Name: 면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 배우세요 중추신경계 조직 및 수막에서 면역 세포를 신속하게 분리하는 최적화된 프로토콜을 사용하여 단일 세포 기법과 조직학적 방법으로 면역 세포 표현형, 기능 및 국소화를 종합적으로 분석하는 방법을.

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저자들은 다트머스 (Dartmouth)의 비교 의학 및 연구 센터 (CCMR) 직원들에게이 연구에 사용 된 마우스에 대한 전문적인 관리에 감사드립니다. Bornstein Research Fund가이 연구에 자금을 지원했습니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

항상성 및 질환 동안 CNS 구획 내의 세포 조성을 평가하기 위한 방법은 CNS의 생리학적 및 병리학적 상태를 이해하는데 필수적이다. 그러나 CNS에서 중요한 장벽 역할을 하고 다양한 면역 세포를 수용함에도 불구하고 뇌와 척수에 대한 기존의 많은 조직 추출 방법이 이러한 막의 수집을 허용하지 않기 때문에 수막은 종종 분석에서 생략됩니다. 이러한 누락은 수막의 세포 구성과 기능, 정상 상태 및 염증 상태에서의 역할에 대한 이해를 높이는 데 중요한 한계입니다. 최근 연구에 따르면 수막 구획에 상주하는 상주 및 말초 유래 면역 세포는 모두 CNS의 항상성을 유지하고 CNS 질병 발병을 유도하는 데 필수적인 역할을 합니다. 이 연구는 실질 구획뿐만 아니라 주변 수막층을 분석 할 필요성을 강조합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 수막을 보존하면서 뇌와 척수를 신속하게 분리할 수 있도록 하여 궁극적으로 조직학적 연구와 단일 세포 연구를 모두 활용하여 CNS 구획의 포괄적인 다운스트림 분석을 가능하게 합니다. 대표적인 결과는 CNS 구획의 면역...

