Name: 시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 배우세요 마우스 배아 줄기 세포에서 신경 세포로 분화하는 최적화된 시험관 내 방법을. 이 기술은 효율적이고 비용 효과적이며 신경 발생 연구에 강력한 도구입니다.

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이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(31501099호)과 중국 후베이성 교육부중장기 및 영(No. 20191104년). 그리고, 우리는 마우스 배아 줄기 세포주 A2lox를 제공하는 우한 과학 기술 대학의 웬성 덩 교수에게 감사드립니다.

1. 마우스 배아 줄기 세포 배양
<ol><li>0.1% 젤라틴 코팅 세포 배양 접시 또는 접시를 준비하십시오.<ol>
<li>멸균 된 0.1 % 젤라틴 (물에서 0.1 % w / v)의 2 mL을 60mm 세포 배양 접시에 추가하십시오. 셀 배양 접시의 코팅도 보장하기 위해 부드럽게 흔들어.</li>
		<li>37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 접시를 넣고 1시간 동안 코팅할 수 있습니다.</li>
		<li>세포를 파종하기 전에 0.1% 젤라틴 용액을 제거합니다. 참고: 젤라틴을 제거한 후에는 코팅된 접시를 말리거나 씻을 필요가 없습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스 배아 줄기 세포 (A2lox 및 129) 배양<ol>
<li>인큐베이트 mESC(A2lox 및 129) 세포에서 0.1% 젤라틴 코팅 60 mm 세포 배양 식 에서 mESC 성장 배지에서 37°C에서 각각 5%CO2 인큐베이터에. mESC 성장 매체는 85% 노크 아웃 DMEM/F12, 15% 녹아웃 세럼 교체(KSR), 0.1mM β-메르카토에탄올(2ME), 2mM 글루타맥스, 1% 비필수 아미노산 (NEAA), 1 % 페니실린 / 연쇄 상피신 (P / S), 1000 U / mL 백혈병 억제 인자 (LIF), 10 nM CHIR-99021 (GSK-3 억제제) 및 0.33 nM PD032590 (MEK 억제제). 주의: β-메르카토에탄올은 인화성이며 흡입 독성이 있습니다. 화재 원인에서 멀리 하고 사용 시 흡입을 피하기 위해 마스크를 착용하십시오.</li>
		<li>A2lox와 129의 더 나은 성장을 위해 매일 mESC 성장 매체를 변경합니다.</li>
		<li>세포가 80%에 도달하면 배지를 제거하고 접시에 0.1% 트립신1mL을 추가합니다. 모든 셀에 트립신의 커버를 보장하기 위해 부드럽게 30 s에 대한 바위.</li>
		<li>약 1 분 동안 세포를 두고 트립신이활성화한 다음 1 mL 파이펫을 사용하여 트립신을 제거하십시오.</li>
		<li>접시에 mESC 성장 배지 2mL을 추가하고, 파이펫을 여러 번 위아래로 사용하여 단일 셀 서스펜션을 만듭니다.</li>
		<li>혈종계를 사용하여 현탁액내 의 세포 밀도를 가능한 한 정확하게 계산합니다.</li>
		<li>세포를 7그룹으로 나누고 표 1에표시된 다른 프로토콜을 사용하여 분화를 유도한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. MESC에서 NPC로의 차별화 (1단계)
<ol><li>0.1% 젤라틴 코팅 세포 배양 플레이트 또는 커버립을 준비합니다.<ol>
<li>사용하기 전에 1.1 단계에서와 같이 0.1 % 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트 또는 커버립을 준비하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜 1을 사용하여 단계 I 분화(표 1)<ol>
<li>약 2 x 104 mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL에 씨를 뿌리고 0.1 % 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에서 잘 합니다. 현미경의 밑에 세포 조밀도를 확인하십시오.</li>
		<li>부착을 허용하기 위해 6h에 대해 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 세포를 배양한다.</li>
		<li>부착 후 인큐베이터에서 세포를 꺼내 PBS 2 mL로 두 번 씻어 내십시오.</li>
		<li>기초 분화 배지I(표 1)의2mL을 각 웰에 넣고 세포를 인큐베이터에 다시 넣습니다.</li>
		<li>8 일 동안 분화를 위해 세포를 둡니다. 2일마다 기저 분분 매체 I를 교체하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜 2를 사용하여 단계 I 분화(표 1)<ol>
<li>1.5 x 106 mESC를 기초 분화 배지 10mL에 첨가하여 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배아 체형성을 허용합니다.</li>
		<li>2 일 후, 15 mL 원심 분리 튜브로 세포 응고를 전송하고 중력에 의해 정착할 수 있습니다.</li>
		<li>상체를 제거하고 신선한 기초 분화 배지 10mL를 추가하여 배아 체를 재보습합니다. 새로운 미각 세균 성 접시에 그들을 심고 또 다른 2 일 동안 차별화를 허용.</li>
		<li>현미경(도 2A)하에서배아체의 형성을 확인한다.</li>
