Name: Caenorhabditis elegans에서 드 노보 단백질 합성 비율의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 배우세요 Caenorhabditis elegans에서 FRAP을 이용한 드 노보 단백질 합성 비율 측정 방법을. 실시간 모니터링과 약물 스크리닝이 가능한 비방사성 생체 내 기술입니다.

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비디오 녹화 및 편집에 대한 차니오타키스 M. 및 쿠나키스 K. 감사드립니다. K.P.는 그리스 연구 혁신 재단(HFRI)과 연구 기술 총무사(GSRT)의 보조금으로 지원받고 있습니다. N.T.는 유럽 연구 위원회 (ERC – GA695190 – MANNA), 유럽 위원회 프레임 워크 프로그램 및 그리스 교육부의 보조금으로 지원됩니다.

참고: 형광에 대한 전사 및 번역 융합을 모두 사용하여 여러 조직에서 드 노보 단백질 번역을 평가할 수 있습니다. 단백질 합성 비율은 세포질, 미토콘드리아 및 핵7을포함하여 다른 세포 구획에서 국소화된 다중 단백질 가족을 위해 평가될 수 있습니다. 다음 균주는 글로벌 및 뉴런 단백질 합성 율을 모니터링 하는 데 사용 됩니다., N2; Ex[pife-2GFP, pRF4], ife-2 (ok306); Ex[pife-2GFP, pRF4], N2; Ex[punc-119GFP, pRF4], edc-3 (ok1427); Ex[punc-119GFP, pRF4], N2; Ex[psod-3GFP; pRF4]
1. 드 노보 단백질 합성을 모니터링하기위한 트랜스 제닉 선충의 유지 보수, 동기화 및 준비
<ol><li>해부 스테레오 현미경을 사용하여 야생 유형 (wt) 및 돌연변이 형선선선선색의 발달 단계와 성장을 평가합니다.</li>
	<li>1일차: 벌레 선택을 사용하여 원하는 형광 기자를 운반하는 wt 및 돌연변이 형질전환 동물의 10L4 애벌레를 대장균(OP50)으로 Escherichia 시드한 선충화 성장 미디어(NGM) 플레이트에 선택하여 전송한다(표1).<ol>
<li>분젠 버너의 접촉 부위에 유리를 녹여 유리 파스퇴르 파이펫의 테이퍼 끝에 백금 와이어를 부착하여 웜 픽을 합니다. 그런 다음 모든 도구(예: 핀서 또는 라이트 해머)를 사용하여 백금 와이어의 끝을 주걱 모양으로 평평하게 만듭니다.</li>
		<li>대장균(OP50) E. coli 박테리아의 단일 콜로니를 루리아-베르타니(LB) 액체 배지의 50mL를 함유한 플라스크로 접종하고 흔들리는 인큐베이터에서 37°C에서 10시간 동안 성장한다(200rpm; 표 1). 그런 다음 세균 배양의 200 μL을 가진 NGM 플레이트를 시드. 세균 잔디의 성장을 허용 하기 위해 하룻밤 실온에서 씨앗 접시를 배양.</li>
	</ol>
</li>
	<li>20°C의 표준 온도에서 선충을 배양하고 성장시다.</li>
	<li>5일차: 플레이트에는 형질전환벌레의 혼합된 집단이 포함되어 있습니다. 갓 시드 된 OP50-NGM 플레이트에 각 변형의 15 L4 애벌레를 선택하고 전송합니다.</li>
	<li>6일차: FRAP 분석 작업을 수행하고 성인1일째에 단백질 합성률을 모니터링합니다.</li>
	<li>NGM 플레이트를 포함하는 사이클로헤시미드를 준비하고 긍정적인 컨트롤로 사용하십시오. 참고: 10 mg/mL의 농도로 물에 희석하여 사이클로헨드의 스톡 솔루션을 준비하십시오. 재고 용액을 4 °C로 유지하십시오.<ol>
<li>UV 빛 (222 μW /cm2 강도)으로 15 분 동안 시드 NGM 플레이트를 노출하여 박테리아를 죽입니다.</li>
		<li>식기 부피의 500 μg/mL 최종 농도에 세균 시드 플레이트 위에 사이클로헨시미드를 추가합니다.</li>
		<li>플레이트가 실온에서 30분 동안 건조되도록 허용합니다.</li>
		<li>차량 및 사이클로헤시미드 함유 플레이트에 psod-3GFP를 발현하는 트랜스제닉 선충을 전송합니다.</li>
		<li>20°C의 표준 온도에서 2시간 동안 동물을 배양한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 체세포 조직을 표현하는 트랜스제닉 동물을 이용한 FRAP 분석 기자 pife-2GFP 및 psod-3GFP
참고: 동물 몸 전체에서 글로벌 단백질 합성 률을 모니터링합니다. 이 전사 기자는 다른 발현 수준을 제시하고 장, 인두 및 바디 월 근육을 포함하여 다중 체세포 조직에서 유비쿼터스로 표현됩니다.
<ol><li>1일 성기 형질전환 동물을 중앙에 20μL OP50 드롭으로 시드한 개별 NGM 플레이트로 선택하고 이송합니다.</li>
	<li>뚜껑을 제거하고 각 플레이트를 에피플루오렌스 현미경의 20배 객관적 렌즈 아래에 놓습니다.</li>
	<li>포토표백(사전 표백제)전에 참조 이미지를 집중하고 캡처합니다.</li>
	<li>10 분 동안 각 샘플을 표백합니다. 참고: 형광 신호가 표백 전 이미지에 비해 30 ~ 50 % 강도로 담금질 될 때 광표백을 중지합니다. 표백 기간의 빛 강도 및 기간은 검사 중인 특정 불소, 동물 단계 및 세포 또는 조직에 대해 그에 따라 조정되어야 합니다. 다른 표본에 대한, 광 표백의 적절한 범위에 도달하는 데 필요한 조사의 적절한 기간은 실험적으로 결정되어야한다.</li>
	<li>포토표백(표백제) 후 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>개별 NGM 접시에 동물을 유지하고 복구 할 수 있습니다.</li>
	<li>형광 스테레오 현미경에서 적어도 6 시간 동안 각 형광 기자의 회복을 이미지 및 기록합니다.</li>
	<li>대안적으로, 형광 현미경(예를 들어, AxioImager Z2)을 사용하여 형광 회복 평가를 수행한다.</li>
	<li>다음 3일 동안 운동, 터치 감도, 생식 능력 및 생존을 모니터링하여 동물당 동물 건강을 신중하게 평가합니다. 석광 표백 후 손상의 흔적을 나타내는 선충은 추가 분석에서 제외되었다.</li>