중추신경계(CNS)는 면역학적으로 특화된 부위입니다. 중추신경계 실질은 뇌척수액 공간, 수막 및 혈관계를 제외하고, 고전적으로 면역-특권 부위 1,2,3,4,5로 간주되며, 항상성 상태 동안 면역 세포가 상대적으로 없다 2,6,7. 대조적으로, 경막층, 거미층, 피아층으로 구성된 수막은 중추신경계 구획의 중요한 구성 요소로, 질병 발병기전동안 항상성 면역 감시 및 염증 과정에 적극적으로 참여합니다 3,6,7,8. 정상 상태 조건에서 수막은 선천성 림프 세포(ILC), 대식세포, 수지상 세포(DC), 비만 세포, T 세포 및 그보다 덜하지만 B 세포를 포함한 수많은 면역 감시 세포를 지원합니다 9,10,11.
수막은 고도로 혈관화된 구조이며 CNS와 그 주변 사이에 림프 연결을 제공하는 림프관을 포함합니다 8,12,13,14. CNS 손상, 감염, 자가면역 또는 신경변성에 의해 유발된 염증성 상태에서 말초 유래 면역 세포가 실질에 침투하여 수막 내의 면역 환경을 변경합니다. 세포 침윤 후, 수막은 말초 유래 면역 세포에 대한 기능적 틈새를 나타낼 수 있으며, 면역 세포 응집, 국소 면역 세포 활성화 및 CNS 구획에서의 장기 생존을 촉진할 수 있습니다. 두드러진 수막 염증은 다발성 경화증 (MS) 15,16,17,18,19, 뇌졸중 20,21, 무균 손상 22,23 (즉, 척수 손상 및 외상성 뇌 손상), 편두통 24 및 미생물 감염 25,26,27,28,29. 따라서, 수막 구획에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 특성화는 정상 상태 및 질병 발병 기전 동안 이러한 세포의 역할을 이해하는 데 필수적입니다.
두개골과 척추체에서 뇌, 척수 및 수막을 추출하는 것은 기술적으로 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 현재 세 개의 수막층이 모두 손상되지 않은 상태에서 뇌를 빠르게 추출할 수 있는 기술은 없습니다. 추궁 절제술은 우수한 척수 조직 형태를 산출하고 수막층을 보존하지만 시간이 많이 걸리고 복잡합니다30,31. 반대로, 두개골에서 뇌를 제거하고 척수를 수압 압출하는 것과 같은 보다 전통적인 추출 방법은 CNS 조직의 빠른 추출을 용이하게 하지만 이러한 기술로 거미주막과 경막 수막이 모두 손실됩니다(30,31). 뇌 및 척수 조직의 기존 분리 동안 경막 및 지주막 층의 누락은 CNS 구획 내의 세포에 대한 불완전한 분석을 초래합니다. 따라서 수막이 손상되지 않은 CNS 조직의 빠른 추출에 초점을 맞춘 새로운 기술의 식별은 CNS 구획의 최적 분석에 매우 중요합니다.
이 원고는 생쥐에서 뇌, 척수 및 수막을 신속하게 추출하는 두 가지 방법을 제시하여 CNS 실질 및 수막에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 다운스트림 분석을 용이하게 합니다. 이러한 최적화된 프로토콜은 1) 다운스트림 분석을 위한 단일 세포 현탁액 분리 및 2) 조직학적 처리를 위한 조직 준비에 중점을 둡니다. 뇌, 척수 조직, 경막 및 지주막 수막(32)으로부터 단세포 현탁액을 얻는 것은 실질 및 수막 구획 둘 다에 상주하는 세포의 동시 분석을 가능하게 한다. 단일 세포 현탁액은 시험관 내 자극 33, 효소 결합 면역스팟(ELISpot)28,34,35, 유세포 분석(36,33) 및 단일 세포 37 또는 벌크 전사체학을 수행하기 위한 세포 배양 분석을 포함한 다양한 응용 분야에서 사용할 수 있습니다. 또한, 두개골 또는 척추가 각각 손상되지 않은 전체 뇌 및 척수의 석회질 제거를 위해 최적화된 프로토콜은 주변 뼈의 부드러운 석회화를 허용하여 수막을 온전하게 유지하고 조직 형태를 보존합니다. 이 방법을 사용하면 실질 및 수막 공간 모두에서 면역조직화학(IHC) 또는 제자리 혼성화(ISH) 기술을 사용하여 단백질 또는 RNA를 선택적으로 식별할 수 있습니다. CNS 내에서 상주 세포 및 말초 유래 면역 세포의 표현형, 활성화 상태 및 국소화의 특성화는 CNS 구획의 개별 세포 유형이 항상성 및 질병 발병기전에 어떻게 기여하는지 이해하는 데 필수적인 정보를 제공할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>알루미늄 호일</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>37002D</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-12R 원심분리기</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 I</td><td>Worthington</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브, 15mL</td><td>VWR</td><td>525-1069</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브, 50mL</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>Hauser Scientific</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Cryomold</td><td>VWR</td><td>18000-128</td><td></td></tr><tr><td>곡선 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11003-14</td><td></td></tr><tr><td>일회용 폴리스티렌 튜브, 14 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-1B</td><td></td></tr><tr><td>일회용 메스</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0595256</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington</td><td>LS002139</td><td></td></tr><tr><td>드라이 아이스</td><td>에어 가스</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>Durmont #7Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 디 소듐 염 이수화</td><td>물 Amresco</td><td>0105-500g</td><td></td></tr><tr><td>에탄올, 100 %</td><td></td> <td>없음 / A</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td> <td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>필터 상단 튜브, 5 mL</td><td>VWR</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>정착 가능한 생존력 염색 780</td><td>Becton Dickinson</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-마우스 IgG (488 접합체)</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>115-546-146</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-마우스 IgG (594 conjugate)</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>115-586-146</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit 488</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rat 594</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>112-585-167</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-rat 650</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balnced Salt Solution (HBSS)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hemacometer</td><td>Andwin Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>13004-14</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher chemical</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 (무수)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655-100G</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>에어 가스</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>마우스 FC 블록 (CD16/32)</td><td>Becton Dickinson</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Na2HP04 (무수)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S374-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher chemical</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Needle, 25 게이지</td><td>Becton Dickinson</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Normal mouse serum</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31881</td><td></td></tr><tr><td>나일론 메쉬 스트레이너</td><td>VWR</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>OCT</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드, 20%</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td> 1 x PBS 파스퇴르 피펫을 <td>사용하여 4%로 희석</td></tr><tr><td>, 9인치, 언플러그</td>드 <td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>PE 쥐 안티 마우스 CD4</td><td>Becton Dickinson</td><td>553730</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 쥐 안티 마우스 CD19</td><td>Becton Dickinson</td><td>562329</td><td></td></tr><tr><td>Percoll 밀도 구배 매체</td><td>GE 헬스케어</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 쥐 안티 마우스 CD45</td><td>Becton Dickinson</td><td>550994</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 100mm</td><td>VWR</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-636-AB150</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid</td><td>Drummond Scientific Corporation</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>Pipette 200 &micro; l</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 1 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1111-2831</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 200 &마이크로; l</td><td>USA Scientific</td><td>1111-1816</td><td></td></tr><tr><td>피펫, 1mL</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>정제 쥐 안티 마우스 CD16/CD32</td><td>Becton Dickinson</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit 안티 마우스 CD3 (SP7 클론)</td><td>Abcam</td><td>ab16669</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티 마우스 라미닌</td><td>Abcam</td><td>ab11575</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 ERT-R7</td><td>Abcam</td><td>ab51824</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫, 1mL</td><td>VWR</td><td>357521</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫, 10mL</td><td>VWR</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫, 5mL</td><td>VWR</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>수산화</td><td>나트륨Fisher Scientific</td><td>S318-100</td><td></td></tr><tr><td>설탕</td><td>Fisher 화학</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>14001-16</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위, 극세</td><td>Roboz</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 10mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>주사기, 5mL</td><td>Becton Dickinson</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>진공 필터 시스템</td><td>Millipore</td><td>20207749</td><td></td></tr><tr><td>진공 플라스크</td><td>Thomas Scientific</td><td>5340-2L</td><td></td></tr><tr><td>진공 인라인 필터</td><td>Pall Corporation</td><td>4402</td><td></td></tr><tr><td>진공 라인</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-06414-20</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Versa 목욕</td><td></td></tr></tbody></table>

