Name: 자궁 에서 뇌포화에 의해 페렛 신피질에서 신경 전구 세포의 생체 포팅 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 배우세요 자궁 내 전기천공법을 이용한 페렛 태아 신피질에서 신경전구세포 표적 유전자 조작 기술입니다. 이 방법은 뇌 발달 및 신피질 확장 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리는 페렛과 J. Peychl및 빛 현미경 시설의 그의 팀을 위해 생물 의학 서비스 (BMS)의 전체 팀을 제공하는 뛰어난 지원을 위한 분자 세포 생물학 및 유전학의 막스 플랑크 연구소의 서비스 및 시설에 감사드립니다. 우리는 특히 뛰어난 수의학 지원에 대한 BMS에서 카트린 Reppe와 안나 Pfeffer와 페렛 수술을 지원하기위한 헛너 그룹에서 레이 Xing에 감사드립니다.

모든 실험 절차는 Landesdirektion Sachsen (라이센스 TVV 2/2015 및 TVV 21/2017)의 승인 후 독일 동물 복지 법규와 합의하여 수행되었습니다.
1. 자궁 전기 기화 준비
<ol><li>DNA 혼합물을 준비합니다. 이 프로토콜에서 pGFP의 1 μg/μL의 최종 농도가 사용된다. PBS에 DNA를 용해하고 시각화를 용이하게하기 위해 0.1 % 빠른 녹색으로 보충하십시오. 일단 준비되면, 위아래로 여러 번 피펫또는 손가락 두드리는하여 DNA 혼합물을 혼합. 사용 전까지 실온에 보관하십시오. 참고: coelectroporations의 경우, DNA 혼합물은 PBS에서 희석된 pGFP의 0.5 μg/μL과 함께 관심 유전자를 코딩하는 플라스미드의 1 μg/μL의 최종 농도를 포함하도록 제조된다.</li>
	<li>필요한 모든 도구와 악기로 수술 테이블을 준비하십시오.</li>
	<li>마이크로 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세 혈관을 당깁니다. 모세관팁의 직경을 조절하여 이전에 설명된41과같이 집게를 사용하여 모세관의 탈부를 차단한다.</li>
</ol>2. 수술을 위한 페렛 준비
<ol><li>구토의 리스크를 감소시키기 위하여 수술 의 앞에 적어도 3 시간 단식에 E33 단식에서 태아를 가진 임신한 질을 유지하십시오.</li>
	<li>수술 전에 자동 으로 모든 도구를 살균. 오염의 잠재적인 근원을 제거하기 위하여 무균 조건에서 특별히 할당된 방에서 수술을 수행하십시오.</li>
	<li>임신 한 질을 나르코시스 상자에 4 %의 이소플루란으로 놓습니다.</li>
	<li>마취시, 열 패드와 수술 테이블에 페렛을 배치하고 코에 일정한 2-3 %의 이소플루란 흐름과 함께 나르코스 마스크를 부착. 마취의 적절한 수준을 확인하려면 다음 반사 신경의 부족을 확인하십시오.<ol>
<li>백리오안 피부를 만져 서 팔페브랄 반사</li>
		<li>2nd와 3rd사이 피부를 꼬집는 굴곡 반사, 또는 두 뒷다리의 3rd 와 4번째 발가락</li>
		<li>팔페브랄 반사가 결석하고 굴곡 반사가 명확하게 감소되면 각 뒷다리의 발가락을 하나씩 꼬집어 통증 반사를 확인하십시오. 참고: 필요한 경우 심박수와 리듬을 모니터링하기 위해 청진기를 손에 들고 있어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>페렛을 진통제(메타미졸 0.1mL, 체중 50 mg/kg), 항생제(아모시실린+클라불란산 20 mg/kg의 체중 0.1mL/kg), 포도당(5% 포도당 용액 10mL)으로 피하한다.</li>