		<li>단계 2.3.2-2.3.3에 설명된 바와 같이 배아 체를 수집한다. 약 50개의 배아체를 기초 분화 배지의 2mL로 약 50개의 배아체를 잘 하여 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 시드한다.</li>
		<li>1mM 올트랜스 RA 스톡(DMSO)을 준비하고 서브 패키징 후 -80°C 냉동고에 빛으로부터 멀리 보관하십시오. 참고: RA는 불안정하며 RA 재고를 준비하는 동안 빛을 멀리하고 공기 접촉을 줄이는 데 주의를 기울여야 합니다.</li>
		<li>RA 유도의 경우, RA 스톡 2μL을 각 웰에 추가하여 1 μM의 최종 농도를 만듭니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에 넣고 또 다른 4일 동안 분화한다.</li>
		<li>2일마다 기초 분화 매체 I(1 μM RA)의 전체 2mL를 변경합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜 3을 사용하여 단계 I 분화(표 1)<ol>
<li>식물 1.5 x 106 mESC는 10mL의 기초 분화 배지에서 미적 세균 성 접시에 들어가면 5 % CO2 인큐베이터에서 37 °C에서 배아 체 형성을 위해 2 일 동안 둡니다.</li>
		<li>현미경(도 2B)하에서배아체의 형성을 확인한다.</li>
		<li>세포 응집체를 15mL 원심분리기 튜브로 옮기고 중력에 의해 정착하게 합니다.</li>
		<li>상체를 조심스럽게 제거하고 신선한 기초 분화 매체 10 mL을 추가하여 다시 일시 중단합니다.</li>
		<li>약 50개의 배아체를 기초 분화 배지 의 2mL로 약 50개의 배아체를 잘 하여 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 시드한다.</li>
		<li>RA 유도의 경우, RA 스톡 2μL을 각 웰에 추가하여 1 μM의 최종 농도를 만듭니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에 넣고 6일 동안 분화한다. 전체 기저 분분 매체 I(1 μM RA)를 2일마다 변경합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜 4를 사용하여 단계 I 분화(표 1)<ol>
<li>약 2 x 104 mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL 내에서 종자 0.1% 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 잘. 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>부착 후 PBS 2mL로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 각 웰에 2mL의 기초 분화 배지 I를 추가하고 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 4일 동안 분화를 허용한다.</li>
		<li>RA 유도의 경우, 각 우물(작동 농도는 1 μM)에 2 μL의 모든 트랜스 RA 스톡을 추가하여 또 다른 4일 동안 분화를 유도합니다.</li>
		<li>전체 공정에서 2일마다 전체 매체를 교체하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜 5를 사용하여 단계 I 분화(표 1)<ol>
<li>약 2 x 104 mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL 내에서 종자 0.1% 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 잘. 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>PBS의 2mL로 세포를 두 번 씻으시면 됩니다. 각 웰에 2mL의 기초 분화 배지 I를 추가하고 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 2일 동안 분화를 허용한다.</li>
		<li>후속 RA 유도의 경우, 각 우물에 2 μL의 RA 스톡을 추가하여 1 μM의 최종 농도를 만듭니다. 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 배치하여 또 다른 6일 동안 분화를 유도한다.</li>
		<li>전체 공정에서 2일마다 전체 매체를 교체하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜 6을 사용하여 단계 I 분화(표 1)<ol>
<li>식물 1.5 x 106 mESC는 배아 체 형성을 허용하기 위해 N2B27 중간 II(표 1)의10 mL에서 미적 세균 성 접시에 들어간다.</li>
		<li>2일째에, 2.3.2-2.3.3 단계에 설명된 바와 같이 세포 응집체를 수집하고 신선한 N2B27 배지 II의 10mL를 사용하여 배아 체를 재연한다.</li>
		<li>새로운 미동세균 접시에 이식하고 37°C에서 5%CO2 인큐베이터에서 2일 동안 분화를 허용한다. 현미경의 밑에 태아 바디의 대형을 확인하십시오.</li>
		<li>4일째되는 날, 배아시체를 수집합니다. N2B27 배지 II의 2mL를 가진 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 잘 당 약 50개의 배아 체를 시드한다.</li>
		<li>모든 트랜스 RA 스톡 2 μL을 각 우물에 넣고 또 다른 4일 동안 분화를 유도합니다. 전체 배지(N2B27 배지 II를 1μM RA로)를 2일마다 교체합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>프로토콜 7을 사용하여 단계 I 분화(표 1)<ol>