</ol>3. 시료를 장착하고 팬 뉴런 세포질 GFP, punc-119GFP를 발현하는 형질전환 선충을 사용하여 FRAP 분석기를 수행합니다.
참고: 신경 고리가 있는 헤드 부위의 표적 광표백에 의해 범신경 단백질 합성을 모니터링합니다.
<ol><li>아가로즈 패드 2%를 준비합니다.</li>
	<li>아가로즈 패드의 중앙에 M9 버퍼 10 μL 방울을 추가합니다.</li>
	<li>팬 뉴런 세포질 GFP를 발현하는 5개의 형질선선충을 M9 버퍼한 방울로 옮긴다.</li>
	<li>속눈썹을 사용하여 액체를 퍼뜨리시면 됩니다. 참고: 동물은 Agar에 M9 흡수력으로 인해 2분 이내에 감소된 움직임을 표시합니다.</li>
	<li>선충 위치를 변경하여 "속눈썹" 선택을 사용하여 겹치지 않도록 합니다.</li>
	<li>시료를 과형 현미경의 40배 객관적렌즈 아래에 놓는다. 참고: 커버슬립을 사용하지 마십시오.</li>
	<li>참조 이미지(사전 표백제)에 초점을 맞추고 캡처합니다.</li>
	<li>90초 동안 대상 관심 영역을 포토블리치합니다. 참고: 형광 신호가 표백 전 이미지에 비해 30 ~ 50 % 강도로 담금질 될 때 광표백을 중지합니다. 표백 기간의 빛 강도 및 기간은 검사 중인 특정 불소, 동물 단계 및 세포 또는 조직에 대해 그에 따라 조정되어야 합니다. 다른 표본에 대한, 광 표백의 적절한 범위에 도달하는 데 필요한 조사의 적절한 기간은 실험적으로 결정되어야한다.</li>
	<li>포토표백(표백제) 후 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>광표백 선충에 M9 버퍼 10 μL 방울을 추가합니다.</li>
	<li>동물이 5 분 동안 회복하도록하십시오.</li>
	<li>"속눈썹" 선택 또는 파이펫을 사용하여 선충을 중앙에 20 μL OP50 드롭으로 시드된 개별 NGM 플레이트로 전송합니다.</li>
	<li>상피 성 피관기 현미경으로 1 시간마다 각 샘플의 이미지를 캡처합니다. 참고: 광표백 후 복구 시간에 대해 t=0을 계산합니다.</li>
</ol>4. FRAP 분석 중에 캡처된 이미지의 데이터 분석
<ol><li>소프트웨어(예: 피지)를 사용하여 획득된 이미지를 분석합니다.</li>
	<li>소프트웨어로 이미지를 엽니다.</li>
	<li>이미지 및 색상 드롭다운 메뉴를 통해 분할 채널 명령을 선택합니다. 참고: 녹색 채널 이미지를 유지합니다.</li>
	<li>Freehand 선택 도구를 사용하여 관심 있는 형광 영역(예: 전신, 머리, 내장)을 수동으로 설정합니다.</li>
	<li>드롭다운 분석 메뉴를 통해 측정 명령을 선택하여 각 시간 지점에 대한 관심 영역의 평균 픽셀 강도를 측정합니다. 참고: 형광 회수의 백분율은 광표백 후 캡처된 참조 이미지를 사용하여 계산됩니다.</li>
</ol>5. 통계 분석 보고서
<ol><li>적어도 사용 20 – 25 각 변형 및/또는 조건의 선충. 참고: 세 가지 생물학적 복제를 수행해야 합니다.</li>
	<li>통계 분석 소프트웨어를 사용하여 유의한 P&lt; 0.05를 사용한 통계 분석을 위해 학생 t-테스트(두그룹 간의 비교) 또는 ANOVA(여러 그룹 간의 비교)를 수행합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Syntichaki, P., Troulinaki, K., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eIF4E+function+in+somatic+cells+modulates+ageing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">eIF4E function in somatic cells modulates ageing in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 445 (7130), 922-926 (2007).</li>
<li>Charmpilas, N., Daskalaki, I., Papandreou, M. E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+as+an+integral+quality+control+mechanism+during+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis as an integral quality control mechanism during ageing.</a> Ageing Research Reviews. 23, Pt A 75-89 (2015).</li>
<li>Li, G. W., Burkhardt, D., Gross, C., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+absolute+protein+synthesis+rates+reveals+principles+underlying+allocation+of+cellular+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Quantifying absolute protein synthesis rates reveals principles underlying allocation of cellular resources.</a> Cell. 157 (3), 624-635 (2014).</li>
<li>Dermit, M., Dodel, M., Mardakheh, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+monitoring+and+measurement+of+protein+translation+in+time+and+space%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Methods for monitoring and measurement of protein translation in time and space.</a> Molecular Biosystems. 13 (12), 2477-2488 (2017).</li>