	<li>수술 시 눈 탈수를 방지하기 위해 눈 연고 용액을 눈에 떨어 뜨립니다.</li>
	<li>면도기로 페렛 배를 면도합니다.</li>
	<li>물과 비누로 피부를 청소하고, 70% 에탄올 스크럽으로 배를 소독하고, 요오드로 2배를 소독하고, 건조시키십시오.</li>
</ol>3. 페렛의 자궁 전기화
<ol><li>수술 부위가 멸균되었는지 확인하십시오 : 멸균 조직에 멸균 수술 도구를 배치하고 외투와 장갑을 교체하십시오.</li>
	<li>동물에 멸균 수술 커튼을 놓습니다.</li>
	<li>메스를 사용하여 ~ 5cm 길이의 컷으로 리나 알바에서 배를 수술로 엽니다.</li>
	<li>가위를 사용하여 근육 층을 잘라.</li>
	<li>절개 부위 주위에 거즈 면봉을 놓고 PBS로 적시하십시오. 거즈 면봉은 수술 중에 추가 될 추가 PBS를 흡수합니다. 참고: 수술 내내 열 및 PBS 지원을 유지합니다.</li>
	<li>페렛 자궁을 노출하고 거즈 면봉에 놓습니다.</li>
	<li>긴 로딩 팁이 있는 파이펫을 사용하여 주입 용액으로 유리 모세관을 적재합니다. 배아 의 수와 다른 실험 조건의 수에 따라 적재 부피가 약 5-20 μL 사이인지 확인합니다. 배아당 평균 주입량은 3-5 μL입니다. 로드된 유리 모세관을 홀더에 부착하고 홀더의 반대편을 튜브와 마우스피스에 연결한다.</li>
	<li>첫 번째 배아를 검사하고 머리를 찾습니다.</li>
	<li>광섬유 광원을 배아의 머리 옆에 놓아 시각화를 용이하게 합니다. 참고 : 페렛 자궁 벽은 매우 어둡고, 빛이 그들에 직접 빛나지 않는 한 그들을 통해 볼 어렵다.</li>
	<li>대뇌 반구 중 하나의 심실에 단일 심폐 소실 주입을 수행하고 내부 제어 역할을 하기 위해 다른 반구를 그대로 유지합니다. 심실 자체는 눈에 의해 쉽게 구별되지 않으므로 그 위치는 눈에 보이는 색소 홍채의 위치에 따라 추정됩니다. 정맥 내 주사는 유리 모세 혈관에 부착 된 홀더를 복용하고 유리 모세관의 끝으로 피부, 두개골 및 뇌 조직을 관통하여 수행됩니다. 참고: 뮤린 태반보다 어두운 태반을 손상시키지 않도록 하십시오.<ol>
<li>유리 모세혈관의 끝이 심실에 있을 때, 유리 모세관 홀더에 연결된 마우스피스를 사용하여 구강 배피팅을 통해 주입 용액의 약 3-5 μL을 주입한다. 주입된 용액에는 0.1% 패스트 그린이 포함되어 있기 때문에 주입된 심실은 이제 짙은 녹색으로 변하고 신장 모양의 구조로 볼 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>트위저 전극을 배아의 머리 위에 두어 양성 극이 표적화될 영역 위에 배치되도록 하고 주입된 영역 아래에 음극을 배치합니다.</li>
	<li>전기포레이터에 다음 전기기전 조건을 설정: 펄스 길이 = 50 ms; 펄스 전압 = 100 V; 펄스 간격 = 1 s; 펄스 수 = 5. 그런 다음 전기 포레이터의"펄스"버튼을 누릅니다.</li>
	<li>전자화 된 배아에 따뜻한 1x PBS의 여러 방울을 신속하게 떨어 뜨립니다.</li>
