(R) smoke exposure system.</a> Toxicology In Vitro. 56, 19-29 (2019).</li>
<li>Del Arroyo, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMDA+receptor+modulation+of+glutamate+release+in+activated+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">NMDA receptor modulation of glutamate release in activated neutrophils.</a> EBioMedicine. 47, 457-469 (2019).</li>
<li>Lai, Y., Li, J., Li, X., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+modulates+p300+and+Sirt1+to+promote+PRMT1+stability+via+an+SCF%28Fbxl17%29-recognized+acetyldegron%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide modulates p300 and Sirt1 to promote PRMT1 stability via an SCF(Fbxl17)-recognized acetyldegron.</a> Journal of Cell Sciences. 130 (20), 3578-3587 (2017).</li>
<li>Bauman, S. J., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+vesicles+associate+with+and+are+internalized+by+human+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa vesicles associate with and are internalized by human lung epithelial cells.</a> BMC Microbiology. 9, 26(2009).</li>
<li>Ichikawa, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+pseudomonas+aeruginosa+with+epithelial+cells%3A+identification+of+differentially+regulated+genes+by+expression+microarray+analysis+of+human+cDNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Interaction of pseudomonas aeruginosa with epithelial cells: identification of differentially regulated genes by expression microarray analysis of human cDNAs.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 97 (17), 9659-9664 (2000).</li>
<li>Rodriguez, D. C., Ocampo, M., Salazar, L. M., Patarroyo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis%3A+An+essential+issue+for+in+vitro+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiologyopen%22%5BJournal%5D)">Quantifying intracellular Mycobacterium tuberculosis: An essential issue for in vitro assays.</a> Microbiologyopen. 7 (2), 00588(2018).</li>
<li>Long, C., Lai, Y., Li, T., Nyunoya, T., Zou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+extract+modulates+Pseudomonas+aeruginosa+bacterial+load+via+USP25%2FHDAC11+axis+in+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke extract modulates Pseudomonas aeruginosa bacterial load via USP25/HDAC11 axis in lung epithelial cells.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular Molecular Physiology. 318 (2), 252-263 (2020).</li>
<li>Feldman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+flagella+in+pathogenesis+of+Pseudomonas+aeruginosa+pulmonary+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Role of flagella in pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection.</a> Infections and Immunity. 66 (1), 43-51 (1998).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Agitation%2C+Aeration+and+Temperature+on+Production+of+a+Novel+Glycoprotein+GP-1+by+Streptomyces+kanasenisi+ZX01+and+Scale-Up+Based+on+Volumetric+Oxygen+Transfer+Coefficient%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Effects of Agitation, Aeration and Temperature on Production of a Novel Glycoprotein GP-1 by Streptomyces kanasenisi ZX01 and Scale-Up Based on Volumetric Oxygen Transfer Coefficient.</a> Molecules. 23 (1), 125(2018).</li>
<li>Mingeot-Leclercq, M. P., Glupczynski, Y., Tulkens, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycosides%3A+activity+and+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Aminoglycosides: activity and resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 43 (4), 727-737 (1999).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin-1+receptor+antagonists+prevent+the+development+of+pulmonary+emphysema+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Endothelin-1 receptor antagonists prevent the development of pulmonary emphysema in rats.</a> European Respiratory Journal. 35 (4), 904-912 (2010).</li>
<li>Gardi, C., Stringa, B., Martorana, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+anti-emphysema+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Animal models for anti-emphysema drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 10 (4), 399-410 (2015).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+vitro+model+of+primary+human+pediatric+lung+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">A novel in vitro model of primary human pediatric lung epithelial cells.</a> Pediatric Research. 87 (3), 511-517 (2019).</li>
<li>Amatngalim, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+epithelial+differentiation+by+cigarette+smoke+dysregulates+respiratory+host+defence%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Aberrant epithelial differentiation by cigarette smoke dysregulates respiratory host defence.</a> European Respiratory Journal. 51 (4), 1701009(2018).</li>
<li>Tan, Q., Choi, K. M., Sicard, D., Tschumperlin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+organoid+engineering+as+a+step+toward+lung+regeneration+and+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human airway organoid engineering as a step toward lung regeneration and disease modeling.</a> Biomaterials. 113, 118-132 (2017).</li>
<li>Miller, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lung+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).</li>
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폐 상피 세포로 세균성 침입은 세균 감염의 병인에 있는 결정적인 단계입니다. 세포내 세균 성 침입 과정은 다음 세 단계로 나눌 수 있습니다 : 첫째, 박테리아접촉및 그들의 기색 세포를 사용하여 상피 세포의 표면에 부착. 둘째, 박테리아는 내산화를 거치거나 세포막을 관통한다. 마지막으로, 박테리아는 세포 방어 메커니즘25,,26을성공적으로 탈출하면 세포를 복제하고 식민지화한다. 폐 미세 파기에서 세균 감염의 관찰을 위한 접근은 오래 개발되었지만 폐 상피 세포에 대한 제한된 지식으로27,,28. 이 연구는 세 가지 접근법을 통해 폐 상피 세포에 있는 세균부하를 결정했습니다: 낙하 판 분석, 슈도모나스 리보솜 16S RNA를 위한 RT-qPCR, 및 유동 세포측정법. 세 가지 접근 방식은 모두 비슷한 민감도와 ...