<li>Iwasaki, S., Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Growing+Toolbox+for+Protein+Synthesis+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Growing Toolbox for Protein Synthesis Studies.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 612-624 (2017).</li>
<li>Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Transparent+Window+into+Biology%3A+A+Primer+on+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).</li>
<li>Kourtis, N., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+monitoring+of+protein+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell-specific monitoring of protein synthesis in vivo.</a> PLoS One. 4 (2), 4547(2009).</li>
<li>Parker, R., Sheth, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P+bodies+and+the+control+of+mRNA+translation+and+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">P bodies and the control of mRNA translation and degradation.</a> Molecular Cell. 25 (5), 635-646 (2007).</li>
<li>Rieckher, M., Markaki, M., Princz, A., Schumacher, B., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+Proteostasis+by+P+Body-Mediated+Regulation+of+eIF4E+Availability+during+Aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Maintenance of Proteostasis by P Body-Mediated Regulation of eIF4E Availability during Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Cell Reports. 25 (1), 199-211 (2018).</li>
<li>Reits, E. A., Neefjes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+fixed+to+FRAP%3A+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nature Cell Biology. 3 (6), 145-147 (2001).</li>
<li>Keith, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Graded+Proteasome+Dysfunction+in+Caenorhabditis+elegans+Activates+an+Adaptive+Response+Involving+the+Conserved+SKN-1+and+ELT-2+Transcription+Factors+and+the+Autophagy-Lysosome+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Graded Proteasome Dysfunction in Caenorhabditis elegans Activates an Adaptive Response Involving the Conserved SKN-1 and ELT-2 Transcription Factors and the Autophagy-Lysosome Pathway.</a> PLoS Genetics. 12 (2), 1005823(2016).</li>
<li>Kumsta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagy+receptor+p62%2FSQST-1+promotes+proteostasis+and+longevity+in+C.+elegans+by+inducing+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The autophagy receptor p62/SQST-1 promotes proteostasis and longevity in C. elegans by inducing autophagy.</a> Nature Communications. 10 (1), 5648(2019).</li>
<li>Gregersen, N., Bolund, L., Bross, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+aggregation%2C+and+degradation+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, aggregation, and degradation in disease.</a> Molecular Biotechnology. 31 (2), 141-150 (2005).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