	<li>모든 배아에 대한 절차를 반복합니다. 자궁은 따뜻한 PBS로 지속적으로 젖어 두십시오. 참고: 질을 마주보고 있는 첫번째 태아가 쉽게 접근하지 않는 경우에, 그(것)들을 전기화하지 않는 것이 최선입니다.</li>
	<li>모든 배아가 전소되면 자궁을 복막 구멍에 다시 넣습니다.</li>
	<li>4-0 봉합사를 사용하여 회합으로 근육 층을 봉합합니다.</li>
	<li>동일한 두께를 사용하여 피부를 봉합하고 알루미늄 스프레이로 상처를 분사하십시오.</li>
	<li>동물을 케이지에 넣고 열원으로 따뜻하게 유지합니다. 동물이 깨어날 때까지 조심스럽게 모니터링합니다.</li>
</ol>4. 수술 후 치료 및 대상 동물의 주택
<ol><li>수술 후 3 일 동안 동물이 수술 후 치료를 받고 있는지 확인 : 20 mg / kg 아목시실린 (항생제) 매일 1 배; 25 mg/ kg 메타미졸 (진통제) 3 배 매일.</li>
	<li>페렛이 개별적으로 보관되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>페렛은 하루에 적어도 1배 의수에 의해 검사되는지 확인합니다.</li>
	<li>페렛이 배달 중에 가능한 한 적게 방해되는지 확인합니다.</li>
	<li>새끼가 짜거나 희생된 후, 자군 절제술을 위해 질을 준비한다.</li>
</ol>5. 페렛의 자군 절제술
참고: 살균된 동물을 애완동물로 입양하기 위해 기증할 수 있도록 희생된 동물의 수를 줄이기 위해 자군 절제술이 수행됩니다. 자군 절제술을 위한 외과 전 절차는 2단계에서와 동일합니다.
<ol><li>3.1 및 3.2 단계에 설명된 바와 같이 페렛 배를 면도하고 살균한다.</li>
	<li>외과적으로 라인나 알바에서 배를 엽니다. 근육 층을 잘라. 근육 층을 들어 올리고 근육 층을 완전히 열면서 손가락으로 용기를 보호하십시오.</li>
	<li>절개 부위 주위에 거즈 면봉을 놓고 멸균 PBS로 적시하십시오. 페렛 자궁과 난소를 노출하고 거즈 면봉에 놓습니다.</li>
	<li>아르테리아 바리카와 베나 바바리카 두개골을 메소바르에 리칭하여 한쪽에서 자군 절제술을 시작합니다. 결찰의 각 측면에 클램프를 넣고 클램프에 또 다른 결찰 두개골을 수행합니다. 세 번째 클램프를 결찰 끝에 부착하여 저장합니다. 다른 쪽에서 반복합니다.</li>
	<li>클램프 사이를 잘라 양쪽의 장간에서 각막 자궁을 분리합니다.</li>
	<li>두 자궁 에 arteria uterina를 타륨 자궁 자궁에 코달을 리게이트. 그런 다음 질을 리게이트하고 합자를 수정합니다. 클램프를 결찰 끝에 부착하여 저장합니다. 합자에 두 개의 클램프 두개골을 넣습니다. 클램프 사이를 잘라 질에서 자궁을 분리. 자궁과 난소를 제거하고 폐기하십시오. 자궁 엉덩이에서 잔류 점막을 긁어.</li>
	<li>나머지 클램프를 모두 분리하고 합자 끝을 줄입니다. 클램프를 제거한 후 출혈을 제어해야 합니다.</li>
	<li>3.16 및 3.17 단계에 설명된 바와 같이 근육 층과 피부를 봉합합니다. 3.18 및 4.1-4.3 단계와 같이 수술 후 프로토콜을 따르십시오. 동물 시설에 동물을 정기적으로 수의방문으로 2주 이상 보관하십시오. 동물이 완전히 회복되면 입양을 위해 기증 할 수 있습니다.</li>
</ol>