담배 흡연은 전 세계 수백만 명의 공중 보건에 영향을 미칩니다. 폐암및 만성폐쇄성 폐질환(COPD)을 포함한 많은 해로운 질환은 담배 흡연1,2와2관련이 있는 것으로 보고된다. 담배 흡연은 호흡기33, 4,4,5에서급성 미생물 감염에 대한 감수성을 증가시킨다. 더욱이, 장착 증거는 담배 흡연이 많은 만성 질환의 발병을 향상시킨다는 것을 증명6,,7,,8. 예를 들어, 담배 흡연은 COPD 악화를 일으키는 바이러스성 또는 세균성 감염을 증가시킬 수 있습니다9. 에인디컬쳐가 COPD의 급성 악화에 에 기여하는 세균성 병원체 들 중, 기회성 그람 음성 혈관 병원균, 슈도모나스 아루기노사,가난한 예후 및 더 높은 사망과 상관 관계가 있는 감염을 일으킨다10,,11. COPD 악화는 병리학적 진행을 가속화하여 질병을 악화시다. 항증상 관리를 제외하고는 COPD 악화에 대한 효과적인 치료법이없다(12). COPD 악화는 환자 사망률을 촉진하고 삶의 질을 감소시키고 사회13에대한 경제적 부담을 증가시킵니다.
호흡기기도는 개방된 시스템으로, 지속적으로 외부적으로 존재하는 다양한 미생물 병원균을 받는다. 기회성 세균성 병원균은 일반적으로 상부 기도에서 검출되지만 때로는 하부기도(14,,15)에서관찰된다. 동물 모델P. aeruginosa감염 후 1h로 즉시 폐포 낭에서 검출될 수 있다16. 주요 방어 메커니즘으로, 대식세포 또는 호중구와 같은 면역 세포는 기도에 있는 박테리아를 제거합니다. 폐 상피 세포는 첫 번째 생리 장벽으로서 미생물 감염에 대한 숙주 방어에서 독특한 역할을 수행합니다. 폐 상피 세포는 면역세포(17)와무관한 미생물 침입, 식민지 화 또는 복제를 조절할 수 있다. PPARg를 포함한 상피 세포에서 발견되는 일부 분자는 항균 기능을 발휘하여 폐 상피세포(18)에서세균 성 식민지화 및 복제를 조절한다. 담배 흡연은 분자를 변경하고 폐 상피 세포(19,,20)에서정상적인 방어 기능을 손상시킬 수 있습니다. 최근 연구에 따르면 로봇 흡연장치(21,,22)를사용하여 폐 상피 세포에 담배 연기가 직접 노출되었다고 보고하였다. 연기에 노출은 CSE의 적용을 포함하여 다른 방법으로 수행될 수 있습니다. CSE의 준비는 담배 연기에 간접적으로 드러나는 혈관 내피 세포를 포함하여 그밖 세포 모형에 있는 잠재적인 응용을 가진 재현가능한 접근입니다.
이 보고서는 폐 상피 세포에 있는 세균성 부하를 바꾸기 위하여 담배 연기 추출물을 생성하는 프로토콜을 기술합니다. CSE는 P. aeruginosa의세균성 부하를 증가시키고, 일반적으로 COPD 악화에서 볼 수있는 세균 감염의 재발에 기여할 수 있습니다. 종래의 방법은 CSE의 제조를 위해 사용된다. 폐 상피 세포는 기하급수적인 성장 단계에서 3 시간 동안 4 % CSE로 치료됩니다. 대안적으로, 단층 배양폐 상피 세포는 공기 액체 인터페이스에서 담배 연기에 직접 노출될 수 있다. CSE 처리된 세포는 그 때 10의 감염 (MOI)의 복합성에 슈도모나스와 도전됩니다. 박테리아는 그들의 전체 침략적인 용량을 유지하기 위하여 그들의 flagella의 형태가 그대로 남아 있는지 확인하기 위하여 특정 동요 속도로 전파됩니다. 겐타마이신은 배양 배지에 남아 있는 박테리아를 죽이기 위해 사용되며, 이에 따라 세균 부하의 후속 결정 시 잠재적 오염을 감소시킵니다. 이 프로토콜은 또한 다른 모델에서 슈도모나스 감염을 연구하는 강력한 도구로 활용된 GFP 라벨 슈도모나스(Pseudomonas)를사용합니다. Pseudomonas 대표적인 균주는 P. 형광의미굴라(23)이다. Migula23 CSE 치료 후 감염 또는 세균 부하의 정도는 콜로니 카운팅을 이용한 드롭 플레이트 방법, 슈도모나스 16S rRNA 특이프라이머를 이용한 정량적 PCR 또는 형광 슈도모나스에감염된 세포종계의 유동 세포측정등 세 가지 방법으로 결정된다. 이 프로토콜은 폐 상피 세포에 있는 세균성 감염에 담배 연기의 효력을 연구하기 위하여 간단하고 재현가능한 접근입니다.

