Name: 자기 고열증 및 포토열 조합 암 치료를 위한 자기, 음향 및 광학 삼중 반응 마이크로 버블 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-22T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 학습하세요 자기, 음향 및 광학 삼중 반응 마이크로 버블 제조법을 통해 암 치료에서 나노의학 전달과 항암 효능을 향상시키는 방법을. 이 기술은 광열 및 자기 고열 요법을 결합하여 표적 약물 전달을 가능하게 합니다.

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이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81601608)과 NUPTSF (NY216024)에 의해 지원되었다.

모든 동물 실험은 동물 관리 및 실험실 동물의 사용에 대한 OG 제약 지침에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다. 이 프로토콜은 OG 제약의 실험실 동물에 대한 윤리위원회의 지침을 따랐다.
1. 나노 입자 껍질 마이크로 버블 (NSM) 합성
<ol><li>10 mg/mL 스톡 용액을 형성하기 위해 탈온화된 물에 자기 나노 입자(Fe3O4,산화철)를 분산시킵니다.</li>
	<li>IONPs 용액이 들어 있는 튜브를 초음파 세척기에 20분 간 배치합니다. 사용하기 전에 균일하게 분산된 IONPs 솔루션을 가져옵니다.</li>
	<li>1단계부터 150μL의 탈온화된 물, 10mM 나트륨 도데킬 황산염(SDS)의 150μL, IONPs의 스톡 용액 400 μL을 추가합니다. 1.5 mL 원심분리기 튜브.</li>
	<li>얼음 욕조에 비계로 균질화제를 수정합니다.</li>
	<li>혼합물의 튜브를 얼음 욕조에 넣고 균질화 프로브를 정확하게 배치하여 혼합물 용액에 침지합니다.</li>
	<li>균질화 속도를 20,000 rpm으로 조정하고 균질화기를 3 분 동안 켭니다.</li>
	<li>균질화제를 끄고 얼음 욕조에서 튜브를 제거합니다.</li>
	<li>튜브를 튜브 랙에 놓고 실온에서 12시간 안정화합니다.</li>
	<li>결과 NSM을 자석으로 튜브 벽에 흡착하고 상체를 제거합니다. 그런 다음 신선한 탈이온 된 물 1 mL로 보충하십시오.</li>
	<li>세 번 세척 과정을 반복하고 신선한 증류수 1mL에서 NSM을 다시 중단합니다.</li>
	<li>약간 흔들린 후 깨끗한 유리 슬라이드에 NSM 서스펜션 의 10 μL을 전송합니다.</li>
	<li>20배 배율에서 형광 현미경을 사용하여 NSM 형태를 시각화하십시오. 랜덤 영역에서 사진을 찍지 않도록 하십시오.</li>
	<li>개방형 액세스 나노 측정기 1.2 소프트웨어를 사용하여 사진에서 NSM의 직경을 측정합니다. 적어도 200 마이크로 버블을 계산합니다.<ol>
<li>처리할 이미지 파일을 선택하려면 "파일" 및"열기"를클릭합니다. 이미지를 가져온 후"눈금자"를누릅니다. 눈금자와 동일한 길이의 빨간색 선을 그립니다.</li>
		<li>그런 다음"설정" | 누릅니다. "통치자"와 통치자의 길이를 입력합니다. 이미지에 있는 개별 마이크로 버블의 직경과 동일한 길이의 선을 그립니다. 모든 측정을 완료한 다음"보고서" |" 보고서 "를 봅니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NSM의 음향 반응
<ol><li>800 μL 탈온수로 NSM 200 μL을 희석한 다음 1.5mL 원심분리기 튜브로 이송하여 스톡 솔루션을 형성합니다.</li>
	<li>기능 생성기, 앰프, 임피던스 매칭 및 홈메이드 포커스 트랜스듀서를 연결합니다. 트랜스듀서를 인공 큐비드 싱크대 의 바닥에 중앙에 놓고 수압을 오실로스코프와 연결하여 출력 초음파 강도를 모니터링합니다(도1). 탈이온된 물을 싱크대에 추가하여 트랜스듀서에 담급됩니다.</li>
	<li>함수 생성기를 스윕 모드로 조정하고, 주파수 범위를 10kHz에서 900kHz로 조정하고 진폭을 20 Vpp(전압 피크 피크)로 설정합니다. 초음파의 힘을 증폭기별로 0.1%로 조정합니다. 각 사이클의 지속 시간은 시간 간격이 1s인 4s입니다.</li>
	<li>튜브에 1mL NSM 스톡 솔루션 샘플을 준비하고 수제 집중 트랜스듀서 상단에 스캐폴드로 튜브를 고정합니다. 튜브 의 바닥에 자석을 부착하고 NSM을 유치할 수 있습니다.</li>
	<li>기능 발생기와 증폭기의 전원을 켭니다. 초음파의 5 사이클 (25 s)의 적용 후 기능 발생기를 끕니다. 자석을 제거하고 방출된 IONP를 포함하는 용액의 1mL를 수집합니다. 원심분리기 튜브에 1mL의 탈온화된 물을 넣습니다.</li>
	<li>2.5 단계를 반복합니다. 튜브의 NSM이 완전히 붕괴 될 때까지.</li>
	<li>이전에설명된 바와 같이 유도 결합된 플라즈마 광학 방출 분광 분석법(ICP-OES)에 의해 방출된 모든 IONP를 정량화한다.</li>
</ol>3. NSM의 광학 반응
참고: 이 작품에서는 808nm 레이저 출력을 포함하는 레이저 시스템과 이전에 Xu 등에서 설명한 적외선 열화상 카메라를 포함하는 레이저 시스템이20을활용한다.