단백질 합성 변조는 유기체 항상성에 필수적입니다. 노화 하는 동안, 글로벌 뿐만 아니라 특정 단백질 합성 혼란. 최근 연구에 따르면 단백질 번역 균형이 노화와 노화를 직접 제어하는 것은 단순히 노화 과정의 부산물이 아니라는 사실을 보여줍니다. 특히, 진핵 개시인자 4E(eIF4E)와 같은 번역 기계류의 핵심 성분은 번역 개시 시 mRNA 캡핑을 용이하게 하고, 따라서 캡 의존성 단백질 번역의 속도를 용이하게 하고, 산화 스트레스를 유도하고 노화 과정을 가속화한다1. 더욱이, mRNA 처리체, P바디와 상호작용하고 mRNA 절충의 비율을 증가시키는 뉴런 특이적 EDC-3도 노화 공정8을가속화한다. 구체적으로, EDC-3 억제는 IFE-2 분리를 P 체체로 분리하여 궁극적으로 단백질 번역 수준을 감소시키고, 뉴런 노화를 지연시키는9를허용한다.
FRAP는 생...

단백질 합성 및 분해는 유기체 항상성에 필수적입니다. 다양한 연령 관련 질병은 결함이 있는 단백질 생산1,,2에의해 선동된다. 글로벌 단백질 번역 율을 측정하기 위해, 리보솜 보호 mRNA 단편의 깊은 시퀀싱을 수반하는 리보솜 프로파일링과 같은 생화학적 기술이 있으며, 이는 새로운 단백질 합성3뿐만아니라 발현을 모니터링한다. 이 방법은, 번역 속도의 간접적인 판독이외에, 리보솜에 대한 증가된 RNA 협회가 반드시 증가된 번역을 의미하지 않기 때문에, 높은 비용 및 다량의 시작 물질의 요구 사항과 같은 기술적 단점이 있다. 한편, 프로테오믹스 기반 방법은 맥박 대사 프로파일링에 의한 직접 단백질 정량화를 허용한 후 질량 분석 분석4,,5. 그러나, 이것은 생체 내에서 쉽게 사용할 수 없는 제한된 시간적 해상도를 가진 반정적 접근법이다. 더욱이, 단백질의 라벨링은 관심있는 동물/조직에 불평등하게 분배될 수 있다. 중요하 군데, 이 두 가지 방법은 조직별 또는 세포별 변이를 전체 동물 또는 조직에서 각각 은폐할 수 있다.
Caenorhabditis elegans는 대량으로 재배 할 수있는 사용하기 쉬운 모델 유기체입니다6. 추가적으로, 그것의 유전 편의성과 투명성은 생체 내의 살아있는 화상 진찰을 허용합니다. 이 프로토콜은 광표백 후 형광 복구를 사용하여 단백질 합성 속도를 검출하는 방법론을 설명합니다(FRAP). 우리는 전체 유기체 또는 특정 조직/세포에서 형광 단백질의 형질전환 발현을 이용합니다. 형질전환 동물은 유전자의 프로모터를 사용하여 GFP를 발현할 수 있는데, 이는 광범위/전 세계적으로 표현되거나 특정 세포 유형을 표적으로 하는 조직 별 프로모터이다. 이 기술은 특정 단백질의 단백질 합성 비율을 검토하기 위하여 특정 프로모터로 확장될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>한천</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>8,40,004</td><td></td></tr><tr><td>Agarose 패드 2%</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 탈수물(CaCl2?2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>SERVA 전기영동</td><td>17101.01</td><td></td></tr><tr><td>시클로헥시미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7698</td><td></td></tr><tr><td>해부 실체현미경</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td>SMZ645</td></tr><tr><td>edc-3(ok1427); 예[punc-119GFP, pRF4]</td><td>Tavernarakis lab</td><td></td><td>20 &deg에서 동물 유지; C</td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Axio Imager Z2</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50 strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>형광 해부 실체 현미경</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SteREO Lumar V12</td></tr><tr><td>Greiner Petri 접시 (60 x 15 mm)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5237</td><td></td></tr><tr><td>ife-2(ok306); 예[pife-2GFP, pRF4]</td><td>Tavernarakis lab</td><td></td><td>동물을 20 &deg에서 유지 관리; C</td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>피지</td><td></td><td>https://fiji.sc</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,37,010</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,04,873</td><td></td></tr><tr><td>LB 액체 매체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>M9 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘 (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 (75 x 25 x 1 mm)</td><td>Marienfeld, Lauda-Koenigshofen</td><td>10 006 12</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office 2011 Excel 소프트웨어 패키지</td><td>Microsoft Corporation, Redmond, USA</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>N2; 예 [pife-2GFP; pRF4]</td> <td>Tavernarakis lab</td><td></td><td>20 &deg에서 동물 유지; C</td></tr><tr><td>N2; 예 [psod-3GFP; pRF4]</td> <td>Tavernarakis lab</td><td></td><td>20 &deg에서 동물 유지 C</td></tr><tr><td>N2; 예 [p unc-119 GFP; pRF4]</td> <td>Tavernarakis lab</td><td></td><td>20 &deg에서 동물 유지 관리; C,</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>EMD Millipore</td><td>1,06,586</td><td></td></tr><tr><td>선충 성장 배지(NGM) 한천 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 니스타틴 원액</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>N3503</td><td></td></tr>, <tr><td>펩톤</td>, <td>BD, 박토</td><td>211677</td><td></td></tr>, <tr><td>인산염 완충액</td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>EMD Millipore</td><td>1,06,40,41,000</td><td></td></tr><tr><td>한천 플레이트 준비를 위한 표준 장비(오토클레이브, 페트리 접시 등)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>웜 유지 관리를 위한 표준 장비(백금 와이어 픽, 인큐베이터 등).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>통계 분석 소프트웨어</td><td>GraphPad Software Inc., 미국</td><td></td> 샌디에이고 <td>GraphPad Prism 소프트웨어 패키지</td></tr><tr><td>스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>UV 크로스링커</td><td>Vilber Lourmat BIO-LINK BLX 254</td><td></td><td></td></tr><tr><td>웜 픽</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