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells

중추신경계(CNS)는 뇌와 척수로 구성되어 있으며 말초와 중추신경계 사이의 장벽 역할을 하는 막층인 수막으로 둘러싸여 있습니다. CNS는 면역학적으로 특화된 부위이며, 정상 상태 조건에서 면역 특권은 CNS 실질에서 가장 분명합니다. 대조적으로, 수막에는 선천성 및 적응 면역 세포를 포함한 다양한 상주 세포가 있습니다. CNS 손상, 자가면역, 감염 또는 신경변성에 의해 유발되는 염증 상태에서 말초 유래 면역 세포가 실질에 들어가 수막 내에 거주할 수 있습니다. 이 세포는 CNS 질병 발병 기간 동안 유익한 작용과 해로운 작용을 모두 수행하는 것으로 생각됩니다. 이러한 지식에도 불구하고, 수막은 종종 CNS 구획을 분석할 때 간과되는데, 이는 종래의 CNS 조직 추출 방법이 수막층을 생략하기 때문이다. 이 프로토콜은 단일 세포 기술, 면역조직화학 및 현장 혼성화 방법을 통한 다운스트림 분석에 적합한 쥐 CNS 조직(즉, 뇌, 척수 및 수막)의 신속한 분리를 위한 두 가지 고유한 방법을 제시합니다. 설명된 방법은 항상성 조건 및 질병 발병 기전 동안 CNS 구획을 차지하는 세포의 표현형, 기능 및 국소화를 평가하는 데 이상적인 CNS 조직의 포괄적인 분석을 제공합니다.

