Name: 카노르하비티스 예르간에서 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: 배우세요 노화 관련 신경 퇴행성 질환을 연구하는 방법을 Caenorhabditis elegans 모델을 활용하여. 과활성화 이온 채널 유도 괴사와 단백질 응집체 유발 신경독성 기법을 통해 신경 퇴행의 세포 분자 메커니즘을 분석합니다.

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비디오 녹화 및 편집에 대한 차니오타키스 M. 및 쿠나키스 K. 감사드립니다. K.P.는 그리스 연구 혁신 재단(HFRI)과 연구 기술 총무사(GSRT)의 보조금으로 지원받고 있습니다. N.T.는 유럽 연구 위원회 (ERC – GA695190 – MANNA), 유럽 위원회 프레임 워크 프로그램 및 그리스 교육부의 보조금으로 지원됩니다.

1. 음과 이온 채널에 의해 유도 된 괴사 세포 죽음
참고: 메크-4 및 deg-3을 포함한 degenerins유전자 패밀리의 기능성 돌연변이는 웜3에서메카노센션에 필요한 6개의 터치 수용체 뉴런의 괴사 세포 사멸을 유발하는 활동적인 이온 채널의 생성을 초래한다. 괴사는 degenerins의 비정상적인 자극에 의해 유도된 포유류에 있는 흥분 독성에 몇몇 기계론및 형태학적 유사성을 표시합니다. 에너지 대사와 칼슘 항상성의 유지는 괴사11동안 신경 생존에 중요한 역할을한다. 다음 균주는 활동적인 이온 채널, mec-4 (u231)X 및 deg-3 (u662)V에의해 유발되는 괴사 세포 죽음을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
<ol><li>괴사 세포 죽음의 검사를 위한 돌연변이 벌레의 유지, 동기화 및 준비<ol>
<li>1일차: 메크-4(u231) 또는 deg-3(u662) 돌연변이 선충을 선충선에 선택(NGM; 표 1) 해부 스테레오현미경을 사용하여 에체리치아 대장균(OP50)으로 시드된 플레이트.</li>
		<li>시드 NGM 플레이트 당 10 L4 선충을 놓고 20 °C의 표준 온도에서 성장하십시오.</li>
		<li>5일차: M9 완충(표1)의1mL로 판을 씻고 1.5mL 튜브로 동물을 채운다.</li>
		<li>30s용 10,000 x g의 원심분리기와 상부체제거.</li>
		<li>표백 용액 0.5mL(H2O7mL, 5N NaOH 1mL, 표백제 2mL)를 추가합니다. 참고: 표백 용액은 점차 효율성을 잃게 됩니다. 따라서 매일 준비해야합니다.</li>
		<li>소용돌이와 벌레가 용해 될 때까지 주기적으로 모니터링합니다. 참고: 배아의 생존능력이 영향을 받을 수 있기 때문에 5분 이상 표백을 피하십시오.</li>
		<li>30s용 10,000 x g의 원심분리기와 상부체제거.</li>
		<li>M9 버퍼 1mL로 펠릿(계란)을 두 번 씻으십시오.</li>
		<li>세척 후, M9 버퍼의 200 μL에서 계란을 다시 중단하고 수조에서 34 °C에서 25 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>20°C에서 별도의 대조군 시료(eggs)를 유지한다.</li>
		<li>파이펫 100 μL의 제어 또는 열 충격 처리 계란을 시드 NGM 플레이트에 놓습니다. 각 접시에는 적어도 100-200 개의 계란이 포함되어 있습니다.</li>
		<li>부화 때까지 20°C에서 계란을 배양했습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>차동 간섭 대비를 이용한 검사를 위한 L1 애벌레 장착(DIC; 노마르스키) 현미경 검사법<ol>
<li>아가로즈 패드 2%를 준비합니다.</li>
		<li>M9 버퍼 1mL을 사용하여 판을 세척하고 1.5mL 튜브에서 L1 유충 선충을 수집합니다.</li>
		<li>30 s용 10,000 x g의 원심분리기.</li>
		<li>상체를 제거하고 펠릿 (선충)을 유지합니다.</li>
		<li>선충을 마취하기 위해 20mM M9/레바미솔 버퍼의 100 μL을 추가합니다. 참고: 마취제로서 아지드 나트륨을 피하십시오. 나트륨 아지드는 미토콘드리아 손상과 산화 스트레스를 유발하여 결국 세포 사망 유도로 이어진다.</li>
		<li>파이펫 10 μL M9/레바미솔 버퍼는 L1 웜을 함유하고 2% 아가로즈패드(표 1)에장착한다.</li>
		<li>샘플 상단에 커버슬립을 부드럽게 놓습니다. 참고: 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 습도를 유지하기 위해 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다.</li>
		<li>차동 간섭 대비(DIC; 노마르스키) 현미경 검사.</li>
		<li>선충당 특유의 진공 처리된 외관을 가진 세포를 계산하여 6개의 터치 수용체 뉴런의 신경변성을 채점한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 단백질 골재 유도 신경 변성
참고: 다음 균주는 단백질 골재 유도 신경 독성을 조사하는 데 사용할 수 있습니다:(A)도파민성 뉴런에서 인간의 α-synuclein의 과발현, UA44: [baIn1; p Isdat-1α-syn, pdat-1GFP] 및(B)인간 폴리글루타민 단백질(PolyQ) 범뉴알, AM101: rmsIs10[prgef-1Q40:YFP]6,,10.
<ol><li>신경 변성 분석기의 유지 보수, 동기화 및 형질 전환 선충제의 준비<ol>
<li>해부 스테레오현미경을 사용하여 C. elegans 개발 및 성장을 모니터링합니다.</li>
		<li>1일차: 새로 OP50 시드 NGM 플레이트에 각 변형의 15-20 L4 애벌레를 선택하고 이송하여 형질 전환선충의 인구를 동기화합니다. 참고: 조건당 각 변형의 플레이트를 3플레이트 이상 사용하십시오.</li>
		<li>선충이 20°C의 표준 온도에서 자라도록 한다.</li>