<table><tbody><tr><td>50mL 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>기도 상피 세포 기저 매체</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>박테리아 쉐이커</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>기관지 상피 세포 성장 키트</td><td>ATCC</td><td>PCS-300-040</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time PCR 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>고용량 RNA-to-DNA 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4387406</td><td></td></tr><tr><td>HITES 매체</td><td>ATCC</td><td>ATCC 30-2004</td><td></td></tr><tr><td>인간 BEAS-2B 세포</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-9609</td><td></td></tr><tr><td>인간 1차 소기도 상피 세포</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-300-030</td><td></td></tr><tr><td>LSRII 유세포</td> 분석기 <td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>닛콘 컨포칼 현미경</td><td>Nikkon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OD reader</td><td>USA Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR 프라이머</td><td>ITD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>녹농</td>균 <td>ATCC ATCC</td><td>47085</td><td>PAO1-LAC</td></tr><tr><td>슈도모나스 플루오레센스 미굴라</td><td>ATCC</td><td>ATCC 27853</td><td>P.aeruginosa GFP</td></tr><tr><td>연구용 담배(3R4F)</td><td>켄터키 대학교</td><td>TP-7-VA</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy 미니 키트</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Transprent PET Transwell 인서트</td><td>Corning Costar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

폐 상피 세포에 있는 슈도모나스 감염에 담배 연기의 효력 공부

Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells

담배 흡연은 폐 기종및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)의 주요 병인원인입니다. 담배 흡연은 또한 호흡기내 세균 감염에 대한 감수성을 촉진합니다. 그러나, 인간의 폐 상피 세포에 있는 세균성 감염에 담배 연기가 나는 의 효력은 아직 철저히 공부되지 않았습니다. 여기에 설명된 담배 흡연 추출물(CSE), CSE를 함유한 인간 폐 상피 세포의 치료, 세균 감염 및 감염 결정의 준비를 위한 상세한 프로토콜이 기재되어 있다. CSE는 종래의 방법으로 제조하였다. 폐 상피 세포는 CSE 처리된 세포가 3h. CSE 처리된 세포에 대해 4% CSE로 처리된 다음, 10의 감염(MOI)의 복합성에서 슈도모나스로 감염되었다. 세포의 세균적 하중은 세 가지 다른 방법에 의해 결정되었다. 결과는 CSE가 폐 상피 세포에 있는 슈도모나스 부하를 증가했다는 것을 보여주었습니다. 따라서 이 프로토콜은 폐 상피 세포의 세균 감염에 대한 담배 연기의 영향을 연구하기 위한 간단하고 재현 가능한 접근법을 제공합니다.

다이어그램은 그림 1에서프로토콜을 설명하는 데 사용됩니다. 폐 상피 BEAS-2B 세포는 CSE로 처리되고 슈도모나스로도전하였다. 배양 배지에서 슈도모나스는 첨가된 젠타마이신에 의해 살해되었고 세포는 낙하판 분석, RT-qPCR 검출을 거쳐 슈도모나스 리보섬 16S RNA, 및 유동 세포측정을 하였다. 대조군과 비교하여 CSE 치료는 낙하판방법(도 2)에서세균 감염이 크게 증가하였다. 이에 상응하여, CSE는 HSAEC에서 세균 부하에 영향을미쳤다(그림 3). 세포 생존력은 4% CSE 처리의 3 시간 후에, 슈도모나스 감염의 1 h에서, 또는 젠타마이신 처리의 1 h에서(도 4 그림 5 도 <stro...

여기에 설명된 담배 연기 추출물이 폐 상피 세포의 세균 성 식민지화에 어떻게 영향을 미치는지 연구하는 프로토콜이 있습니다.

Cigarette smoking is the major etiological cause for lung emphysema and chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Cigarette smoking also promotes ...