<ol><li>레이저 시스템 준비<ol>
<li>레이저의 전원 공급 장치를 켜고 몇 분 동안 따뜻하게 할 수 있습니다. 레토르트 스탠드에 808 nm 레이저 다이오드를 결합한 섬유를 수정합니다.</li>
		<li>레이저 빔을 광섬유를 통해 샘플 단계로 직접 지시하고 샘플 단계에 초점을 맞추어 볼록 렌즈에 의해 6mm 광점(직경)을 달성합니다.</li>
		<li>레이저 파워 미터로 출력을 측정하고 전력을 1 W /cm2로조정합니다.</li>
		<li>삼각대에서 적외선 열 화상 카메라를 수정합니다. 카메라를 켜고 작동하는지 확인합니다(예: 집중된 관심 영역(ROI) 온도를 모니터링합니다. 전원 공급 장치와 적외선 열 화상 카메라를 끕니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수성 용액의 광열 측정<ol>
<li>1.5 mL 원심분리기 튜브에서 다른 IONPs 농도(1.05 mg/mL, 1.35 mg/mL, 3.65 mg/mL, 5 mg/mL)에서 1mL 샘플을 준비한다.</li>
		<li>관심 있는 튜브를 레이저 빔의 집중 된 영역에 배치하고 시료의 기준 온도를 기록합니다.</li>
		<li>레이저 전원과 적외선 열 화상 카메라를 켜고 10 분 동안 지속적으로 샘플을 조사하십시오. 동시에 실시간으로 온도를 기록합니다.</li>
		<li>10분 의 조사 후 레이저 전원 및 적외선 열 화상 카메라를 끕니다. 영역의 온도가 기준선으로 돌아갈 때까지 기다립니다.</li>
		<li>다른 시료의 측정을 위해 3.2.2 ~ 3.2.4를 반복합니다. 참고: 20°C에서 탈이온된 물을 광열 측정을 위한 컨트롤로 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>배양 된 셀의 광열 측정 참고: 뮤린 유방암세포(4T1)는 광열치료에 의한 억제 효과를 조사하기 위한 모델로 선택되었다.<ol>
<li>로스웰 공원 기념 연구소-1640 (RPMI-1640) 배지와 세포를 공급 10% 태아 소 혈 청으로 보충 (FBS) 그리고 1% 페니실린. 배양 환경을 37°C 및 5% CO2로설정합니다.</li>
		<li>배양 4T1 세포T25 플라스크및 90%의 합류에 도달하면 세포를 1:2 비율로 통과한다. 참고: 하위 배양 비율은 상이한 실험실에서 특정 세포 조건에 따라 조정할 수 있습니다.</li>
		<li>배양 배지를 제거하고 폐기합니다. 1x PBS 용액으로 세포층을 헹구어 트립신 억제제가 함유된 잔류 혈청을 제거한다.</li>
		<li>트립신-EDTA 용액(0.25%)의 2mL을 플라스크에 추가하여 분리합니다. 그런 다음 1640 개의 중간 및 흡인 셀의 3 mL을 부드럽게 파이펫팅하여 추가합니다.</li>
		<li>셀 서스펜션과 원심분리기 5mL를 500 x g에서 3분 동안 수집합니다.</li>
		<li>상체를 제거하고 1mL의 신선한 1640 배지를 추가하여 셀 서스펜션을 형성한다.</li>
		<li>배양 배지의 1mL를 포함하는 공초점 접시에 셀 서스펜션의 100 μL을 추가합니다. 세포 현탁액의 농도가 9x 10 5/mL이고, 세포 배양 공초점 접시의 최종 세포 농도가 8.1 x 10 4/mL인지 확인합니다.</li>
		<li>접종된 세포 배양 공초점 접시를 인큐베이터에 24시간 동안 놓습니다.</li>
		<li>IONPs 샘플의 다른 농도(1.05 mg/mL, 1.35 mg/mL, 3.65 mg/mL, 5 mg/mL)를 희석하여 혈청이 없는 1640 배지로 1mL 용액을 만듭니다.</li>
		<li>공초점 접시에서 배양 배지를 흡인하고 준비된 샘플 솔루션을 추가합니다.</li>
		<li>레이저 전원을 켭니다. 레이저 빔을 접시 중앙에 집중하고 출력 전력을 1 W/cm2로조정합니다. 적외선 열 화상 카메라를 켜고 공초점 접시의 세포를 지속적으로 10 분 동안 조사합니다. 집중 된 지역에 대한 실시간으로 온도를 기록합니다.</li>
		<li>레이저 및 적외선 열 화상 카메라를 끕니다. 조사된 접시를 인큐베이터로 옮기고 24시간 동안 이동합니다.</li>