<li>약 2 x 104 mESC를 기초 분화 배지 의 2 mL 내에서 종자 0.1% 젤라틴 코팅 6 웰 플레이트에 잘. 플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>PBS로 셀을 두 번 씻으시면 됩니다. 이어서, N2B27 배지 II의 2mL를 각 웰에 추가하고 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 8일 동안 분화를 허용한다.</li>
		<li>2일마다 전체 N2B27 중간 II를 변경합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 세포 형태 관찰
<ol><li>반전 된 상 대비 빛 현미경에서 매일 위에서 언급 한 7 그룹의 분화 상태를 확인합니다.</li>
	<li>무작위로 최소 12개의 필드를 선택하고 사진을 찍어 D8에서 각 그룹의 형태학적 변화를 기록합니다.</li>
</ol>4. 면역 형광 염색
<ol><li>샘플 준비: 종자 mESC0.1% 젤라틴 코팅 커버립에 2단계에서 언급된 프로토콜을 사용하여 8일 동안 분화를 허용한다.</li>
	<li>린세:8일째에 인큐베이터에서 샘플을 꺼내 포부로 분화 매체를 제거합니다. 부드럽게 5 분 동안 PBS의 1 mL로 한 번 세포를 헹구십시오.</li>
	<li>고정: 각 샘플에 4% 파라포름알데히드 1mL을 추가하고 실온(RT)에서 20분 동안 셀을 수정합니다.</li>
	<li>헹구기: 고정 후, PBS 의 1 mL로 세포를 3번 부드럽게 헹구고, 각각 5분 동안 헹구십시오.</li>
	<li>침투성: PBS에 0.2% TritonX-100의 1mL을 각 샘플에 추가하고 RT에서 8분 동안 둡니다.</li>
	<li>헹구기: 투과화 후, PBS 3회 1mL로 세포를 부드럽게 헹구고 각각 5분간 헹구십시오.</li>
	<li>차단: PBS에 1mL의 염소 세럼을 각 샘플에 추가하고 RT에서 1h에 인큐베이션하여 비특이적 상호 작용을 차단합니다.</li>
	<li>1차 항체를 가진 배양<ol>
<li>PBS에서 5% 염소 세럼을 사용하여 1:100의 비율로 항 네스티닌 항체를 희석시.</li>
		<li>희석 된 항체의 500 μL을 다른 샘플에 적용하고 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>헹구기: 항체를 제거하고 각각 8분 동안 PBS 3회 1mL로 시료를 부드럽게 헹구십시오.</li>
	<li>이차 항체를 가진 배양<ol>
<li>PBS에서 5% 염소 세럼을 사용하여 알렉사 플루어 488 라벨 염소 안티 마우스 IgG의 비율로 희석 1:500.</li>
		<li>희석 된 항체의 500 μL을 다른 샘플에 적용하고 RT에서 2 시간 동안 어둠 속에서 배양하십시오. 참고: 형광 이차 항체를 적용한 후, 형광 담금질을 방지하기 위해 어둠 속에서 모든 후속 단계를 수행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>헹구기: 이차 항체를 제거하고 각각 8분 동안 PBS 3회 1mL로 시료를 부드럽게 헹구십시오.</li>
	<li>핵 염색 및 장착<ol>
<li>DAPI 마운팅 배지 1방울을 깨끗한 마이크로슬라이드에 놓습니다.</li>
		<li>조심스럽게 플레이트에서 샘플을 꺼내 서 아래로 셀을 가진 DAPI 장착 매체위에 샘플을 배치. RT에서 5 분 동안 어둠 속에서 둡니다.</li>
		<li>흡수성 용지로 과도한 DAPI 마운팅 매체를 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>형광 현미경 검사기 관찰<ol>
<li>형광 현미경 검사의 밑에 표본을 놓고 적당한 필터를 사용하여 DAPI와 알렉사 플루올48에 대한 신호를 검출합니다.</li>
		<li>각 샘플에 대해 10-15개의 서로 다른 시각적 필드를 고르고 무작위로 선택하고 CCD 카메라로 이미지를 기록합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. NPC에서 뉴런으로의 차별화 (단계 II)
<ol><li>가장 높은 차별화 효율을 가지는 단계 2.4에 상세한 프로토콜 3(8일, 표 1)을사용하여 단계 I 분화 하에서 mESC 유도체를 준비합니다(그림 3참조). 참고: 1상 제분화 후, 건강하고 고수율의 NPC를 보장하기 위해 위에서 언급한 세포 형태 관찰 및 면역형광 분석방법을 사용하여 품질 관리를 수행해야 합니다.</li>
	<li>약 5 x 105 mESC 유도체를 기초 분화 배지 의 2mL 내에서 0.1% 젤라틴 코팅 6웰 플레이트에 잘 뿌려. mESC 유도체를 단계 II 프로토콜 1, 프로토콜 2 및 프로토콜 3로 개별적으로 3그룹으로 임의로 분할합니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에 넣고 6h에 부착할 수 있도록 합니다. PBS 2mL로 두 번 씻으시면 됩니다.</li>
	<li>기저 분화 매체 I, N2B27 배지 I 및 N2B27 배지II(표 2)의2mL을 각각 위의 그룹의 각 웰에 추가합니다.</li>
	<li>플레이트를 인큐베이터에 넣고 10일 동안 차별화할 수 있습니다. 해당 매체를 2일마다 변경합니다.</li>
	<li>분화 상태를 확인하고 3단계에서 언급한 대로 형태학적 변화를 기록합니다.</li>
	<li>18일째에, 뉴런의 생성을 평가하고(β-Tubulin III 양성)을 평가하고 4단계에서 사용하는 3개의 프로토콜의 분화 효율을 결정한다.</li>
</ol>