caenorhabditis elegans에서 드 노보 단백질 합성 비율의 평가

Assessment of de novo Protein Synthesis Rates in Caenorhabditis elegans

건강한 프로테아메를 유지하는 것은 세포와 유기체 항상성에 필수적입니다. 단백질 번역 제어와 저하 사이의 균형의 왜곡은 연령 관련 질병의 무리를 선동. 프로테오스타증 품질 관리 메커니즘의 감소는 노화의 특징입니다. 드 노보 단백질 합성을 검출하는 생화학적 방법은 여전히 제한되어 있으며, 몇 가지 단점이 있으며 살아있는 세포 나 동물에서 수행 할 수 없습니다. 투명하고 쉽게 유전자 변형되는 Caenorhabditis elegans는 이미징 기술을 사용하여 단백질 합성 속도를 모니터링하는 훌륭한 모델입니다. 여기서, 우리는 광표백 후 형광 회복을 이용한 생체 내 드 노보 단백질 합성을 측정하는 방법을 소개하고 설명한다(FRAP). 특정 세포 또는 조직에서 형광단백질을 발현하는 형질전환 동물은 광표백의 결과로 강력한 광원에 의해 조사된다. 차례로, 형광 회복의 평가는 관심의 세포 및/또는 조직에 있는 새로운 단백질 합성을 의미합니다. 따라서, 단백질 합성 비율의 살아있는 화상 진찰과 더불어 형질 전환선색선골, 유전 및/또는 약리학적 인 내정간섭의 조합은 나이 의존적인 proteostasis 붕괴를 중재하는 기계장치에 빛을 비출 수 있습니다.

