면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

수막을 포함한 CNS 조직의 신속한 분리를 통해 항상성 및 병원성 조건에서 면역 세포 표현형, 기능 및 국소화를 종합적으로 분석할 수 있습니다. 입증된 두 가지 방법을 통해 수막이 있는 CNS 조직을 빠르게 추출할 수 있으며, 이는 단일 세포 기술과 조직학적 방법을 사용한 다운스트림 분석에 이상적입니다. 대표적인 결과는 면역 세포 분석에 중점을 두고 있지만, 이 두 가지 방법은 미세아교세포, 성상세포, 주피세포, 내피 세포, 기질 세포 및 뉴런을 포함한 CNS 상주 세포를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

먼저 안락사된 쥐에서 뇌와 척수 샘플을 분리합니다. 머리를 제거한 후 피부의 정중선을 절개하여 눈 위로 넘기면 두개골이 풀립니다. 코뼈를 잘라 두개골에서 하악골을 분리합니다.

그런 다음 하악골, 혀, 눈을 제거합니다. 두개골의 측면을 따라 잘라 외이도를 따라 조직을 분리하고 다듬습니다. 척수 샘플을 채취하려면 날카로운 가위로 척추와 평행하게 절단하여 흉곽과 척추를 분리합니다.

척추를 분리하기 위해 요추 아래쪽을 작게 절개한 다음 척추를 따라 남아 있는 근육을 다듬고 제거하여 척추를 드러냅니다. 석회질 제거를 수행할 때는 뼈가 부드럽고 유연한지 매일 확인하십시오. 집게로 EDTA 용액에서 조직을 제거하고 페트리 접시에 놓고 25게이지 바늘로 뼈의 부드러움을 부드럽게 테스트합니다.

바늘이 뼈를 쉽게 관통하면 석회질 제거 과정이 완료된 것입니다. 뇌의 두개골 뚜껑을 적출하려면 피부의 정중선을 절개하고 눈 위의 피부를 뒤집습니다. 가위를 마그나 구멍 안에 놓고 피질을 따라 후각구를 향해 측면으로 두개골을 절단하기 시작하며, 절개 부위를 외이도 고기와 하악골 위로 유지합니다.

뇌에서 두개골 뚜껑을 분리하기 위해 후각구에서 만나는 상처와 반대쪽도 동일한 절단을 수행합니다. 겸자를 사용하여 두개골 캡을 벗겨내고 25밀리몰 HEPES가 보충된 5밀리리터의 차가운 RPMI 배지가 들어 있는 15ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 뇌 기저부 아래에 구부러진 집게를 놓고 들어 올려 두개골 뚜껑에서 뇌를 해방시킵니다.

척추와 평행하게 절단하여 척추와 척수 조직을 추출하여 흉곽과 척추를 분리합니다. 그런 다음 척추 기둥을 분리하기 위해 요추 아래쪽 부위를 작게 절개합니다. 척추를 따라 남아 있는 근육을 다듬고 제거하여 척추를 드러냅니다.

다음으로, 극세한 수술용 가위를 척추 안에 놓고 척추의 측면 가장자리를 따라 자릅니다. 반대쪽 측면 가장자리를 완전히 잘라 척추를 앞쪽과 뒤쪽으로 나눕니다. 겸자를 사용하여 척추에서 척수를 천천히 조심스럽게 떼어내고 25밀리몰 HEPES가 함유된 5밀리리터의 차가운 RPMI가 들어 있는 15ml 원추형 튜브에 넣습니다.

그런 다음 척추의 전방 및 후방 부분을 다른 튜브로 옮깁니다. 두개골 캡에서 수막을 제거하려면 RPMI 매체에서 두개골 캡을 꺼내고 날카로운 집게를 사용하여 바깥쪽 가장자리 주위를 긁습니다. 두개골 뚜껑 가장자리에서 수막을 벗겨내고 긁어내어 경막과 지주막 수막을 제거하고 페트리 접시에 수막을 놓습니다.

척추에서 수막을 제거하려면 배지에서 기둥을 제거하고 날카로운 집게로 척추 가장자리 주위를 긁어 수막을 제거합니다. 구부러진 집게를 사용하여 척추 가장자리에서 수막을 벗겨내고 페트리 접시에 수막을 놓습니다. 나일론 메쉬 스트레이너를 50ml 원뿔형 튜브에 넣습니다.

세포 현탁액을 만들려면 수막을 스트레이너로 옮기고 3ml의 HEPES 보충 RPMI를 첨가한 다음 5ml 주사기의 플런저를 사용하여 스트레이너를 통해 조직과 매체를 분쇄합니다. 미디어와 함께 뇌 또는 척수 조직을 100mm 페트리 접시에 붓고 집게를 사용하여 조직을 바닥으로 이동합니다. 멸균 면도날로 뇌 조직을 다지고 접시 바닥에 조직을 모읍니다.