<ol><li>Vieira, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cell+differentiation+into+mature+neurons%3A+mechanisms+of+regulation+and+biotechnological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Neural stem cell differentiation into mature neurons: mechanisms of regulation and biotechnological applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (7), 1946-1970 (2018).</li>
<li>Yang, J. R., Lin, Y. T., Liao, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+embryonic+stem+cells+on+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Genomic+Medicine%2C+Biomarkers%2C+and+Health+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of embryonic stem cells on Parkinson's disease therapy.</a> Genomic Medicine, Biomarkers, and Health Sciences. 3 (1), 17-26 (2011).</li>
<li>Liu, C., Zhong, Y. W., Apostolou, A., Fang, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+an+in+vitro+tool+for+the+study+of+the+expression+patterns+of+the+neuronal+cytoskeleton+during+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of human embryonic stem cells as an in vitro tool for the study of the expression patterns of the neuronal cytoskeleton during neurogenesis.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 439 (1), 154-159 (2013).</li>
<li>Khramtsova, E. A., Mezhevikina, L. M., Fesenko, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+modified+by+the+Neural+Growth+Factor+%28NGF%29+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Proliferation and differentiation of mouse embryonic stem cells modified by the Neural Growth Factor (NGF) gene.</a> Biology Bulletin. 45 (3), 219-225 (2018).</li>
<li>Yoshimatsu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+the+efficacy+of+small+molecules+for+neural+differentiation+of+common+marmoset+ESCs+and+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Evaluating the efficacy of small molecules for neural differentiation of common marmoset ESCs and iPSCs.</a> Neuroscience research. , (2019).</li>
<li>Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+matrix+microenvironment+for+targeted+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+and+glial+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages.</a> Biomaterials. 34, 5995-6007 (2013).</li>
<li>Gazina, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+derivation+and+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+generating+synchronous+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Method of derivation and differentiation of mouse embryonic stem cells generating synchronous neuronal networks.</a> Journal of Neuroscience Methods. 293, 53-58 (2018).</li>
<li>Ohnuki, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+hanging+drop+culture+conditions+on+embryoid+body+formation+and+neuronal+cell+differentiation+using+mouse+embryonic+stem+cells%3A+Optimization+of+culture+conditions+for+the+formation+of+well-controlled+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Effects of hanging drop culture conditions on embryoid body formation and neuronal cell differentiation using mouse embryonic stem cells: Optimization of culture conditions for the formation of well-controlled embryoid bodies.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 115 (5), 571-574 (2013).</li>
<li>Wongpaiboonwattana, W., Stavridis, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+in+serum-free+monolayer+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells in serum-free monolayer culture.</a> Journal of Visualized experiments. (99), e52823(2015).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+neuronal+differentiation+of+embryonic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">An optimized method for neuronal differentiation of embryonic stem cells in vitro.</a> Journal of Neuroscience Methods. 330 (15), 108486(2020).</li>
<li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+optimal+suspension+culture+time+for+the+osteoblastic+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+using+the+embryoid+body+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Investigation of the optimal suspension culture time for the osteoblastic differentiation of human induced pluripotent stem cells using the embryoid body method.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 515 (4), 586-592 (2019).</li>
<li>Lu, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-trans+retinoic+acid+promotes+neural+lineage+entry+by+pluripotent+embryonic+stem+cells+via+multiple+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">All-trans retinoic acid promotes neural lineage entry by pluripotent embryonic stem cells via multiple pathways.</a> BMC Cell Biology. 10, 57(2009).</li>
<li>Kanungo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+in+P19+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Agents+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling in P19 stem cell differentiation.</a> Anticancer Agents in Medicinal Chemistry. 17 (9), 1184-1198 (2017).</li>
<li>Rochette-Egly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+signaling+and+mouse+embryonic+stem+cell+differentiation%3A+Cross+talk+between+genomic+and+non-genomic+effects+of+RA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Molecular+and+Cell+Biology+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid signaling and mouse embryonic stem cell differentiation: Cross talk between genomic and non-genomic effects of RA.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1851 (1), 66-75 (2015).</li>
<li>Wang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+maintains+self-renewal+of+murine+embryonic+stem+cells+via+a+feedback+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid maintains self-renewal of murine embryonic stem cells via a feedback mechanism.</a> Differentiation. 76 (9), 931-945 (2008).</li>
<li>Wu, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-induced+upregulation+of+miR-219+promotes+the+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Disease%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-induced upregulation of miR-219 promotes the differentiation of embryonic stem cells into neural cells.</a> Cell Death Disease. 8, 2953(2017).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+regulates+germ+cell+differentiation+in+mouse+embryonic+stem+cells+through+a+Smad-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid regulates germ cell differentiation in mouse embryonic stem cells through a Smad-dependent pathway.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 418 (3), 571-577 (2012).</li>
<li>Nakayama, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+neuronal+induction+of+the+P19+embryonic+carcinoma+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for neuronal induction of the P19 embryonic carcinoma cell line.</a> Journal of Neuroscience Methods. 227, 100-106 (2014).</li>
<li>Bibel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+into+a+defined+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage.</a> Nature neuroscience. 7 (9), 1003-1009 (2004).</li>
<li>Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+Differentiation+of+Retinoic+Acid-Induced+Human+Pluripotent+Embryonic+Carcinoma+Stem+Cell+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons.</a> PLoS ONE. 6 (1), 16174(2011).</li>
<li>Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic-acid-concentration-dependent+acquisition+of+neural+cell+identity+during+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Developmental Biology. 275, 124-142 (2004).</li>
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저자는 공개 할 것이 없습니다.