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페렛의 자궁 전기포화는 다른 방법에 대하여 장점과 단점을 갖는 중요한 기술이다. 이 방법에는 중요한 단계와 제한사항뿐만 아니라 잠재적 수정 및 향후 응용 프로그램을 염두에 두어야 합니다.
전기기또는,바이러스주사(35,42, 43)를통해 산후 페렛 신생아의 유전자 조작에 대한 빅터 보렐과 동료들의 선구적인 작업 이후, 페렛은 유전적으로 접근할 수 있는 모델 유기체가 되었다.,43 자궁 전분19을통해 배아 발달 중 유전자 조작을확립하고,20은 초기 발달 단계에서 신경 전구 세포를 표적으로 함으로써 새로운 연구 가능성을 열어주었습니다. 산후 조작에 비해, 자궁 전기포기에서 신피질의 더 큰 영역과 신피질의 다른 모든 ...

신피질은 포유류 뇌의 외부 시트와 더 높은 인지 기능1,,2,,3,,4,,5의시트이다. 배아 발달 중 생체 내에서 포유류 신피질에서 급성 유전적 조작을 달성하기 위해 바이러스 감염6 및 자궁전기기전7의두 가지 방법이 탐구되었다. 두 방법 모두 신구 세포의 효율적인 타겟팅을 허용하지만 몇 가지 제한으로 고통받습니다. 바이러스 감염에 비해 자궁 전기 포기의 주요 장점은 전기장의 방향을 조절하여 달성되는 신피질 내의 공간 특이성을 달성 할 수있는 능력입니다.
전기기는 시험관내 8에서세포로 DNA의 입력을 용이하게 하기 위해 처음 표시되었기 때문에, 생체 내에서 다양한 척추동물로 DNA를 전달하기 위해 적용되었다. 발달 신경과학에서, 마우스 신피질의 자궁 전기포기에서 2001년9,,10에서처음 보고되었다. 이 방법은 배아 뇌의 측면 심실에 DNA 혼합물을 주입하고 공간 정밀도7,,11을허용하는 트위저 전극을 사용하여 전기장의 후속 적용으로 구성된다. 자궁에서 전기화는 마우스 신피질에 내인성 또는 외토적으로 추가된 유전자의 발현을 조작하기 위해 핵산을 전달하기 위해 적용되었다. 중요한 진전은 최근에 마우스 신피질에서 자궁 전기화에서 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집의 방법론을 적용하여 (1) 후미토성뉴런(12,,13 및 신경 전구 세포14)및 (2) 게놈15 및 후성 유전체16 편집에서 유전자 중단을 수행하였다.
마우스에서 첫 번째 보고 후 곧, 자궁 에서 전기기화배쥐신피질(17,18)에18적용되었다. 비 설치류는 2012년19일,20일,20일, 작은 육식신페레의 자궁 전기기화에서 최초로 보고되기 전까지는어려움을유지했다. 그,이후, 페렛의 자궁 전기포기는 신경 전구및 뉴런(20,21,,22,,23)을라벨링하여 신피질 개발의 메커니즘을 연구하기 위해 적용되었으며, CRISPR/Cas9기술(24)의사용을 포함한 내인성 유전자의 발현을 조작하고, 자궁 내피유전자(21,22, 25)및 자궁내피유전자 를2121,22,25,인간 유전자를 전달함으로써26.26 더욱이, 페렛의 자궁 전기포공은 병리학적조건(27,,28)에서인간 신피질 발달의 특징을 해결하기 위해 사용되어 왔다.
신피질 발달의 맥락에서, 페렛을 마우스에 비해 모델 유기체로 사용하는 장점은 페렛이 인간과 같은 일련의 특징을 더 잘 재구성하기 때문입니다. 해부학 적 수준에서, 페렛은 인간및 대부분의 다른 영장류에도 존재하지만, 쥐 또는쥐에완전히 결석피질 접이식의 특징적인 패턴을 나타낸다4,29,,30,,31. 조직학적 수준에서 페렛은 내부 및 외부 지하 영역(ISVZ 및 OSVZ)으로 지칭되는 두 개의 뚜렷한 심실 발아 영역을 가지며,32,,33,내부섬유층(23)에의해 분리된다. 이러한 특징은 또한 인간을 포함하여 영장류와 공유되지만 마우스(34)는공유되지 않습니다. 페렛과 인간에서 ISVZ와 OSVZ는 풍부한 신경 전구 세포로 채워지며, 마우스의 하위 원반 영역 (SVZ)은 스파스 신경전구만 포함하는반면,32,,35,,36. 세포 수준에서, 페렛은,포유류 신피질34,,37,38의진화적 확장을 위한 도구로 간주되는 기저 또는 외부 방사형 glia(bRG 또는 oRG)라고 불리는 신경 전구체의 하위 형의 높은 비율을 나타낸다. bRG는 태아 인간 및 배아 페렛 신피질에서 이렇게 높게 풍부하지만 배아 마우스신피질(35,,36)에서는매우 드물다. 더욱이, 페렛 bRG는 마우스bRG(21)보다훨씬 우수한 인간 bRG와 유사한 형태학적 이질성을 나타낸다. 마지막으로, 분자 수준에서, 페렛 네오피질개발은 피질 접이식의 발달을 조절할 것으로 추정되는 태아 인간 신피질의 유전자 발현 패턴을 매우 유사하다는 것을나타낸다( 39).
페렛 bRG의 세포 생물학적 및 분자 특성은 인간 bRG와 유사한 매우 증식성 렌더링합니다. 이것은 확장되고 매우 복잡한 신피질34의뉴런 생산 및 개발의 증가 생산 결과. 이러한 특성은 페렛이마우스(26,,40)에서모델링할 수 없는 신피질 발달의 인간과 같은 특징을 연구하기 위한 우수한 모델 유기체를 만든다. 페렛을 모델 유기체로서 최대한 활용하기 위해 제시된 방법이 개발되었다. 그것은 유비쿼터스 프로모터, CAG의 통제하에 GFP (pGFP)를 표현하는 플라스미드를 가진 E33 페렛 배아의 자궁 전기화로 이루어져 있습니다. 전극배는 배아 또는 후산적으로 분석될 수 있다. 희생된 동물의 수를 줄이기 위해 여성 페렛(질)은 자군 절제술에 의해 살균되어 애완동물로 입양하도록 기부됩니다. 표적 배아가 배아 단계에서 수확되는 경우, 두 번째 수술이 수행되고 태아는 제왕 절개에 의해 제거되는 반면 질은 히스테리화됩니다. 표적 배아가 산후 단계에서 분석되는 경우, 새끼가 짜거나 희생된 후 질은 히스테리화됩니다. 따라서, 질의 자군 절제술에 대한 프로토콜도 제시된다.