이 프로토콜은 담배 연기가 폐 상피 세포에 있는 슈도모나스 세균부하에 영향을 미치는지 결정하기 위하여 3개의 접근을 이용합니다. 이 방법은 내피 세포 또는 다른 세포 탭으로 확장될 수 있다. 담배 연기 추출, 세균 감염 및 세균 부하와의 결정의 준비는 이 비디오에서 자세히 설명되어 있습니다.이 절차는 새로운 사용자를 위해 따라하기가 매우 쉽습니다. 60 밀리리터 주사기에 혈청없는 세포 배양 배지의 10 밀리리터를 그립니다. 트림의 좁은 끝을 1 밀리리터 파이펫 팁에 주사기의 노즐에 부착하고 담배를 잡을 어댑터로 연결합니다.담배에서 필터를 제거하고 어댑터에 담배를 부착합니다. 분석 작업을 수행하기 30 분 전에 담배를 연소하고 주사기에 공기를 포함하는 연기 40 밀리리터를 그립니다. 주사기를 힘차게 흔들어 미디엄과 연기를 섞는다.담배가 완전히 소진 될 때까지 그리기 과정을 반복하여 약 7 분 안에 약 11 개의 무승부가 필요합니다. 매체에서 미생물 및 불용성 입자를 제거하려면 0.22 미크론 필터를 통해 필터링합니다. 그런 다음, 중간을 폐쇄멸균튜브로 이송한다.선택한 슈도모나스 균주와 트립틱 콩 국물 또는 TSB 오거 플레이트를 접종한다. 하룻밤 동안 접시를 섭씨 37도에서 배양하십시오. 탄소 공급원으로 5%의 글리세롤을 함유한 20밀리리터TSB를 포함하는 튜브를 준비합니다.오거 플레이트에서 얼룩을 수집하고 TSB를 접종합니다. 600 나노미터에서 광학 밀도가 0.6이 될 때까지 약 1 시간 동안 200 RPM에서 37섭씨 37도 쉐이커에서 슈도모나스 서스펜션을 배양한다. 원고에 설명된 바와 같이 폐 상피 세포를 배양한 후 세포에 0.25%의 트립신을 1밀리리터를 추가합니다.약 5분 후, 세포가 플레이트 바닥에서 완전히 분리되었을 때 트립신을 중화시키기 위해 전체 Heights 배지의 10 밀리리터를 추가합니다. 세포를 15 밀리리터 튜브로 이송합니다. 그런 다음, 섭씨 4도에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 300회 G.Remove하고 슈퍼나티를 폐기합니다.그런 다음 10%의 FBS를 통해 셀을 Heights 배지의 밀리리터로 다시 일시 중단합니다. 피펫 10 새로운 플레이트에 상피 셀 서스펜션의 마이크로 리터. 자동 세포 카운터를 사용하여 세포 농도를 얻습니다.밀리리터당 5번째 세포에 3회 10분의 10의 농도로 폐 상피 세포를 플레이트, 잘 당 중간 의 총 2 밀리리터의 총 부피. 하룻밤 동안 접시를 배양합니다. 세포가 약 80%의 합류에 도달하면 배지를 Heights 배지와 1%FBS로 대체합니다.그런 다음 우물에 4 %의 CSE를 추가하고 3 시간 동안 플레이트를 배양합니다. CSE 처리폐 상피 세포의 각 웰에 슈도모나를 추가합니다. 그런 다음, 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 1 시간 동안 플레이트를 배양.다음으로, 6개의 웰 플레이트의 배지를 젠타마이신밀리리터당 4%CSE와 100마이크로그램을 함유한 2밀리리터의 신선한 하이츠 배지로 교체합니다. 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 1시간 동안 플레이트를 배양한 후 우물에서 배지를 흡인시합니다. 겐타마이신 처리 세포를 두 번 씻어 차가운 PBS의 두 밀리리터로 씻으신다.폐 상피 세포의 박테리아 부하는 낙하 플레이트 방법, qRT-PCR 또는 유동 세포측정법에 의해 검출될 수 있다. 폐 상피 세포의 각 우물에 세포 리시스 버퍼1 밀리리터를 추가합니다. 1에서 10에서 10, 000에 이르는 셀 용양의 직렬 희석을 복구합니다.