본 연구에서는, 우리는 mESC에서 신경 분화를 위한 간단하고 효과적인 방법을 설치했습니다, 저렴한 비용과 쉽게 얻을 수 있는 물질. 이 방법에서, RA 유도6일 뒤에 배아체 형성의 2일은 효과적으로 NPC로 mESC의 분화를 촉진할 수 있다 (단계 I-프로토콜 3). 상 II 분화의 경우, N2B27 배지 II(Phase II-프로토콜 3)는 NPC로부터 뉴런으로의 분화를 가장 효과적으로 유도한다. 성공을 보장하기 위해 몇 가지 중요한 단계에 더 많은 주의를 기울여야 합니다.
첫째, 배아 체의 건강한 상태는 전체 분화 과정의 열쇠입니다. 3차원 배아 체형성은 일반적으로 ESC8의분화를 지시하는 데 사용된다. 이 연구에서는, 우리는 태아 바디의 적당한 현탁액 배양 시간을 조사했습니다. 도 2에도시된 바와 같이, 밝은 코어를 가진 둥근 배아 체는 이 조건에서 2일 동안 현탁액 배양 후에...

배아 줄기 세포 (ESC)는 다능하며 신경 전구체 세포 (NPC)로 분화하고 특정 조건1하에서뉴런으로 분화 할 수 있습니다. ESC 기반 신경 발생은 신경 발생을 모방하는 최고의 플랫폼을 제공하므로 발달 생물학 연구를위한 유용한 도구로 봉사하고 잠재적으로 재생 의학2,3에도움이됩니다. 지난 수십 년 동안, 형질전환법(4)과 같은 배아 신경발생을 유도하기 위한 많은 전략이 보고되었으며, 소분자5를이용하여, 3D 매트릭스 마이크로환경6,공동배양기술7을이용하여 보고되었다. 그러나 이러한 프로토콜의 대부분은 조건이 제한적이거나 작동하기 어렵기 때문에 대부분의 실험실에서 의사용에 적합하지 않습니다.
mESC로부터 효율적인 신경 분화를 달성하기 위한 조작이 용이하고 저렴한 방법을 찾기 위해, 여기에 조합 선별 전략이 사용되었습니다. 도 1에설명된 바와 같이, 배아 신경 발생의 전체 과정은 2단계로 나뉘었다. 1단계는 MESC에서 NPC로의 분화 과정을 말하며, 위상 II는 NPC에서 뉴런으로의 후속 분화와 관련이 있습니다. 간편한 작동, 저렴한 비용, 용이한 재료 및 높은 분화 효율의 원리에 기초하여, 단계 I의 7개의 프로토콜과 단계 II의 3개의 프로토콜은 전통적인 부착단 단층 배양 시스템 또는 배아 체형성 시스템8,9에기초하여 선택되었다. 두 단계에서 프로토콜의 분화 효율은 세포 형태 관찰 및 면역 형광 분석을 사용하여 평가되었다. 각 단계에서 가장 효율적인 프로토콜을 결합하여 mESC에서 신경 분화를 위한 최적화된 방법을 수립했습니다.