		<li>2일차: 34°C로 설정된 인큐베이터에서 플레이트를 전송하여 30분 동안 매일 사전 컨디셔닝을 수행합니다. 그런 다음, 20°C의 표준 온도에서 미리 조건된 선충을 되돌려 보라고 한다. 참고: 다른 유전 적 배경은 장시간 노출을 위해 고온에 민감할 수 있습니다.</li>
		<li>(A)도파민성 뉴런에서 인간의 α-synuclein의 과발현을 조사하는 경우, UA44: Is[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: 9일째에 도파민세포 세포 사멸을 위한 7일 된 형질성 선충을 모니터링한다.</li>
		<li>(B)인간 폴리글루타민 단백질(PolyQ) 팬뉴런, AM101: rmsIs10[prgef-1Q40:YFP]: 5일째에 Q40:YFP를 표현하는 4일간의 형질전환 동물의 머리 부위에 있는 뉴런 폴리Q 골재를 측정한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>현미경 검사를 위한 견본 설치<ol>
<li>2% 아가로즈패드(표 1)를준비합니다.</li>
		<li>아가로즈 패드의 중앙에 20mM M9/레바미솔 버퍼 드롭의 10 μL을 추가합니다.</li>
		<li>각각의 형질 전환선충을 선택하고 M9/레바미솔 드롭으로 옮기. 참고: 드롭당 20-30선충을 놓습니다.</li>
		<li>샘플 상단에 커버슬립을 부드럽게 놓습니다. 참고: 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 습도를 유지하기 위해 매니큐어로 커버슬립을 밀봉합니다.</li>
		<li>각각의 샘플의 현미경 검사를 진행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>도파민성 뉴런에서 α-synuclein 및 세포경 GFP를 공동 발현하는 트랜스제닉 선충제의 획득 과정 및 데이터 분석<ol>
<li>카메라와 결합된 피형성 현미경을 사용하십시오(예: EVOS FL 자동 2).</li>
		<li>20배 배율로 헤드 영역의 z 스택 이미지를 감지하고 캡처합니다.</li>
		<li>최대 강도 투영 이미지를 저장하고 수집합니다.</li>
		<li>획득한 이미지의 분석을 진행합니다.</li>
		<li>다음과 같은 세포 특성을 득점하여 신경 변성에 대한 형질 전환 웜을 검사, (i) dat-1의발기인하에서 GFP를 표현하는 뉴런에서 형광의 손실, (ii) 소마 및 /또는 축축출혈, 아웃스승 또는 수지상 손실을 보여주는 뉴런.</li>
		<li>소프트웨어 패키지(예: Excel)를 사용하여 데이터를 가져오고 분석합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. YFP와 융합된 팬뉴런 폴리Q40을 발현하는 형질전환 선충의 수집 과정 및 데이터 분석
<ol><li>카메라와 결합된 피형성 현미경을 사용하십시오(예: EVOS FL 자동 2).</li>
	<li>20배 배율로 헤드 영역의 z 스택 이미지를 감지하고 캡처합니다.</li>
	<li>최대 강도 투영 이미지를 저장하고 수집합니다.</li>
	<li>피지 소프트웨어를 사용하여 획득 된 이미지의 분석을 진행합니다.</li>
	<li>피지 프로그램14와이미지를 엽니 다.</li>
	<li>이미지 및 색상 드롭다운 메뉴를 통해 분할 채널 명령을 선택합니다. 참고: 녹색 채널 이미지를 유지합니다.</li>
	<li>프리핸드 선택 도구를 사용하여 형광 영역(ROI; 예: 헤드)을 수동으로 설정합니다.</li>
	<li>분석 및 도구 드롭다운 메뉴를 통해 ROI 관리자에 각각의 ROI를 추가합니다.</li>
	<li>프로세스를 선택하고 배경을 빼서 배경을 50%로 뺍니다.</li>
	<li>메뉴 명령 이미지를 통해 임계값 을 설정하고 적용 | 조정 | 임계값. 전체 실험의 이미지 분석을 통해 동일한 임계값을 유지하고 설정합니다.</li>
	<li>ROI 관리자에서 각 ROI를선택합니다.</li>
	<li>메뉴 명령을 사용하여 입자를 분석하고 분석하여단백질 골재 수를 분석합니다.</li>
	<li>획득한 각 이미지에 대해 3.5-3.12단계를 반복합니다.</li>
	<li>별도의 결과 창에서 표시 값을 복사합니다.</li>
	<li>소프트웨어 패키지를 사용하여 결과를 붙여넣기/가져오기/가져오기합니다.</li>
</ol>4. 통계 분석 보고서
<ol><li>각 실험 조건에 대해 적어도 30개의 선충을 사용하십시오. 세 가지 생물학적 복제를 수행합니다.</li>
	<li>통계 분석 소프트웨어를 사용하여 학생 t-test(두그룹 간의 비교) 또는 ANOVA(여러 그룹 간의 비교)를 수행하여 p&lt; 0.05를 가진 통계 분석을 유의하게 수행합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Enzymology. 545, 127-155 (2014).</li>
<li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biochemistry+of+neuronal+necrosis%3A+rogue+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The biochemistry of neuronal necrosis: rogue biology.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (8), 672-684 (2003).</li>
<li>Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+models+of+mechanotransduction%3A+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Genetic models of mechanotransduction: the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Physiological Reviews. 84 (4), 1097-1153 (2004).</li>