<table><tbody><tr><td>1ml 주사기</td><td>BD</td><td>309628</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>4-0 Vicryl 봉합</td>사 <td>Ethicon</td><td>V392ZG</td><td></td></tr><tr><td>수술 알루미늄 스프레이</td><td>cp-pharma</td><td>98017</td><td>수술</td></tr><tr><td>Amoxicilin+clavulanic acid (Synulox RTU)</td><td>WDT</td><td>6301</td><td>수술</td></tr><tr><td>Cappilary 홀더</td><td>WPI</td><td>MPH6S12</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>덱스판테놀 연고 용액</td><td>바이엘</td><td>6029009.00.00</td><td>수술</td></tr><tr><td>드레이프 시트 45x75cm</td><td>Hartmann</td><td>2513052</td><td>수술</td></tr><tr><td>전극 핀셋, 백금 도금 5mm</td><td>BTX</td><td>45-0489</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>흰 족제비 Mustela putorius furo</td><td>Marshall</td><td>NA</td><td>실험 생물</td></tr><tr><td>광섬유 광원</td><td>올림푸스</td><td>KL1500LCD</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>집게</td><td>Allgaier instrumente</td><td>08-033-130</td><td>수술</td></tr><tr><td>겸자 3C-SA</td><td>Rubis Tech</td><td>3C-SA</td><td>수술</td></tr><tr><td>겸자 55</td><td>Dumostar</td><td>11295-51</td><td>수술</td></tr><tr><td>겸자 5-SA</td><td>루비스 테크</td><td>5-SA</td><td>수술</td></tr><tr><td>거즈 면봉 대형</td><td>Hartmann</td><td>401723</td><td>수술</td></tr><tr><td>거즈 면봉 소형</td><td>Hartmann</td><td>401721</td><td>수술</td></tr><tr><td>GFAP 항체</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td>항체</td></tr><tr><td>GFP 항체</td><td>Aves labs GFP1020</td><td></td><td>항체</td></tr><tr><td>유리 캡슐 (필라멘트가있는 붕규산 유리, OD : 1.2mm, ID : 0.69mm, 길이 10cm)</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF120-69-10</td><td>전기천공법</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Bela-pharm</td><td>K4011-02</td><td>수술</td></tr><tr><td>히트 패드</td><td>Hans Dinslage</td><td>Sanitas SHK18</td><td>수술</td></tr><tr><td>요오드(베타딘 용액 100mg/ml)</td><td>Meda</td><td>997437</td><td></td></tr><tr><td>Surgery Isofluran</td><td>CP</td><td>21311</td><td>수술</td></tr><tr><td>로딩 팁 20&micro; l</td><td>Eppendorf</td><td>#5242 956.003</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>Metamizol</td><td>WDT</td><td>99012</td><td></td></tr><tr><td>Surgery Metzenbaum 해부 가위</td><td>Aesculap</td><td>BC600R</td><td>수술</td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>셔터 기기</td><td>모델 P-97</td><td>Electroporation</td></tr><tr><td>pCAGGS-GFP</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Kalebic et al., eLife, 2018</td></tr><tr><td>PCNA 항체</td><td>Millipore</td><td>CBL407</td><td>항체</td></tr><tr><td>pH3 항체</td><td>Abcam</td><td>ab10543</td><td>항체</td></tr><tr><td>메스</td><td>Aesculap</td><td>294200104</td><td>수술</td></tr><tr><td>면도기</td><td>Braun</td><td>EP100</td><td>수술</td></tr><tr><td>Sox2 항체</td><td>R+D Systems</td><td>AF2018</td><td>항체</td></tr><tr><td>수술 클램프 13cm</td><td>WDT</td><td>27080</td><td>수술</td></tr><tr><td>외과용 더블 스푼(Williger)</td><td>WDT</td><td>27232</td><td>수술</td></tr><tr><td>수술용 드레이프</td><td>WDT</td><td>28800</td><td>수술</td></tr><tr><td>수술용 가위 소형</td><td>FST</td><td>14090-09</td><td>수술</td></tr><tr><td>봉합 바늘 홀더</td><td>Aesculap</td><td>BM149R</td><td>수술</td></tr><tr><td>Tbr2 항체</td><td>Abcam</td><td>ab23345</td><td>항체</td></tr><tr><td>전달 피펫 3ml</td><td>Fischer 과학</td><td>13439108</td><td>수술</td></tr><tr><td>수조</td><td>Julabo</td><td>TW2</td><td>수술</td></tr></tbody></table>