그런 다음 TSB 오거 플레이트를 접종합니다. 16시간의 배양 후, 세균성 식민지수를 계산하여 폐 상피 세포에 얼마나 많은 식민지 형성 유닛이 존재했는지 결정한다. 관니디늄 티오세네이트 리시스 버퍼의 0.35 밀리리터를 폐 상피 세포의 각 웰에 추가합니다.셀 스크레이퍼로 세포를 수집합니다. 리세이트 파이펫은 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 파이펫과 부드럽게 섞습니다. lysate에 70%에탄올에 신선하게 준비된 0.35 밀리리터를 넣고 잘 섞습니다.모든 샘플을 2밀리리터 수집 튜브에 배치된 스핀 컬럼으로 전송합니다. 원심 분리는 10, 000 배 G 및 섭씨 20 ~ 25도에서 30 초 동안 수집 튜브를 분리합니다. 수집 튜브의 버퍼를 버리고 0.7 밀리리터의 세척 버퍼로 컬럼을 세척합니다.30초 동안 10, 000배 G로 컬럼을 원심분리합니다. 버퍼0.5 밀리리터로 컬럼을 두 번 세척합니다. 원심분리를 10회, 000회 G로 2분간 반복합니다.컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 수집 튜브에 넣고 RNase 가 없는 물 30~50마이크로리터를 추가합니다. 10, 000회 G에서 튜브를 원심분리한 후, 1분 동안 의 흐름을 수집하고 RNA 농도를 측정한다. 20 마이크로리터 역전사 반응을 준비하기 위해 반응 버퍼 10마이크로리터, 역전사 및 RNase 가 없는 물의 마이크로리터 10마이크로리터를 가진 총 RNA의 마이크로그램 1마이크로그램을 만듭니다.제조업체의 프로토콜에 따르면 1시간 동안 섭씨 37도에서 역전사 반응을 수행한 다음 섭씨 95도에서 5분간 진행합니다. 그런 다음 각 cDNA 샘플의 마이크로리터 1개를 사이버 염료를 포함하는 마스터 믹스의 5개의 마이크로리터와 각각 200나노몰러 특이적 프라이머의 1개의 마이크로리터를 혼합한다. 총 20마이크로리터에 물을 추가합니다.제조업체의 권장 사항에 따라 PCR 분석을 수행합니다. 그런 다음 비교 CT 방법을 사용하여 식을 결정합니다. BEAS-2B 세포에서는 세포가 3시간 동안 4%CSE로 치료되었을 때 생존가능성은 크게 변하지 않았습니다.슈도모나스 감염으로 한 시간도 생존가능성에 실질적으로 영향을 미치지 않았다. 마지막으로, 그들은 배양 배지에서 슈도모나를 죽이기 위해 젠타마이신을 사용하여 세포 생존에 통계적으로 유의한 영향을 미치지 않았다. 낙하 플레이트 방법에 의해 측정된 바와 같이, BEAS-2B 세포내세균감염은 CSE를 이용한 치료에 의해 실질적으로 증가하였다.HSAEC의 CSE 치료에도 마찬가지였습니다. CSE 처리BEAS-2B 세포의 세균감염은 또한 슈도모나스 아에루기노사의 증가를 나타내는 16S rRNA의 양을 정량화하기 위해 RT-PCR을 사용하여 평가되었다. CSE로 처리되고 슈도모나스 형광미굴라에 감염된 BEAS-2B 세포는 509 나노미터에서 혈류 세포측정에 의해 분석되었다.결과는 또한 CSE 처리가 세균성 감염을 증가시킨다는 것을 표시했습니다. 형광 현미경 검사법의 결과는 GFP 표지된 박테리아가 슈도모나스 형광소 미굴라 감염 실험에서 BEAS-2B 세포와 공동 국화되었다는 것을 보여주었습니다. 세포는 인간의 행동을 모방하고 직접 폐 상피 세포에 담배 연기의 효과를 연구 할 수 있도록 할 수있는 로봇 흡연과 담배 연기에 노출 될 수있다.이 기술은 폐 감염의 맥락에서 그밖 세포 탭에 담배 연기를 탐구하기 위하여 이용될 수 있었습니다. 기술된 접근은 담배 연기가 나는 폐 상해 및 C0PD 추가에 대하여 효과적인 치료의 발달을 위한 기초가 될 것입니다