<li>Berkowitz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+C.+elegans+dopamine+neuron+degeneration+assay+for+the+validation+of+potential+Parkinson%27s+disease+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Application of a C. elegans dopamine neuron degeneration assay for the validation of potential Parkinson's disease genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).</li>
<li>Brignull, H. R., Moore, F. E., Tang, S. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+proteins+at+the+pathogenic+threshold+display+neuron-specific+aggregation+in+a+pan-neuronal+Caenorhabditis+elegans+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine proteins at the pathogenic threshold display neuron-specific aggregation in a pan-neuronal Caenorhabditis elegans model.</a> Journal of Neuroscience. 26 (29), 7597-7606 (2006).</li>
<li>Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+disruption+of+cellular+protein+folding+in+models+of+polyglutamine+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases.</a> Science. 311 (5766), 1471-1474 (2006).</li>
<li>Gitler, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Parkinson%27s+disease+protein+alpha-synuclein+disrupts+cellular+Rab+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Parkinson's disease protein alpha-synuclein disrupts cellular Rab homeostasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 145-150 (2008).</li>
<li>Klaips, C. L., Jayaraj, G. G., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+of+cellular+proteostasis+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pathways of cellular proteostasis in aging and disease.</a> Journal of Cell Biology. 217 (1), 51-63 (2018).</li>
<li>Labbadia, J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+proteostasis+in+aging+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The biology of proteostasis in aging and disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 84, 435-464 (2015).</li>
<li>Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+dopamine+neuron+degeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling dopamine neuron degeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 793, 129-148 (2011).</li>
<li>Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat-shock+proteins+protect+from+heat-stroke-associated+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration.</a> Nature. 490 (7419), 213-218 (2012).</li>
<li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat+shock+proteins+and+neurodegeneration%3A+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22BioMolecular+Concepts%22%5BJournal%5D)">Small heat shock proteins and neurodegeneration: recent developments.</a> BioMolecular Concepts. 9 (1), 94-102 (2018).</li>
<li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li>
<li>Samara, C., Syntichaki, P., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+is+required+for+necrotic+cell+death+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autophagy is required for necrotic cell death in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Death and Differentiation. 15 (1), 105-112 (2008).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