여기에 제시된 절차를 이용하여, 다음과 같은 체세포 기자, pife-22GFP, psod-3GFP 및 punc-119GFP를 표현하는 야생형 및 돌연변이 형 선충을 각각의 프로토콜에 따라 단백질 합성 율을 평가하는 데 사용되었다. 특히, ife-2 프로모터를 이용하여 체세포 조직 전반에 걸쳐 세포질 GFP를 발현하는 야생형 및 ife-2 돌연변이 벌레는 포토블리싱 직후, 5시간 후 회복 후에 비교되었다. 대표적인 이미지와 정량화는 야생형 동물이 완전히 회복되는 반면 ife-2 돌연변이체는 회복 능력을 감소시켰다는 것을보여준다(그림 1A). 따라서, 야생형 벌레는 광표백 후 드노보 단백질 생합성을 개시하는 반면, mRNA 번역 개시인 IFE-2가 부족한 ...

여기서, 우리는 선충 표백 후 선충근 및 형광 회복을 활용하여 생체 내에서 드 노보 단백질 합성을 평가하는 비방사성 및 비침습적 방법을 소개하고 설명합니다(FRAP). 이 방법은 단백질 합성의 새로운 변조기를 확인하기 위하여 유전 및/또는 약리학 스크린과 결합될 수 있습니다.

Caenorhabditis elegans에서 드 노보 단백질 합성 비율의 평가

Maintaining a healthy proteome is essential for cell and organismal homeostasis. Perturbation of the balance between protein translational control and ...

단백질 합성의 비율은 질병과 노화 도중 방해됩니다. 광표백 후 형광 회복, 또는 FRAP는 생체 내에서 단백질 합성 속도를 측정할 수 있게 한다. 우리는 GFP를 표현하는 투명한 C.elegans 벌레를 광표백 후 새로운 단백질 합성을 모니터링하는 모델로 사용합니다.당사는 다른 프로모터의 밑에 GFP를 표현하는 형질 전환 벌레를 사용하여 형광 복구를 측정하기 위하여 실제적인 지침을 제공합니다, 또는 특정 세포 또는 조직에서. 또한, 이 방법은 실시간으로 단백질 합성 속도 모니터링을 제공합니다. 해부 스테레오 현미경을 사용하여 야생 형 및 돌연변이 형 선충의 발달 단계와 성장을 평가합니다.원하는 형광 기자를 운반하는 야생형 및 돌연변이 형균 동물의 10L4 애벌레를 골라낸 선충 성장 미디어 플레이트에 E.coli로 시드를 선택합니다. 섭씨 20도의 표준 온도에서 선충을 배양하고 성장시면 됩니다. 4 일 후, 플레이트는 형질 전환 벌레의 혼합 된 인구를 포함.갓 시드된 OP50 NGM 플레이트에 각 변형의 15 L4 애벌레를 선택하고 전송합니다. FRAP 분석작업을 수행하고 성인이 된 첫날에 단백질 합성 속도를 모니터링합니다. 다음 날, 사이클로헤시미드 함유 NGM 플레이트를 양수 제어로 준비하고 사용합니다.UV 빛으로 15 분 동안 시드 NGM 플레이트를 노출하여 박테리아를 죽입니다. 식기 부피의 mL 최종 농도당 너무 500 마이크로그램의 세균 시드 플레이트 위에 사이클로헨시미드를 추가합니다. 접시가 건조하도록 허용합니다.차량 및 사이클로헤시미드 함유 플레이트에 GFP를 발현하는 트랜스제닉 선충을 이송합니다. 섭씨 20도의 표준 온도에서 2 시간 동안 동물을 배양하십시오. 1일 성인 형질전환 동물을 중앙에 20마이크로리터 OP50 드롭으로 시드된 개별 NGM 플레이트로 선택하고 옮직합니다.뚜껑을 제거하고 각 플레이트를 상피 현미경의 20H 객관적렌즈 아래에 놓습니다. 포토표백 전에 참조 이미지를 집중하고 캡처합니다. 10 분 동안 각 샘플을 표백합니다.포토표백 후 이미지를 캡처합니다. 동물을 개별 NGM 플레이트에 보관하고 복구할 수 있습니다. 상화계 에서 적어도 6시간 동안 각 형광 기자의 회복을 기록하고 기록한다.아가로즈 패드 2%를 준비하고 아가로즈 패드 의 중앙에 M9 버퍼 10 개의 마이크로 리터 드롭을 추가합니다. 팬 뉴런 세포질 GFP를 발현하는 5개의 형질선선색을 M9 버퍼의 한 방울로 옮긴다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