이 대표적인 실험은 B 및 T 세포를 정량화하고 항상성 상태뿐만 아니라 쥐 진행성 MS 모델(즉, TMEV-IDD)에서 수막 및 실질 CNS 구획에서 B 및 T 세포 국소화를 설명하는 것을 목표로 했습니다. TMEV-IDD는 앞서 기술된 바와 같이 TMEV BeAn의 5 x 106 플라크 형성 단위 (PFU)에 의한 두개내 감염에 의해 5주령 암컷 SJL 마우스에서 유도되었다(29).
본 연구는 감염 후 120일째에 만성 TMEV-IDD 동안 수막, 뇌 및 척수의 B 및 T 세포를 평가했습니다. 연령 일치 가짜 처리 마우스를 대조군으로 사용했습니다. 이 연구는 두 가지 실험으로 구성되었습니다. 첫 번째는 세포 표면 및/또는 세포내 항원(n = 4 가짜 처리, n = 5 TMEV-IDD)을 평가하여 세포 구성을 분석하고 정량화하는 잘 확립된 기술인 유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁액을 얻는 데 중점을 두었습니다. 두 ...

이 논문은 뇌, 척수 및 수막을 포함한 중추 신경계 내에서 상주 및 말초 유래 면역 세포를 검사하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 프로토콜은 정상 상태 및 염증 조건에서 이러한 구획을 차지하는 세포의 기능과 구성을 확인하는 데 도움이 됩니다.

The central nervous system (CNS) is comprised of the brain and spinal cord and is enveloped by the meninges, membranous layers serving as a barrier ...