여기에서, 우리는 노화에 의존하는 신경 변성을 조사하는 몇몇 다재다능한 C. elegans 모형의 성장, 동기화 및 현미경 검사를 위한 넓게 접근하는 방법론을 소개하고 기술합니다. 특히, 하이퍼활성화이온 채널 유도 괴사,및 단백질 골재 유발 신경독성1,2,23,3,4,,5,,7,9,,10,11을이용하여 연령관련 뉴런 고장의 세포 및 분자 기초를 평가하고 해부한다.,
<p ...

지난 2 년 동안, C. elegans 널리 괴사 세포 죽음의 분자 메커니즘을 조사 하는 모델 유기체로 사용 되었습니다. C. elegans는 매우 잘 특성화되고 매핑된 신경계, 투명한 신체 구조 및 노화 전반에 걸쳐 생체 외세포 기능 및 생존을 모니터링하는 유전 및 이미징 방법의 다양한 레퍼토리를 제공합니다. 따라서, 신경 변성의 몇몇 C. elegans 유전 모형은 이미 신경 생존성을 평가하기 위하여 개발되었습니다. 특히, 잘 설명되고 사용되는 선충 모델은 단백질,집계4, 5, 6, 7, 8, 9,10 및 열사병 11, 12, 그 외 에서 단백질,집계1,,4,5,,6,7,78,9,10 및 열사병11, 12,그 외에서 증가된 단백질 집계에 의해 유발되는 활동적인 이온 채널 유도 괴사1,2,3 및세포 사멸을 포함한다.2
사외 치명적인 온도에 단기 노출은 선충과 포유류 뉴런11모두에서 후속 열 스트레스에 의해 트리거 괴사 세포 죽음에 대한 저항을 부여했다. 흥미롭게도, 온화한 고온에서 선충의 매일 전제 조건은 이온 불균형 (예를 들어, mec-4 (u231) 및 /또는 deg-3 (u662)및 단백질 집계 (예를 들어, α-synuclein 및 polyQ41) 및 폴리11Q41등 다양한 자극에 의해 가해지는 신경 변성으로부터보호합니다.13
여기서는 C. elegans를 사용하여 발췌 독성 유발 세포 사망, 파킨슨병 및 헌팅턴 병과 같은 잘 확립 된 인간 질환 모델에서 연령 의존적 신경 변성을 모니터링하고 평가합니다. 또한, 우리는 신경 변성의 여러 모델에서 열 전조의 신경 보호 역할을 강조. 유전 및/또는 약리학적 스크린과 함께 이러한 기술의 조합은 잠재적인 치료 적 관심과 함께 새로운 세포 죽음 변조기의 식별 및 특성화를 초래할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>한</td><td>천 시그마-알드리치</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>아가로스</td><td>바이오짐</td><td>8,40,004</td><td></td></tr><tr><td>AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 탈수물(CaCl2?2H2O)</td><td>시그마-알드리치</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>SERVA 전기영동</td><td>17101.01</td><td></td></tr><tr><td>deg-3(u662)V 또는 deg-3(d)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>20 &deg에서 동물 유지; C</td></tr><tr><td>DIC 현미경 (Nomarsky)</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Axio Vert A1</td></tr><tr><td>해부 실체현미경</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td>SMZ645</td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>EVOS Cell Imaging Systems</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50 strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Greiner Petri 접시 (60 mm x 15 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5237</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>피지</td><td></td><td>https://fiji.sc</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,37,010</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,04,873</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘 (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>mec-4(u231)X 또는 mec-4(d)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td>동물을 20세 이상으로 유지; C</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 (75 mm x 25 mm x 1 mm)</td><td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td><td>10 006 12</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 유리 (18 mm x 18 mm)</td><td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td><td>01 010 30</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office 2011 Excel 소프트웨어 패키지</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,06,586</td><td></td></tr><tr><td>선충 성장 배지(NGM) 한천 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>니스타틴 원액</td><td>시그마-알드리치</td><td>N3503</td><td></td></tr><tr><td>펩톤</td><td>BD, 박토</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>EMD 밀리포어</td><td>1,06,40,41,000</td><td></td></tr><tr><td>한천 플레이트( 오토클레이브, 페트리 접시 등)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>웜 유지 관리를 위한 표준 장비(백금 와이어 픽, 인큐베이터 등)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>통계 분석 소프트웨어</td><td>GraphPad Software Inc., 미국</td><td></td> 샌디에이고, <td>GraphPad Prism 소프트웨어 패키지</td></tr><tr><td>스트렙토마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>테트라미솔 염산염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756</td><td></td></tr><tr><td>UA44: Is[baIn1; pdat-1&alpha;-syn, pdat-1GFP]</td><td></td><td></td><td>요청 시: G. Caldwell (앨라배마 대학교, 터스컬루사 앨라배마)</td></tr></tbody></table>