<table><tbody><tr><td>Anti-Nestin 항체 [Rat-401]</td><td>Abcam</td><td>Ab11306</td>은 <td>-80°C에 저장되었습니다. C, 동결 및 해동을 반복하지 마십시오</td></tr><tr><td>Anti-&beta; -Tubulin III 항체</td>는 -80 &deg에 저장된 토끼 <td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td>에서 생산되었습니다<td>. C,</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-Labeled Goat Anti-Mouse IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0428</td>을 <td>-20°C로 저장하여 반복적으로 얼고 녹이는 것을 피하십시오. C와 가벼운</td></tr><tr><td>B-27 보충제 (50X)로부터 보호, 무 세럼</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>-20 &deg에서 보관; C, 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>CHIR-99021 (CT99021)</td> <td>Selleck</td><td>S1263</td><td>-20 &deg; C</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>NEST</td><td>801007</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-Labeled Goat Anti-Rabbit IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>-20 &deg에 저장; C 및 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>DME/F-12 1:1 (1x)</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>는 4°C에 저장됩니다. C</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>-20 &deg에 보관; C, 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오</td></tr><tr><td>형광 현미경 검사</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Gibco</td><td>CM0635B</td><td>실온에서 보관</td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>4°C에서 보관합니다. C</td></tr><tr><td>Immunol Staining Primary Antibody Dilution Buffer</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td><td>4°C에 보관됨; C</td></tr><tr><td>KnockOut DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12660012</td><td>4°C에 보관됨; C</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td>-20 &deg; C,</td></tr><tr>-20 °C에 저장된<td>백혈병 억제 인자 인간</td><td>시그마</td><td>L5283</td>의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오<td>. </td></tr><tr><td>DAPI가 있는 C 장착 매체 - 수성, Fluoroshield</td><td>Abcam</td><td>ab104139</td>는 <td>4°C에 보관됩니다. C는 가벼운</td></tr><tr><td>MEM Non-essential 아미노산 용액</td><td>Gibco</td><td>11140076</td><td>4 &deg에 저장으로부터 보호합니다. C</td></tr><tr><td>N-2 보충교재 (100X)</td> <td>Gibco</td><td>17502048</td><td>-20 &deg에 저장; C 및 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>일반 염소 세럼</td><td>잭슨</td><td>005-000-121</td><td>-20 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>4 &deg에서 보관됩니다. C</td></tr><tr><td>Nonadhesive 세균성 접시</td><td>Corning</td><td>3262</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 (1X)</td> <td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td><td>는 4°C에 보관됩니다. C</td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 용액</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td>4°C에 보관됩니다. C</td></tr><tr><td>PD0325901(Mirdametinib)</td><td>Selleck</td><td>S1036</td>은 <td>-20°C에 보관되었습니다. C</td></tr><tr><td>레티노산</td><td>시그마</td><td>R2625</td>는 <td>-80°C에 저장되었습니다. C 및 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>균주 129 마우스 배아 줄기 세포</td><td>Cyagen</td><td>MUAES-01001</td><td>피더없는 배양 시스템에서 유지</td></tr><tr><td>줄기 세포 은행 (DMSO 무료)</td> <td>ZENOAQ</td><td>줄기 세포 은행 DMSO 무료</td><td>-20 &deg에서 저장; C,</td></tr><tr><td>Trypsin 0.25 % (1X) 용액</td><td>HyClone</td><td>SH30042.01</td>을 <td>4 °C에 저장하여 동결 및 해동을 반복하지 마십시오. C</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>4°°C에 보관됩니다. C 및 -</td></tr><tr>20 &deg에 저장된<td>4% 파라포름알데히드</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td>로부터 보호<td>; C</td></tr><tr><td>6 - 웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>60mm 세포 배양 접시</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원심분리기 튜브</td><td>NUNC</td><td>339650</td><td></td></tr></tbody></table>

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

마우스 배아 줄기 세포 (mESC)의 신경 분화는 신경 발생에 관련 되 고 잠재적으로 재생 의학에 도움이 되는 주요 메커니즘을 해명 하기 위한 잠재적인 도구. 여기서 는 편생스크리닝 전략을사용하여 체외에서 mESC로부터 뉴런 분화를 위한 효율적이고 저렴한 비용 방법을 확립했습니다. 여기에 정의된 조건하에서, 2일 배아 체형성 + 6일 망막산 유도 프로토콜은 잘 쌓인 및 중성염과 같은 A2lox 및 129개의 유도체의 형성에 의해 볼 수 있듯이 mESC에서 신경 전구체 세포(NPC)로 빠르고 효율적인 분화를 허용합니다. 배아 체의 건강한 상태와 레티노산(RA)이 적용되는 시점뿐만 아니라 RA 농도는 이 과정에서 매우 중요합니다. NPC에서 뉴런으로 의 후속 분화에서, N2B27 중간 II (신경 물질 매체에 의해 보충) 더 나은 장기 유지 보수 및 신경 세포의 성숙을 지원할 수 있습니다. 제시된 방법은 매우 효율적이고, 비용이 낮으며, 작동이 용이하며, 신경생물학 및 발달 생물학 연구를 위한 강력한 도구가 될 수 있습니다.

2일 배아체 형성 + 6일 RA 유도는 MESC를 NPC로 분화시키는 데 가장 적합합니다(1상). MESC를 NPC(Phase I)로 균등화하는 최적의 프로토콜을 결정하기 위해, 7개의 프로토콜은 A2lox 및 129mESC(표1)에서모두 테스트되었으며 각 그룹의 분화 상태는 광 현미경을 사용하여 모니터링하였다. 도 3A에도시된 바와 같이, 대부분의 A2lox 및 129 유도체는 "2일 배아 체형성 + 6일 RA 유도" 치료(Phase I-프로토콜 3) NPC의 형성을 나타내는 잘 쌓인 및 중성자 같은 형태를 보였다. 그러나 , "4 일 배아 신체 형성 + 4 일 RA 유도" 치료 (단계 I-프로토콜 2)를 가진 세포는 배아 체 내의 영양소부족으로 인한 불량하고 석멸 상태를 보였다. RA 유도(Phase I-protocol 4 및 5)와 결합된 단층 배양은 mESC의 분화를 지시할 수 있으며, 중성염과 같은 세포의 비율은 단계 I 프로토콜 3에서...