자궁 에서 뇌포화에 의해 페렛 신피질에서 신경 전구 세포의 생체 포팅

In Vivo Targeting of Neural Progenitor Cells in Ferret Neocortex by In Utero Electroporation

배아 발달 중 생체 내에서 유전자 발현의 조작은 포유류 발달 중 개별 유전자의 역할을 분석할 때 선택하는 방법입니다. 자궁에서 전기화는 생체 내에서 배아 포유류 뇌에서 유전자 발현의 조작을 위한 핵심 기술이다. 페렛의 배아 신피질의 자궁 전포화, 작은 육식 생물에 대한 프로토콜이 여기에 제시된다. 페렛은 신피질 발달을 위한 모델로 점점 더 이용되고 있습니다, 그것의 신피질은 인간과 비인간적인 영장류에 또한 존재하는 해부학, 조직학, 세포 및 분자 특징의 시리즈를 전시하기 때문에, 마우스 또는 쥐와 같은 설치류 모형에 없습니다. 자궁에서 전기기는 배아일(E) 33, 페렛의 중증 신경 발생 단계에서 수행되었다. 자궁 전기기는 뇌의 측면 심실을 안감 신경 전구 세포를 대상으로합니다. 신경 발생 하는 동안, 이러한 전조 세포 다른 모든 신경 세포 유형을 발생. 본 작품은 E37, 산후일(P) 1 및 P16에서 의대표적인 결과 및 분석을 나타내며, 자궁 전기기화에서 각각 4, 9, 24일에 대응하는 것을 나타낸다. 초기 단계에서, 표적으로 한 세포의 자손은 각종 신경 선조 아형의 주로 이루어져 있는 반면, 나중에 대부분의 표지된 세포는 포스트 미토틱 뉴런입니다. 따라서, 자궁 에서 전기화는 다양한 유형의 신경 세포의 세포 및 분자 특징에 대한 유전 조작의 효과에 대한 연구를 가능하게한다. 다양한 세포 집단에 미치는 영향을 통해 자궁 전기 기화에서도 페렛 신피질의 조직학적 및 해부학적 특징을 조작하는 데 사용할 수 있습니다. 중요 한 것은, 이러한 모든 효과 급성 및 사용자에 의해 결정 된 지 각 측성 특이성으로 수행.