수막을 포함한 CNS 조직의 신속한 분리를 통해 항상성 및 병원성 조건에서 면역 세포 표현형, 기능 및 국소화를 종합적으로 분석할 수 있습니다. 입증된 두 가지 방법을 통해 수막이 있는 CNS 조직을 빠르게 추출할 수 있으며, 이는 단일 세포 기술과 조직학적 방법을 사용한 다운스트림 분석에 이상적입니다. 대표적인 결과는 면역 세포 분석에 중점을 두고 있지만, 이 두 가지 방법은 미세아교세포, 성상세포, 주피세포, 내피 세포, 기질 세포 및 뉴런을 포함한 CNS 상주 세포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.먼저 안락사된 쥐에서 뇌와 척수 샘플을 분리합니다. 머리를 제거한 후 피부의 정중선을 절개하여 눈 위로 넘기면 두개골이 풀립니다. 코뼈를 잘라 두개골에서 하악골을 분리합니다.그런 다음 하악골, 혀, 눈을 제거합니다. 두개골의 측면을 따라 잘라 외이도를 따라 조직을 분리하고 다듬습니다. 척수 샘플을 채취하려면 날카로운 가위로 척추와 평행하게 절단하여 흉곽과 척추를 분리합니다.척추를 분리하기 위해 요추 아래쪽을 작게 절개한 다음 척추를 따라 남아 있는 근육을 다듬고 제거하여 척추를 드러냅니다. 석회질 제거를 수행할 때는 뼈가 부드럽고 유연한지 매일 확인하십시오. 집게로 EDTA 용액에서 조직을 제거하고 페트리 접시에 놓고 25게이지 바늘로 뼈의 부드러움을 부드럽게 테스트합니다.바늘이 뼈를 쉽게 관통하면 석회질 제거 과정이 완료된 것입니다. 뇌의 두개골 뚜껑을 적출하려면 피부의 정중선을 절개하고 눈 위의 피부를 뒤집습니다. 가위를 마그나 구멍 안에 놓고 피질을 따라 후각구를 향해 측면으로 두개골을 절단하기 시작하며, 절개 부위를 외이도 고기와 하악골 위로 유지합니다.뇌에서 두개골 뚜껑을 분리하기 위해 후각구에서 만나는 상처와 반대쪽도 동일한 절단을 수행합니다. 겸자를 사용하여 두개골 캡을 벗겨내고 25밀리몰 HEPES가 보충된 5밀리리터의 차가운 RPMI 배지가 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 뇌 기저부 아래에 구부러진 집게를 놓고 들어 올려 두개골 뚜껑에서 뇌를 해방시킵니다.척추와 평행하게 절단하여 척추와 척수 조직을 추출하여 흉곽과 척추를 분리합니다. 그런 다음 척추 기둥을 분리하기 위해 요추 아래쪽 부위를 작게 절개합니다. 척추를 따라 남아 있는 근육을 다듬고 제거하여 척추를 드러냅니다.다음으로, 극세한 수술용 가위를 척추 안에 놓고 척추의 측면 가장자리를 따라 자릅니다. 반대쪽 측면 가장자리를 완전히 잘라 척추를 앞쪽과 뒤쪽으로 나눕니다. 겸자를 사용하여 척추에서 척수를 천천히 조심스럽게 떼어내고 25밀리몰 HEPES가 함유된 5밀리리터의 차가운 RPMI가 들어 있는 15ml 원추형 튜브에 넣습니다.그런 다음 척추의 전방 및 후방 부분을 다른 튜브로 옮깁니다. 두개골 캡에서 수막을 제거하려면 RPMI 매체에서 두개골 캡을 꺼내고 날카로운 집게를 사용하여 바깥쪽 가장자리 주위를 긁습니다. 두개골 뚜껑 가장자리에서 수막을 벗겨내고 긁어내어 경막과 지주막 수막을 제거하고 페트리 접시에 수막을 놓습니다.척추에서 수막을 제거하려면 배지에서 기둥을 제거하고 날카로운 집게로 척추 가장자리 주위를 긁어 수막을 제거합니다. 구부러진 집게를 사용하여 척추 가장자리에서 수막을 벗겨내고 페트리 접시에 수막을 놓습니다. 나일론 메쉬 스트레이너를 50ml 원뿔형 튜브에 넣습니다.세포 현탁액을 만들려면 수막을 스트레이너로 옮기고 3ml의 HEPES 보충 RPMI를 첨가한 다음 5ml 주사기의 플런저를 사용하여 스트레이너를 통해 조직과 매체를 분쇄합니다. 미디어와 함께 뇌 또는 척수 조직을 100mm 페트리 접시에 붓고 집게를 사용하여 조직을 바닥으로 이동합니다. 멸균 면도날로 뇌 조직을 다지고 접시 바닥에 조직을 모읍니다.10%FCS가 보충된 RPMI 3ml를 페트리 접시에 첨가한 다음 10ml 혈청학 피펫을 사용하여 배지의 조직을 재현탁하고 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 조직에 콜라겐분해효소 1형과 DNase 1을 추가하고 섭씨 37도의 수조에서 40분 동안 튜브를 배양합니다. 15분마다 튜브를 뒤집어 조직을 효소와 완전히 혼합합니다.배양 후 각 튜브에 EDTA를 추가하여 최종 농도 0.01 몰을 만들고 추가로 5분 동안 튜브를 배양하여 콜라겐분해효소를 비활성화합니다. 각 튜브에 10%FCS가 보충된 RPMI 9ml를 첨가한 다음 450G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 진공 청소기와 함께 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 흡인하고 세포 펠릿을 만지지 않도록 주의하십시오.세포 펠릿에 3ml의 100% 스톡 등장성 밀도 구배 용액을 추가한 다음 RPMI 10%FCS 매체를 추가하여 최종 부피를 10ml로 만들고 세포 펠릿을 재현탁합니다. 튜브를 잘 뒤집고 혼합한 다음 1ml의 70% 스톡 등장 밀도 구배 용액이 포함된 혈청학 피펫을 튜브 바닥에 삽입합니다. 거품이 생기지 않도록 주의하면서 용액을 천천히 밑에 깔아줍니다.튜브에서 혈청학적 피펫을 제거하고 구배를 방해하지 않도록 합니다. 튜브를 800G에서 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리한 다음 튜브에 2-3밀리리터가 남을 때까지 미엘린 파편층을 포함한 상층액을 흡인합니다. 1mL 피펫을 사용하여 30%와 70% 밀도 구배 사이의 세포층을 채취하고 이를 새로운 15ml 튜브로 옮깁니다.RPMI 10%FCS 매체를 추가하여 최종 부피를 15ml로 만든 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 450G에서 셀을 원심분리합니다. 이 프로토콜은 진행성 다발성 경화증 동안 수막, 뇌 및 척수에 있는 B 및 T 세포를 평가하는 데 사용되었습니다. 게이팅은 CD45 저 미세아교세포 및 CD45 음성 뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포로부터 CD45 고말초적으로 유래한 침투 면역 세포를 구별하기 위해 수행되었습니다.CD45 높은 세포는 가짜 처리된 쥐의 척수와 뇌 조직에 거의 존재하지 않았습니다. CD45 높은 발현에 대한 동일한 게이팅 컷오프를 수막에 사용하여 CD45 고면역 세포를 식별하고 비면역 세포를 배제했습니다. 모든 TMEV-IDD CNS 조직에서 가짜 처리된 마우스에 비해 CD45 고면역 세포의 증가된 비율이 관찰되었습니다.만성 TMEV-IDD 기간 동안 뇌와 척수에 있는 CD45 고면역 세포 중 B 세포의 비율은 수막 구획에 비해 높았습니다. 석회질이 제거된 뇌와 척수를 이미지화하여 CNS 구획 내에서 B 세포와 T 세포의 국소화를 확인했습니다. 기존의 두개골 모자에서 뇌를 추출한 결과 온전한 pia 층이 생성되었지만 나머지 수막층은 제외되었습니다.석회질화된 뇌와 척수 모두에서 모든 수막층이 손상되지 않았습니다. Isotype이 전환된 B 세포와 T 세포는 각각 IgG 및 CD3 발현으로 국소화되었습니다. IgG와 ER-TR7을 함께 사용하면 B 세포가 CNS 실질과 수막에 존재하는 것으로 밝혀졌으며, ER-TR7 양성 수막 내의 세포 응집체에는 여러 개의 IgG 양성 B 세포와 CD3 양성 T 세포가 포함되어 있습니다.이러한 프로토콜에서 중요한 단계는 단일 세포 현탁액의 순도를 개선하고 고품질 형태를 가진 조직학 조직을 얻는 데 필수적인 CNS 조직을 신중하게 추출하는 것입니다. 설명된 기술을 통해 CNS 구획을 차지하는 세포를 종합적으로 분석할 수 있으며, 이는 항상성 및 질병 발병 중 세포 표현형, 기능 및 국소화를 검사하는 데 이상적입니다.