카노르하비티스 예르간에서 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환 모델링

Modeling Age-Associated Neurodegenerative Diseases in Caenorhabditis elegans

인간의 신경 퇴행성 병리학과 싸우고 그들의 만연한 사회 경제적 영향을 관리하는 것은 글로벌 우선 순위가되고있다. 인간의 삶의 질과 의료 시스템에 대한 해로운 영향에도 불구하고, 인간의 신경 퇴행성 질환의 대부분은 여전히 불치의 예방 할 수없는 남아있다. 따라서 이러한 질병에 대한 새로운 치료 개입의 개발은 시급한 시급성이되고 있습니다. 뉴런 회로와 기능의 노화와 관련된 악화는 낮은 벌레 Caenorhabditis elegans 및 인간과 같은 다양한 유기체에서 진화적으로 보존되어 기본 세포 및 분자 메커니즘의 유사성을 나타냅니다. C. elegans는 노화 중 신경 활동과 품질 관리를 평가하기 위해 잘 특징인 신경계, 신체 투명성 및 유전 및 이미징 기술의 다양한 레퍼토리를 제공하는 고가성 유전 모델입니다. 여기서, 우리는 과활성화 이온 채널 유도 괴사(예를 들어, deg-3(d) 및 mec-4(d)및 단백질 집계(예를 들어, α-syunclein 및 poly-글루타메이트)를 포함하여 일부 다목적 선충 모델을 활용하여 세포 및 세포 노화의 세포 분석과 세포 의 세포 적고를 모니터링 및 절제하는 방법을 소개하고 설명합니다. 이러한 동물 신경 변성 모델의 조합, 세포 죽음 변조기에 대 한 유전 및 약리학적 화면과 함께 신경 기능의 나이 관련 고장의 전례 없는 이해로 이어질 것입니다 및 인간의 건강 및 삶의 질에 광범위 한 관련성에 중요 한 통찰력을 제공할 것입니다.

음과 이온 채널에 의해 유도 된 괴사 세포 죽음 여기에 제시된 절차를 이용하여, mec-4(u231) 및 deg-3u662) 돌연변이 배아는 34°C에서 25분 동안 배양되거나 20°C의 표준 온도에서 보관하였다. 부화 시, 신경 세포 시체의 수는 두 그룹의 L1 애벌레 단계에서 결정되었다. 괴사 세포 죽음은 열 충격 전제 조건 계란(그림 1A-1B)에서부화 선충에서 감소된다.
단백질 골재 유도 신경 변성 트랜스제닉 선충과 발현(A) 인간 α-시뉴클레인 및 세포질 GFP는 도파민성 뉴런과 (B) 인간 폴리글루타민 단백질(PolyQ)이 YFP 팬뉴런과 융합되어, 34°C에서 30분 동안 매일 노출되었다. 열충격 전재는 7일 성인 헤르마프로디테(그림2A)에서</...