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

마우스 분석법과 뉴런 분화는 신경 발생과 관련된 주요 메커니즘을 설명하기 위한 훌륭한 모델입니다. 우리는 회사 toro 스크리닝 전략을 사용하여 배아 신경 발생에 최적화된 방법을 보여줍니다. 이 기술은 고효율, 저비용 및 쉬운 조작의 장점을 가지고 있으며 실험실의 대중화에 적합합니다.신경 과학 연구를 위한 강력한 도구입니다. 프로토콜 1을 사용하여 분화를 수행하기 위해 2밀리리터의 기초 분화 배지에 있는 20, 000개의 마우스 배아 줄기세포를 0.1%젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰에 파종합니다. 세포 부착 후 2ml의 PBS로 세포를 세척하고 각 웰에 2ml의 기저 분화 배지를 추가한 다음 세포를 다시 인큐베이터에 넣습니다.세포가 8일 동안 분화하도록 하고 2일마다 배지를 교체합니다. 프로토콜 2를 수행하기 위해 150만 개의 마우스 배아 줄기세포를 10ml의 기저 분화 배지에 있는 비접착성 박테리아 접시에 추가하고 플레이트를 섭씨 37도와 5% 이산화탄소에서 배양하여 배아체 형성을 가능하게 합니다. 이틀 후 세포 응집체를 15ml 원심분리기 튜브로 옮기고 중력에 의해 침전되도록 합니다.상층액을 제거하고 10ml의 새로운 기저 분화 배지를 첨가하여 배아체를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 접착력이 없는 새 접시에 다시 심고 이틀 더 배양합니다. 웰당 2밀리리터의 기초 분화 배지에 있는 약 50개의 배아체를 모아 젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트에 파종합니다.레티노산 유도의 경우, 각 웰에 2마이크로리터의 RA 스톡을 1마이크로몰의 최종 농도까지 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고 4일 동안 더 세포를 분화합니다. 프로토콜 3을 사용하여 분화를 수행하려면 프로토콜 2를 반복하되 배아 형성에 2일, RA 유도에 6일만 허용합니다.배아체 형성의 품질 관리는 현미경을 사용하여 수행해야 합니다. 밝은 코어를 가진 사람들만이 후속 과정에서 성공적으로 구별할 수 있습니다. 프로토콜 4의 경우, 웰당 20, 000개의 마우스 배아 줄기세포를 젤라틴으로 코팅된 플레이트에 시딩하고 프로토콜 1을 따릅니다.세포가 4일 동안 분화하도록 한 후 모든 트랜스 RA 스톡을 2마이크로리터씩 각 웰에 넣고 플레이트를 다시 4일 동안 배양합니다. 프로토콜 5를 수행하려면 프로토콜 4를 반복하되 분화 이틀 후에 RA 유도를 시작합니다. 프로토콜 6의 경우, 150만 개의 줄기세포를 10밀리리터의 N2B27 배지 2에 담긴 비접착성 박테리아 접시에 심고 플레이트를 섭씨 37도에서 배양 5%로 배양하여 배아체를 형성합니다.2일 후, 앞서 설명한 대로 세포 응집체를 수집하고 10ml의 신선한 N2B27 배지 2로 배아체를 다시 현탁시킵니다. 새로운 비접착성 박테리아 접시에 다시 심고 이틀 더 구별하십시오. 넷째 날에는 웰당 약 50개의 배아체를 수집하여 2밀리리터의 N2B27 배지 2가 있는 젤라틴으로 코팅된 6개의 웰 플레이트에 파종합니다.모든 트랜스 RA 스톡을 2마이크로리터씩 각 웰에 넣고 4일 동안 분화를 유도합니다. 프로토콜 7을 수행하려면 웰당 2밀리리터의 기초 분화 배지에 약 20,000개의 세포를 젤라틴으로 코팅된 플레이트에 파종합니다. 세포 부착 후 PBS로 2회 세척한 후 각 웰에 2ml의 N2B7 배지를 2개씩 첨가하고 세포가 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 8일 동안 분화할 수 있도록 합니다.프로토콜 3을 사용하여 1상 분화를 수행한 후, 웰당 2ml의 기초 분화 배지에 약 500, 000개의 마우스 배아 줄기 세포 유도체를 0.1% 젤라틴 코팅된 플레이트에 파종합니다. 3상, 2상 분화 프로토콜을 테스트하기 위해 파생 상품을 3개 그룹으로 무작위로 나눕니다. 플레이트를 6시간 동안 배양한 다음 PBS 2ml로 세포를 두 번 세척하고 프로토콜에 따라 각 웰에 2ml의 기저 분화 배지 N2B27 배지 1 또는 N2B27 배지 2를 추가합니다.블레이드를 인큐베이터에 넣고 세포가 10일 동안 더 분화하도록 하고 2일마다 해당 배지를 교체합니다. 일반적인 전구세포 또는 NPC에서 마우스 배아 줄기 세포의 분화를 위한 최적의 프로토콜을 결정하기 위해 7개의 프로토콜이 테스트되었습니다. 프로토콜은 A2lox lock과 129개 세포 모두에서 테스트되었으며 광학 현미경을 사용하여 각 그룹의 분화 상태를 모니터링했습니다.대부분의 A2lox 및 129 유도체는 프로토콜 3에서 NPC의 형성을 나타내는 잘 쌓인 중성석과 같은 형태를 보여주었습니다. 그러나 프로토콜 2를 사용하여 분화된 세포는 배아사멸(apoptotic)으로 나타났는데, 이는 배아체 내 영양분 부족에 기인할 수 있습니다. NPC의 형성을 추가로 확인하기 위해 면역형광 분석을 사용하여 nestin-positive 세포를 검출했습니다.프로토콜 3은 A2lox 및 129 유도체에서 각각 최대 78 및 69%에 이르는 가장 높은 네스틴 양성 세포의 비율을 보였습니다. NPC를 뉴런으로 분화하기 위해 세 가지 프로토콜이 테스트되었습니다. 프로토콜 3이 분화를 가장 효과적으로 유도하는 것으로 확인되었습니다.2상 프로토콜 3에서 대부분의 A2lox 및 129 유도체는 투명한 신경돌기와 세포체 확장을 가진 연장된 뉴런 유사 구조를 가지고 있었습니다. 면역형광 분석은 프로토콜 3을 사용하여 A2lox에서 각각 최대 68 및 59%의 베타 튜불린 양성 세포와 129개의 유도체를 가진 뉴런의 생성을 추가로 확인했습니다. 이 절차를 시도할 때 분화 전에 마우스 분석이 건강하고 분화가 되지 않았는지 확인하는 것이 중요합니다.또한, 보어 아웃 본체의 형성 후와 2단계 분화 전에 엄격한 품질 관리를 수행해야 합니다. 이 기술은 신경생물학 및 발달 생물학 연구자에게 표준 모델을 제공하며 신경 발생과 관련된 주요 메커니즘을 설명하기 위한 강력한 도구가 될 것으로 예상됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 시험 관내 분화의 효율을 개선하기위한 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 차별 ES 전지는 모터 뉴런이 같은 immunohistochemical 기술을 사용의 연결 및 모터 신경 세포 마커의 표현에 의해 입증 기능을 인수했습니다.