10%FCS가 보충된 RPMI 3ml를 페트리 접시에 첨가한 다음 10ml 혈청학 피펫을 사용하여 배지의 조직을 재현탁하고 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 조직에 콜라겐분해효소 1형과 DNase 1을 추가하고 섭씨 37도의 수조에서 40분 동안 튜브를 배양합니다. 15분마다 튜브를 뒤집어 조직을 효소와 완전히 혼합합니다.

배양 후 각 튜브에 EDTA를 추가하여 최종 농도 0.01 몰을 만들고 추가로 5분 동안 튜브를 배양하여 콜라겐분해효소를 비활성화합니다. 각 튜브에 10%FCS가 보충된 RPMI 9ml를 첨가한 다음 450G에서 섭씨 4도에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 진공 청소기와 함께 파스퇴르 피펫을 사용하여 상층액을 흡인하고 세포 펠릿을 만지지 않도록 주의하십시오.

세포 펠릿에 3ml의 100% 스톡 등장성 밀도 구배 용액을 추가한 다음 RPMI 10%FCS 매체를 추가하여 최종 부피를 10ml로 만들고 세포 펠릿을 재현탁합니다. 튜브를 잘 뒤집고 혼합한 다음 1ml의 70% 스톡 등장 밀도 구배 용액이 포함된 혈청학 피펫을 튜브 바닥에 삽입합니다. 거품이 생기지 않도록 주의하면서 용액을 천천히 밑에 깔아줍니다.

튜브에서 혈청학적 피펫을 제거하고 구배를 방해하지 않도록 합니다. 튜브를 800G에서 섭씨 4도에서 30분 동안 원심분리한 다음 튜브에 2-3밀리리터가 남을 때까지 미엘린 파편층을 포함한 상층액을 흡인합니다. 1mL 피펫을 사용하여 30%와 70% 밀도 구배 사이의 세포층을 채취하고 이를 새로운 15ml 튜브로 옮깁니다.

RPMI 10%FCS 매체를 추가하여 최종 부피를 15ml로 만든 다음 섭씨 4도에서 5분 동안 450G에서 셀을 원심분리합니다. 이 프로토콜은 진행성 다발성 경화증 동안 수막, 뇌 및 척수에 있는 B 및 T 세포를 평가하는 데 사용되었습니다. 게이팅은 CD45 저 미세아교세포 및 CD45 음성 뉴런, 성상세포 및 희소돌기아교세포로부터 CD45 고말초적으로 유래한 침투 면역 세포를 구별하기 위해 수행되었습니다.

CD45 높은 세포는 가짜 처리된 쥐의 척수와 뇌 조직에 거의 존재하지 않았습니다. CD45 높은 발현에 대한 동일한 게이팅 컷오프를 수막에 사용하여 CD45 고면역 세포를 식별하고 비면역 세포를 배제했습니다. 모든 TMEV-IDD CNS 조직에서 가짜 처리된 마우스에 비해 CD45 고면역 세포의 증가된 비율이 관찰되었습니다.

만성 TMEV-IDD 기간 동안 뇌와 척수에 있는 CD45 고면역 세포 중 B 세포의 비율은 수막 구획에 비해 높았습니다. 석회질이 제거된 뇌와 척수를 이미지화하여 CNS 구획 내에서 B 세포와 T 세포의 국소화를 확인했습니다. 기존의 두개골 모자에서 뇌를 추출한 결과 온전한 pia 층이 생성되었지만 나머지 수막층은 제외되었습니다.

석회질화된 뇌와 척수 모두에서 모든 수막층이 손상되지 않았습니다. Isotype이 전환된 B 세포와 T 세포는 각각 IgG 및 CD3 발현으로 국소화되었습니다. IgG와 ER-TR7을 함께 사용하면 B 세포가 CNS 실질과 수막에 존재하는 것으로 밝혀졌으며, ER-TR7 양성 수막 내의 세포 응집체에는 여러 개의 IgG 양성 B 세포와 CD3 양성 T 세포가 포함되어 있습니다.

이러한 프로토콜에서 중요한 단계는 단일 세포 현탁액의 순도를 개선하고 고품질 형태를 가진 조직학 조직을 얻는 데 필수적인 CNS 조직을 신중하게 추출하는 것입니다. 설명된 기술을 통해 CNS 구획을 차지하는 세포를 종합적으로 분석할 수 있으며, 이는 항상성 및 질병 발병 중 세포 표현형, 기능 및 국소화를 검사하는 데 이상적입니다.