여기에서, 우리는 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환의 세포 및 분자 기초를 모니터링하고 해부하기 위해 과활성화 이온 채널 유도 괴사 및 단백질 골재 유도 신경 독성을 포함하여 일부 다목적 선충 모델을 활용하여 널리 접근 할 수있는 방법론을 소개하고 설명합니다.

Battling human neurodegenerative pathologies and managing their pervasive socioeconomic impact is becoming a global priority. Notwithstanding their ...

지난 수십 년 동안 인간의 수명은 생활 수준 개선과 의학의 발전으로 인해 연장됩니다. 나이는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 과 같은 신경 퇴행성 질환을 포함한 많은 생명을 위협하는 질병의 가장 큰 위험 요소입니다. 여기서, 우리는 신경 변성의 세포 분자 메커니즘을 모니터링하고 해부하기 위해 하이퍼 액티브 이온 채널 유도 괴사 및 단백질 응집체를 포함한 일부 다목적 새로운 방법 모델을 활용하여 방법론을 시연한다.4개의 피크 건강 유충은 4를 만들고 해부 스테레오 현미경을 사용하여 E.Coli와 체질, 선충 성장 미디어 플레이트에 3 개의 뉴턴 선충을 합니다. 10및 4개의 선충, 기생 효소 플레이트를 놓고 표준 온도에서 섭씨 20도의 성장하십시오. 5일 후, 1mL와 9 버퍼로 접시를 씻고 1.5mL 튜브로 동물을 수집합니다.30, 000g의 원심분리기는 30초 동안 상체를 제거합니다. 도금 용액0.5mL를 추가합니다. 도금 용액은 실온에 저장됩니다.소용돌이와 모니터링은 모두 용해 될 때까지 주기적으로 모니터링합니다. 5분 이상 도금하지 마십시오. 원심분리기는 10, 000g에서 30초 동안 및 상부체를 제거합니다.1mL과 9개의 버퍼로 팔레트를 두 번 씻으세요. 원심분리기는 10000g에서 30초 동안 상주분리기를 제거합니다. 세척 후, 200 마이크로 리터 M9 버퍼에서 계란을 다시 중단하고 25 분 동안 배양, 수조에서 섭씨 34도에서.20도에서 별도의 계란 그룹을 유지하십시오. 제어 또는 열 충격을 포함하는 파이펫 100 마이크로 리터는 계란을 치료하고 시드되지 않은 10 GN 플레이트에 배치합니다. 각 접시에는 적어도 100~200개의 알이 들어 있습니다.부화 때까지 20섭씨에서 계란을 배양합니다. 1.5ml 튜브에서 접시를 씻고 L1 생명과 선충을 수집하기 위해 M9 버퍼를 사용합니다. 원심 분리기 는 10, 000g에서 30 초 동안.상체를 제거하고 팔레트를 유지합니다. 선충을 마취하기 위해 20 밀리머 M9 레반지 버퍼의 100 마이크로 리터를 추가합니다. L1 시계를 함유하고 2% 아가-ls 스팟에 장착하여 시료 상단에 커버슬립을 부드럽게 장착하는 M9 레반디얼 버퍼의 파이펫 10 마이크로리터.DIC 현미경 을 사용하여 시계를 관찰하십시오. 630 수용체 뉴런의 스캐닝 변성을 스캐닝하여 그 선충의 특징적인 가상 원조 외관을 가진 세포를 계산하여. 선충을 선택하고 15 ~20 L4 유충을 선택하

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 벌레에 amylopathies의 양상을 연구하는 방법을...