E33에서 페렛의 자궁 전기포공에서 배아 네오피질의 심실 표면을 일렬로 세우는 신경 전구 세포의 표적화(도1). 이 세포는 apical 선조에게 불리고 발달 도중 그밖 모든 세포 모형을 초래하는 높게 증식합니다. 비대칭 분열시, apical 전구는 또 다른 정포 선조와 더 분화된 세포, 일반적으로 심실 표면에서 분리된 기저 선조(BP)를 생성했습니다. BP는 보조 발아 영역인 SVZ로 마이그레이션되었습니다. E33에서 전기포이션이 수행되었을 때 많은 신생아 BP가 SVZ의 기저 부로 이동하여 OSVZ22를형성했습니다.
4일 후 E37에서 전기기질의 효과를 조사했을 때, 표적 세포와 자손의 대부분은 발아 영역(VZ, ISVZ 및 OSVZ, 그림 2A참조)에 남아 있었고 세포는 피질 판(CP)에서 더 유저로 더 많이 존재하지 않았다. ...

여기에 제시된 자궁 전기화에서 사용하는 배아 페렛 뇌에서 유전자 조작을 수행하는 프로토콜이 있다. 이 방법은 생체 내의 신피질에서 신경 전구 세포를 표적으로 하는 것을 허용합니다.

Manipulation of gene expression in vivo during embryonic development is the method of choice when analyzing the role of individual genes during mammalian ...

이 프로토콜은 우리가 개발 중인 신피질의 확장 및 접이식을 연구할 수 있는 중요한 동물 모형에 있는 생체내 유전 조작을 능력을 발휘할 수 있게 합니다. 이 방법의 주요 장점은 뇌 발달을위한 핵심 세포 유형인 신경 줄기 세포를 대상으로 높은 공간 및 현세적 특이성을 사용하는 것입니다. 절차를 시작하기 전에, 마이크로 파이펫 풀러에 유리 모세 혈관을 당기고 모세관팁의 직경을 조정하기 위해 모세관의 탈부분을 잘라 집게를 사용합니다.배아 당일 33일에는 PBS에서 DNA의 적절한 농도를 추가하여 부드러운 혼합으로 0.1%의 패스트 그린을 보충하고, 3시간 금식, 마취, 임신한 여성 페렛을 열패드가 있는 수술 대에 놓습니다. 관동맥 피부를 만지고 두 번째와 세 번째 또는 세 번째 및 네 번째 발가락 사이의 피부를 꼬집어 두 뒷사지의 적절한 수준의 침전을 확인하십시오. 이소플루란은 메스꺼움과 현기증을 포함한 부작용을 일으킬 수 있습니다.액체 형태로 이소플루란을 취급할 때는 보호 장비를 사용하십시오. 수술 중에 적절한 캐니스터를 사용하여 가스를 포획하십시오. 진통제, 항생제 및 포도당으로 동물을 피하시키고 동물의 눈에 연고를 놓습니다.클리퍼를 사용하여 복부를 면도하고 노출 된 피부를 물, 비누 및 요오드 용액으로 청소하십시오. 그런 다음 거즈 면봉으로 피부를 건조시키고 알코올과 요오드 스크럽으로 소독하십시오. 자궁 전기포이션의 경우, 동물 위에 멸균 드레이프를 놓고 메스를 사용하여 리나 알바에서 약 5센티미터의 피부 절개를 합니다.가위를 사용하여 근육 층을 잘라 절개 부위 주위에 거즈 면봉을 놓습니다. 거즈를 PBS로 적시고 자궁을 면봉에 놓습니다. 긴 팁이 있는 파이펫을 사용하여, 주입될 태아 당 DNA 용액 5 마이크로리터를 가진 당겨진 유리 모세혈관 중 하나를 적재한다.로드된 모세관을 홀더에 부착하고 홀더의 다른 면을 튜브와 마우스피스에 연결합니다. 첫 번째 배아의 머리를 찾아 머리 옆에 광섬유 광원을 놓습니다. 안료 홍채를 기준점으로 사용하여, 유리 모세관의 끝으로 피부, 두개골 및 뇌 조직을 관통하고 구강 파이프팅을 사용하여 주사 용액의 3-5 마이크로리터를 대뇌 반구 중 하나의 심실로 전달합니다.주입된 용액에는 0.1%의 빠른 녹색이 포함되어 있기 때문에 성공적인 주사로 인해 주입된 심실의 짙은 녹색 얼룩이 발생하여 이제 신장 모양구조로 볼 수 있습니다. 주사 후, 주사 부위 아래에 표적화될 영역 위에 양성 극을