모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

이 동영상은 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 신경전구세포(NPC)를 체외에서 생성하는 방법을 보여줍니다. mESC는 현탁액에서 배양되어 배아체(EB)를 형성한 다음, 부착 배양에서 레티노산 처리를 통해 NPC로 분화하도록 유도됩니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 기술

이 비디오는 신경 전구 세포를 뉴런으로 분화시키는 세포 배양 방법을 선보였습니다. 성장 인자로 보충된 영양이 풍부한 배지에서 세포를 배양함으로써, 전구 세포는 발달된 축삭돌기와 수상돌기를 가진 뉴런으로 성숙했습니다. 안정화제는 세포 생존력을 보장하고 분화 과정 전반에 걸쳐 산화적 손상으로부터 보호했습니다.

신경전구세포(Neural Progenitor Cells)를 뉴런(Neuron)으로 분화(Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neuron)

이 비디오는 배아 줄기 세포를 기능하는 시냅스를 가진 뉴런의 네트워크 집단으로 분화하는 기술을 보여줍니다. 배아 줄기 세포가 뉴런으로 분화하고, 뉴런 네트워크 형성을 유도하고, 네트워크 뉴런으로 배양을 풍부하게 하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 배아 줄기세포를 네트워크화된 뉴런 집단으로 분화(Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population)

마우스 ES 세포를 기능적 시냅스와 창발적 네트워크 행동을 나타내는 매우 순수한 뉴런의 정의된 집단으로 구별하기 위한 사용자 정의 프로토콜이 설명됩니다. 전기생리학적 분석은 보툴리눔 신경독소 혈청형/A-/G 및 파상풍 신경독에 노출된 후 시냅스 전달의 상실을 보여줍니다.

줄기의 네트워크 문화 생물 신경 독소의 기능 평가 중추 신경계 신경 세포가 유래

이 프로토콜은 무혈청 단층 방법을 사용하여 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 전구 세포는 성숙한 신경 세포 유형을 유도하거나 신경 사양 과정을 연구하는 데 사용할 수 있으며 복합 스크리닝을 위한 멀티웰 형식 확장에 적합합니다.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

우리는 두 개 또는 세 개의 차원 배양체를 발생시키기위한 뮤린 배아 줄기 세포를 사용하는 기술을 설명한다. 우리는 다음 전구 세포 마커 면역과 면역에 의해 분화의 상태를 분석하기 위해 레티노 산, 방법에 의한 배아 신체 세포의 신경 분화를 유도하는 방법을 설명합니다.

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

여기, 전자13 마우스 배아 절 예 하에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 새로운 microsurgical 기술을 소개합니다.

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

우리는 매달려 드롭 방법을 사용하여 신경 세포로 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화에 대한 절차를 설명합니다. 또한 RT-qPCR, 면역형광, RNA-seq 및 유동 세포종을 통해 포괄적인 현상 분석을 수행합니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

배우세요 마우스 배아 줄기 세포에서 신경 세포로 분화하는 최적화된 시험관 내 방법을. 이 기술은 효율적이고 비용 효과적이며 신경 발생 연구에 강력한 도구입니다.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

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