<em&gt; Caenorhabditis의 엘레</emAmylopathy 연구에 대한&gt; 모델 시스템

단백질 항상성, 스트레스 및 노화 사이의 관계를 연구하기 위해 유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 Caenorhabditis elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 기능 장애, 세포 내 단백질 국소화 및 유기체, 세포 및 단백질 수준에서의 단백질 안정성을 추적하여 단백질 접힘의 변화를 모니터링했습니다.

사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

초파리 널리 신경 퇴행을 연구하기위한 모델 시스템으로 사용된다. 이 프로토콜은, 뇌의 공포 형성에 의해 결정된 바와 같이, 정량 할 수있는 변성하는 방법을 설명한다. 또한 인해 하나의 샘플로 처리 및 절편 제어 및 실험 파리에 의해 실험 절차에 효과를 최소화 할 수 있습니다.

질량 조직학은에 신경 퇴행을 정량화하기<em&gt; 초파리</em

여기에 제시 된 방법의 목표는 단백질 집계 모델 유기 체 C. 선 충에서 정상적인 노화 과정을 탐구. 프로토콜 나이 형성 하는 매우 불용 성 큰 집계를 공부 하 고 proteostasis에 변화 단백질 집계에 미치는 영향을 결정 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

여기에서, 우리는 형질전환 성 외피염 예쁜꼬마선에서 녹색 형광 단백질을 발현하는 살아있는 뉴런 세포의 특정 그룹의 단순 분리를 위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 특정 뉴런에 초점을 맞춘 다양한 생체 내 연구를 가능하게하고 추가 단기 배양세포를 분리 할 수있는 능력을 갖는다.

둥근 벌레 예쁜꼬마선충에서 특정 신경 인구의 격리

이 프로토콜은 근위축성 측삭 경화증의 C. elegans 모형에 있는 온화한, 온건한, 및 가혹한 운동 손상 사이에서 차별에 대한 2개의 민감한 분석, C. elegans 긴장에 대한 일반적인 유틸리티, 변경된 운동성.

근위축성 측삭 경화증의 C. 엘레간 모델의 모터 손상 평가

이 기사에서는 7점 득점 시스템을 사용하여 C. elegans의도파민성 뉴런 원간 형태에 대한 변경 사항을 일관되게 정량화하는 방법을 소개합니다. 이 시스템은 유전, 화학 및 신경 퇴행성 질환의 노화 기반 모델을 활용한 도파민성 신경 변성 분석의 분석을 위한 것입니다.

Caenorhabditis elegans에서 도파민인체학 뉴런 형태 학적 변경 및 변성의 수준을 정량화

여기에서, 우리는 폴리글루타민 응집, 뉴런 사멸 및 화학 회피 거동뿐만 아니라 다중 표현형의 예시적인 통합을 포함하는 예쁜꼬마선충에서 시험 화합물의 신경 보호 활성을 평가하기 위한 프로토콜을 제시한다.

Caenorhabditis elegans는 Polyglutamine-mediated Neurotoxicity에 대한 생리 활성 화합물을 발견하기위한 모델 시스템으로서의

이 인터뷰에서 박사 린드 퀴 스트는 단백질 접힘, 프리온 질환과 neurodegenerative 질환 사이의 관계를 설명합니다. 단백질 폴딩의 문제는 현대 생물학의 핵심에 있습니다. 그들의 전통적인 생화 학적 기능 이외에, 단백질은 생물 학적 정보의 전송을 중재하고 따라서 유전 물질로 간주 될 수 있습니다. 단백질의이 최근에 발견된 기능은 인간의 장애 연구에 중요한 의미가 있습니다. 린드 퀴 스트 박사는 또한 모델 생물의 유전 연구를 기반으로 neurodegenerative 질병의 메커니즘을 조사하기 위해 현재의 실험 방법을 설명합니다.

인터뷰 : 단백질 폴딩과 Neurodegenerative 질병의 연구

생산 C. 엘레간스</em함께 Recombineering 통해> Transgenes galK 선택 마커

배우세요 노화 관련 신경 퇴행성 질환을 연구하는 방법을 Caenorhabditis elegans 모델을 활용하여. 과활성화 이온 채널 유도 괴사와 단백질 응집체 유발 신경독성 기법을 통해 신경 퇴행의 세포 분자 메커니즘을 분석합니다.

카노르하비티스 예르간에서 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환 모델링

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