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

폐 상피 세포는 생쥐의 호흡기로부터 격리하고 차별 호흡기 상피의 모델로 공기 - 액체 인터페이스에서 교양 수 있습니다. 프로토콜이 환경 독소에 분자 반응을 연구하기 위해, culturing를 분리하고 주류 담배 연기 이러한 세포를 노출에 대해 설명합니다.

에어 리퀴드 인터페이스에서 마우스 호흡기 상피 세포 및 실험 담배 연기에 노출의 분리

Source: Li, T., et al. Studying Effects of Cigarette Smoke on Pseudomonas Infection in Lung Epithelial Cells. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates how cigarette smoke extract weakens antimicrobial defense in lung epithelial cells by reducing AMP production, leading to increased bacterial invasion. The procedure measures intracellular bacterial load to assess the impact of smoke exposure on host-pathogen interactions.

Analyzing the Effects of Cigarette Smoke on Antimicrobial Defense in Lung Epithelial Cells

우리는 마우스 모델에서 지속적인 장기 만성 녹농균기도 감염을 확립하는 한천 비즈 방법을 서술.

장기 만성<em&gt; 녹농균</em마우스의&gt;기도 감염

이 프로토콜의 목표는 COPD의 쥐 모델에서 만성 폐 병리학을 정량화하는 자동화된 방법을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜에는 생쥐를 담배 연기(CS)에 노출시키고, 폐 기능을 측정하고, 폐를 팽창시키고, 형태 측정 방법을 사용하여 생쥐의 폐기종 및 소기도 재형성을 측정하는 것이 포함됩니다.

