시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

마우스 분석법과 뉴런 분화는 신경 발생과 관련된 주요 메커니즘을 설명하기 위한 훌륭한 모델입니다. 우리는 회사 toro 스크리닝 전략을 사용하여 배아 신경 발생에 최적화된 방법을 보여줍니다. 이 기술은 고효율, 저비용 및 쉬운 조작의 장점을 가지고 있으며 실험실의 대중화에 적합합니다.

신경 과학 연구를 위한 강력한 도구입니다. 프로토콜 1을 사용하여 분화를 수행하기 위해 2밀리리터의 기초 분화 배지에 있는 20, 000개의 마우스 배아 줄기세포를 0.1%젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰에 파종합니다. 세포 부착 후 2ml의 PBS로 세포를 세척하고 각 웰에 2ml의 기저 분화 배지를 추가한 다음 세포를 다시 인큐베이터에 넣습니다.

세포가 8일 동안 분화하도록 하고 2일마다 배지를 교체합니다. 프로토콜 2를 수행하기 위해 150만 개의 마우스 배아 줄기세포를 10ml의 기저 분화 배지에 있는 비접착성 박테리아 접시에 추가하고 플레이트를 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 배양하여 배아체 형성을 가능하게 합니다. 이틀 후 세포 응집체를 15ml 원심분리기 튜브로 옮기고 중력에 의해 침전되도록 합니다.

상층액을 제거하고 10ml의 새로운 기저 분화 배지를 첨가하여 배아체를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 접착력이 없는 새 접시에 다시 심고 이틀 더 배양합니다. 웰당 2밀리리터의 기초 분화 배지에 있는 약 50개의 배아체를 모아 젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트에 파종합니다.

레티노산 유도의 경우, 각 웰에 2마이크로리터의 RA 스톡을 1마이크로몰의 최종 농도까지 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 4일 동안 더 세포를 분화합니다. 프로토콜 3을 사용하여 분화를 수행하려면 프로토콜 2를 반복하되 배아 형성에 2일, RA 유도에 6일만 허용합니다.

배아체 형성의 품질 관리는 현미경을 사용하여 수행해야 합니다. 밝은 코어를 가진 사람들만이 후속 과정에서 성공적으로 구별할 수 있습니다. 프로토콜 4의 경우, 웰당 20, 000개의 마우스 배아 줄기세포를 젤라틴으로 코팅된 플레이트에 시딩하고 프로토콜 1을 따릅니다.

세포가 4일 동안 분화하도록 한 후 모든 트랜스 RA 스톡을 2마이크로리터씩 각 웰에 넣고 플레이트를 다시 4일 동안 배양합니다. 프로토콜 5를 수행하려면 프로토콜 4를 반복하되 분화 이틀 후에 RA 유도를 시작합니다. 프로토콜 6의 경우, 150만 개의 줄기세포를 10밀리리터의 N2B27 배지 2에 담긴 비접착성 박테리아 접시에 심고 플레이트를 섭씨 37도에서 배양 5%로 배양하여 배아체를 형성합니다.

2일 후, 앞서 설명한 대로 세포 응집체를 수집하고 10ml의 신선한 N2B27 배지 2로 배아체를 다시 현탁시킵니다. 새로운 비접착성 박테리아 접시에 다시 심고 이틀 더 구별하십시오. 넷째 날에는 웰당 약 50개의 배아체를 수집하여 2밀리리터의 N2B27 배지 2가 있는 젤라틴으로 코팅된 6개의 웰 플레이트에 파종합니다.

모든 트랜스 RA 스톡을 2마이크로리터씩 각 웰에 넣고 4일 동안 분화를 유도합니다. 프로토콜 7을 수행하려면 웰당 2밀리리터의 기초 분화 배지에 약 20,000개의 세포를 젤라틴으로 코팅된 플레이트에 파종합니다. 세포 부착 후 PBS로 2회 세척한 후 각 웰에 2ml의 N2B7 배지를 2개씩 첨가하고 세포가 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 8일 동안 분화할 수 있도록 합니다.

프로토콜 3을 사용하여 1상 분화를 수행한 후, 웰당 2ml의 기초 분화 배지에 약 500, 000개의 마우스 배아 줄기 세포 유도체를 0.1% 젤라틴 코팅된 플레이트에 파종합니다. 3상, 2상 분화 프로토콜을 테스트하기 위해 파생 상품을 3개 그룹으로 무작위로 나눕니다. 플레이트를 6시간 동안 배양한 다음 PBS 2ml로 세포를 두 번 세척하고 프로토콜에 따라 각 웰에 2ml의 기저 분화 배지 N2B27 배지 1 또는 N2B27 배지 2를 추가합니다.

블레이드를 인큐베이터에 넣고 세포가 10일 동안 더 분화하도록 하고 2일마다 해당 배지를 교체합니다. 일반적인 전구세포 또는 NPC에서 마우스 배아 줄기 세포의 분화를 위한 최적의 프로토콜을 결정하기 위해 7개의 프로토콜이 테스트되었습니다. 프로토콜은 A2lox lock과 129개 세포 모두에서 테스트되었으며 광학 현미경을 사용하여 각 그룹의 분화 상태를 모니터링했습니다.

대부분의 A2lox 및 129 유도체는 프로토콜 3에서 NPC의 형성을 나타내는 잘 쌓인 중성석과 같은 형태를 보여주었습니다. 그러나 프로토콜 2를 사용하여 분화된 세포는 배아사멸(apoptotic)으로 나타났는데, 이는 배아체 내 영양분 부족에 기인할 수 있습니다. NPC의 형성을 추가로 확인하기 위해 면역형광 분석을 사용하여 nestin-positive 세포를 검출했습니다.

프로토콜 3은 A2lox 및 129 유도체에서 각각 최대 78 및 69%에 이르는 가장 높은 네스틴 양성 세포의 비율을 보였습니다. NPC를 뉴런으로 분화하기 위해 세 가지 프로토콜이 테스트되었습니다. 프로토콜 3이 분화를 가장 효과적으로 유도하는 것으로 확인되었습니다.

2상 프로토콜 3에서 대부분의 A2lox 및 129 유도체는 투명한 신경돌기와 세포체 확장을 가진 연장된 뉴런 유사 구조를 가지고 있었습니다. 면역형광 분석은 프로토콜 3을 사용하여 A2lox에서 각각 최대 68 및 59%의 베타 튜불린 양성 세포와 129개의 유도체를 가진 뉴런의 생성을 추가로 확인했습니다. 이 절차를 시도할 때 분화 전에 마우스 분석이 건강하고 분화가 되지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다.

또한, 보어 아웃 본체의 형성 후와 2단계 분화 전에 엄격한 품질 관리를 수행해야 합니다. 이 기술은 신경생물학 및 발달 생물학 연구자에게 표준 모델을 제공하며 신경 발생과 관련된 주요 메커니즘을 설명하기 위한 강력한 도구가 될 것으로 예상됩니다.