isolating-central-nervous-system-tissues-associated-meninges-for

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 실험자가 면역 질환 encephalomyelitis와 쥐의 중추 신경계에서 mononuclear 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

EAE와 쥐의 중추 신경계에서 Mononuclear 세포의 분리

현재 문서는 효율적으로 효과적으로 흐름 cytometric 분석을 위해 활용할 수 뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

이 비디오는 쥐의 뇌 조직에서 면역 세포의 단세포 현탁액을 준비하는 방법을 보여줍니다. 여기에는 뇌 조직에서 세포를 분리하기 위한 효소 소화와 밀도 구배 원심분리를 포함하여 밀도에 따라 면역 세포를 분리하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.

쥐 뇌 조직에서 면역 세포의 단세포 현탁액 준비

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

이 프로토콜의 목표는 lissencephalic 및 gyrencephalic 척추동물의 중추 신경계의 여러 영역에서 미세 혈관을 분리하는 것입니다.

5개의 척추동물 단에 걸쳐 중추 신경계 마이크로혈관의 믿을 수 있는 격리

우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

여기에서는 마우스 CNS로부터 다중 신경교 세포 집단의 시험관 내 분리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 국소 미세아교세포, 희소돌기아교세포 전구체 세포 및 성상세포를 분리하여 다양한 배양 시스템에서 각각의 표현형을 연구할 수 있습니다.

여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리

이 연구는 분리 된 관류 된 마우스 뇌 맥락막 신경총에 대한 유세포 측정과 두 가지 게이팅 전략을 사용합니다. 이 프로토콜은이 뇌 구조를 채우는 주요 면역 세포 하위 집합을 식별합니다.

미세 해부된 마우스 맥락막 신경총으로부터 면역 세포의 분리 및 특성화

현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

뇌 질환에 대한 면역 반응을 조사하기 위한 한 가지 일반적인 접근법은 면역 세포의 변화를 분석하는 것입니다. 여기에서는 쥐 뇌 조직과 두개골 골수에서 면역 세포를 분리하기 위한 두 가지 간단하고 효과적인 프로토콜이 제공됩니다.

생쥐의 뇌와 두개골에서 면역 세포 분리

배우세요 중추신경계 조직 및 수막에서 면역 세포를 신속하게 분리하는 최적화된 프로토콜을 사용하여 단일 세포 기법과 조직학적 방법으로 면역 세포 표현형, 기능 및 국소화를 종합적으로 분석하는 방법을.

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

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