담배 연기에 노출 된 마우스의 폐 폐기종 및 작은기도 리모델링 자동 측정

이 프로토콜의 목적은 인체 유기형 3D 기관지 및 코 조직 모델을 공기-액체 계면에서 주류 담배 연기(CS)에 노출시키는 것입니다. 그런 다음 시토크롬 P450 활성 분석, 섬모 박동 측정 및 시스템 생물학 접근 방식을 사용하여 CS가 조직에 미치는 영향을 조사합니다.

전체 담배 연기에의 Organotypic 3D 기관지와 코 조직 문화 모델의 반복 노출의 영향 평가

최적화된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 생체 외 분석을 사용하여 가연성 담배 제품 제제가 수용체 매개 세포 내 분비 사이토카인과 효과기 PBMC의 세포 용해 능력을 현저하게 억제하는 것으로 나타났습니다. 이러한 신속한 분석은 제품 평가 및 담배 노출의 잠재적인 장기 영향을 이해하는 데 유용할 수 있습니다.

방법은 가연성 담배 제품 준비의 세포 독성 및 면역 억제를 평가하기

숙주-병원체 상호 작용에 대한 체외 연구는 특정 면역 반응의 특성을 규명할 수 있지만 복잡한 반응의 영향을 관찰하려면 생체 내 모델이 필요합니다. 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 노출 후 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 매개 폐 감염을 사용하여 인공호흡기 관련 폐렴 병원성과 관련된 미생물 상호 작용에 대한 쥐 모델을 확립했습니다.

미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

여기에 제시된 폐 고정을 위한 유용한 프로토콜은 기종의 마우스 모델에서 폐 견본의 조직학적 평가를 위한 안정한 조건을 만드는. 이 모델의 주요 장점은 폐 붕괴 또는 디플레이션없이 동일한 일정한 압력으로 많은 폐를 고정 할 수 있다는 것입니다.

마우스에 있는 기종의 평가를 위한 일정한 압력의 밑에 폐 고정

이 프로토콜은 사내에서 지어진 전신 흡입(WBI) 노출 시스템(WBI)을 통해 담배 연기(CS)의 병리학적 효과에 대한 연구를 보여줍니다. 이 시스템은 폐 기종및 혈청증에 대한 CS 중재 효과의 연구를 위한 통제된 반복조건하에서 CS에 동물을 노출할 수 있습니다.

전신 흡입 시스템을 사용하여 쥐의 담배 연기 노출

여기에 제시된 것은 장기 바이오뱅킹을 위한 원발성 기관지 상피 세포의 분리 및 확장과 공기-액체 계면에서 배양에 의한 분화된 상피 세포의 생성을 위한 재현 가능하고 저렴하며 강력한 방법입니다.

바이오뱅킹을 위해 절제된 폐 조직에서 기관지 상피 세포를 분리하고 잘 분화된 공기-액체 계면 배양을 확립합니다.

여기에서는 만성 담배 연기 추출물(CSE)에 대한 적응에 초점을 맞춘 쥐 기도 상피 세포를 분리하고 분화하기 위한 시험관 내 모델을 설명합니다. 이 모델은 CSE의 다중 오믹스 영향을 종합적으로 특성화하는 데 활용될 수 있으며, 이는 만성 연기 노출 시 세포 반응에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

담배 연기 추출물로 자극된 쥐 기도 상피 세포에서 다중-오믹스의 분화 및 변화를 연구하기 위한 시험관 내 모델

배우세요 폐 상피 세포에서 담배 연기 추출물이 Pseudomonas 세균 감염에 미치는 영향을 분석하는 방법을. 이 프로토콜은 세균 부하 측정과 세포 배양 기술을 포함하며 호흡기 건강 연구에 활용됩니다.

폐 상피 세포에 있는 슈도모나스 감염에 담배 연기의 효력 공부

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