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

E16 랫 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

E15 마우스 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

개발 뇌 마우스로 유전자 전송 방법은 고유한 수술 방법과 전극의 특별한 모양을 사용하여 설명합니다. 이 독특한 기술은 두뇌 개발을 공부에 많은 도움이됩니다 neuroscientists temporally과 공간 플라스미드 DNA의 transfection 수 있습니다.

마우스 Utero에 Electroporation : 통제 Spatiotemporal 진 Transfection

pial 표면은 증가 주목을 받고 CNS에서 독특한 전구 영역입니다. 여기서, 세부 사항보기 개질 전기 천공 법을 사용하여이 시조 존의 급격한 유전자 조작 방법을 우리. 이 절차는 세포 계통 및 세포 분화에 관련된 신호 전달 경로의 세포 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다와 딸 세포의 운명과 특성을 설명하기 위하여.

신생아 Pial 표면 에레

이 절차는 자궁 내 전기천공법을 통해 발달 중인 마우스 전뇌의 인터뉴런을 표적으로 삼는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 피질의 표재층으로 향하는 중간뉴런 아형에서 선택적 유전자 발현을 달성하는 데 특히 효율적이었습니다.

두피의 interneurons의 하위 유형 선택적 일렉트로

이 프로토콜은 자궁 내 전기천공법을 통해 C57BL/6 중추신경계의 다른 영역을 구체적으로 transfection하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에는 피질, 해마, 시상, 시상하부, 외측 중격 핵 및 선조체로 발달하는 영역의 형질주입에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

이 논문은 단일 세포 수준과 형광 표지 된 뉴런의 흥분성 뉴런의 연결 구조를 설명하는 자궁 전기 (IUE)에서 사용하는 프로토콜을 제공한다. 조직학은 수지상 및 축삭 돌기를 특성화하는 데 사용됩니다. 급성 슬라이스 전체 셀 기록 흥분성을 조사하기 위해 사용된다.

자궁 내 일렉트로는 신경 세포의 부분 집단의 흥분 및 단일 세포의 연결을 연구에 접근

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

여기에서는 전기천공법에 의한 절쇄된 인간 피질 오가노이드의 급성 유전자 조작을 제시합니다. 이러한 피질 오가노이드 모델은 절단 후 심실과 같은 구조를 쉽게 식별할 수 있기 때문에 특히 주입이 용이하여 인간의 피질 발달, 신경 발달 장애 및 피질 진화에 대한 기능적 연구를 가능하게 합니다.

유전자 기능 연구를 위한 sliced human cortical organoids의 Electroporation

배우세요 자궁 내 전기천공법을 이용한 페렛 태아 신피질에서 신경전구세포 표적 유전자 조작 기술입니다. 이 방법은 뇌 발달 및 신피질 확장 메커니즘 연구에 활용됩니다.

자궁 에서 뇌포화에 의해 페렛 신피질에서 신경 전구 세포의 생체 포팅

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