단백질 항상성, 스트레스 및 노화 사이의 관계를 연구하기 위해 유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 Caenorhabditis elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 기능 장애, 세포 내 단백질 국소화 및 유기체, 세포 및 단백질 수준에서의 단백질 안정성을 추적하여 단백질 접힘의 변화를 모니터링했습니다.

사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

여기에서는 선충 Caenorhabditis elegans의 배아 신장의 초기 및 후기 단계에서 발생하는 형태 생성 결함을 모니터링하기 위해 특별히 고안된 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 궁극적으로, 이러한 프로토콜은 이러한 단계를 조절하는 유전자를 식별하고 배아의 전후 축을 따라 차등 요구 사항을 특성화하도록 설계되었습니다.

소설 메트릭은 선충의 배아 신장의 특성을<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

여기에 제시 된 방법의 목표는 단백질 집계 모델 유기 체 C. 선 충에서 정상적인 노화 과정을 탐구. 프로토콜 나이 형성 하는 매우 불용 성 큰 집계를 공부 하 고 proteostasis에 변화 단백질 집계에 미치는 영향을 결정 하는 강력한 도구를 나타냅니다.

꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

여기, 선물이 편차를 줄이기 위해, 재현성, 개선 및 해석을 용이 하 게 하기 위해에서 RNA, DNA, 그리고 동일한 샘플에서 단백질의 격리에 대 한 프로토콜.

결합 된 뉴클레오티드와 꼬마 선 충 의 단백질 추출

전립선성 감소는 노화의 특징입니다, 신경 퇴행성 질환의 발병을 촉진. 우리는 형광 기자에게 융합 된 폴리 글루타민 반복의 이종 발현을 통해 두 가지 다른 Caenorhabditis elegans 조직에서 프로테오스타시스를 정량적으로 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 이 모델은 프로테오스타증의 생체 내 유전 적 분석을 빠르게 허용합니다.

Caenorhabditis 예인단에서 조직 특정 전립선 성 감소를 정량화

이 방법은 Caenorhabditis elegans 샘플 및 후속 공동 면역 침전에서 고처리량 단백질 추출물 제조를 위한 프로토콜을 설명합니다.

카노르하비티스 예르간에서 단백질 추출물 제제 및 공동 면역 침전

다음 프로토콜은 프로테오스타시스의 변화 평가로서 폴리글루타민 응집체를 정량화하기 위한 웜 배양, 형광 이미징 및 자동화된 이미지 처리를 위한 고처리량 워크플로우의 개발 및 최적화를 설명합니다.

Caenorhabditis elegans의 집계 정량화 자동화

여기에서, 선충류 예쁜꼬마선충에서의 단백질 응집 동역학의 분석을 위한 방법이 제시 된다. 연령 동기화 된 집단의 동물은 서로 다른 시점에서 이미지화되고 CellProfiler에서 반자동 포함 계수가 수행되고 AmyloFit의 수학적 모델에 적합합니다.

Caenorhabditis elegans에서 자동 포함 계수를 사용하여 생체 내에서 단백질 응집 동역학 모니터링

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

이 프로토콜은 Caenorhabditis elegans의 배아 치명률을 정량화하는 간단하고 저비용의 절차를 제공합니다. 전문 장비나 벌레 제거 전문성 없이도 집단 전체에서 배아 이상을 쉽게 감지할 수 있게 해줍니다. 이 프로토콜은 유전적 돌연변이, RNA 간섭 매개 유전자 노크다운, 식이의 효과를 정량화하는 데 사용될 수 있습니다.

Caenorhabditis elegans의 배아 치명률 정량화

배우세요 Caenorhabditis elegans에서 FRAP을 이용한 드 노보 단백질 합성 비율 측정 방법을. 실시간 모니터링과 약물 스크리닝이 가능한 비방사성 생체 내 기술입니다.

Caenorhabditis elegans에서 드 노보 단백질 합성 비율의 평가

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