		<li>배양 배지를 제거하고 버리고, 공초점 접시에 신선한 배양 배지의 1mL를 추가합니다. 칼신-AM 용액 5μL(1 mg/mL)을 접시에 넣습니다.</li>
		<li>공초점 접시를 37°C, 5% CO2에서 15분 동안 배양합니다. 1x PBS 용액으로 셀 층을 두 번 헹구는 다.</li>
		<li>488nm의 포심 파장과 500-540 nm의 방출 파장을 가진 공초점 형광 현미경으로 세포를 관찰하고 이미지한다.</li>
		<li>공초점 이미지에서 5개의 영역을 무작위로 선택하고 각 영역에서 라이브 4T1 셀 수를 수동으로 계산합니다. 모든 실험군에서 의 라이브 셀 수를 대조군과 비교하여 4T1 세포의 생존가능성을 정량화한다. 참고: 20°C에서 혈청 이없는 1640 배지를 광열 측정을 위한 컨트롤로 사용한다. 레이저 조사 없이 샘플을 세포 생존 가능성 제어 그룹으로 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>생체 내 광열 측정<ol>
<li>평균 체중 25± 2g의 8주된 ICR 수컷 마우스 3개중 3개를 준비한다.</li>
		<li>젤라틴 파우더 2 g를 20mL의 탈온화 물에 넣습니다. 용액을 40-50°C로 가열하고 젤라틴 젤을 완전히 녹여 투명하고 선명한 용액을 형성합니다.</li>
		<li>추가 100 mg IONPs에서 용액에 3.4.2.</li>
		<li>젤을 40 - 50 °C로 가열하고 즉시 젤라틴 용액의 500 μL을 마우스의 오른쪽 유방 패드에 주입하십시오.</li>
		<li>레이저 전원을 켜고 관심 영역 (마우스의 오른쪽 유방 패드)에서 레이저 빔을 집중합니다. 출력 전력을 1 W/cm2로 조정합니다. 적외선 열 화상 카메라를 켜고 관심 영역을 지속적으로 10 분 동안 조사합니다. 관심 지역의 온도를 실시간으로 기록합니다.</li>
		<li>레이저 및 적외선 열 화상 카메라를 끕니다.</li>
		<li>CO2 질식 및 자궁 경부 척추 탈구 또는 연구소의 동물 연구위원회에 의해 승인 된 모든 방법에 의해 마우스를 안락사.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 자기 고열체 측정
참고: 여기서, 이전에 우 외에 의해 기술된 자기 고온증 시스템이 활용된다 (21).
<ol><li>자기 고온증 시스템을 준비하여 교대로 자기장(AFM) 발전기와 적외선 열화상 카메라를 포함한다.<ol>
<li>냉각기를 10분 동안 켜고 적당한 무선 주파수 가열 기(예: AFM 발전기)에서 전원을 켭니다.</li>
		<li>다음과 같이 기계의 매개 변수를 설정 : 주파수 (f) = 415 kHz, 자기장 강도 = 1.8 kA / m.</li>
	</ol>
</li>
	<li>수성 용액의 자기 고온증 측정<ol>
<li>1.5mL 원심분리기 튜브에서 다른 IONPs 농도(1.05 mg/mL, 1.35 mg/mL, 3.65 mg/mL, 5 mg/mL)에서 샘플 1mL를 준비한다.</li>
		<li>튜브를 수냉 자기 유도 구리 코일의 중앙에 놓습니다.</li>
		<li>교대자기장(AFM)과 적외선 열화상 카메라를 켭니다. 10분 연속시 시료를 유도하고 실시간으로 온도를 기록한다. 참고: 카메라는 샘플 상단에 위치하여 샘플의 단면 보기를 제공합니다.</li>
		<li>AFM과 적외선 열 화상 카메라를 끕니다. 구리 코일의 온도가 10분 동안 기준선으로 돌아올 때까지 기다립니다. 참고: 고온에 주의하고, 손으로 직접 접촉하지 말고, 샘플을 제거하기 전에 냉각을 기다립니다.</li>
		<li>다른 시료의 측정을 위해 4.2.2 ~ 4.2.4를 반복한다.</li>
		<li>적당한 무선 주파수 가열 기(AFM) 및 냉각기를 전원을 공급합니다. 참고: 자기 고열량 측정을 위한 대조군으로 20°C에서 탈이온된 물을 사용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>생체 내 자기 고온증 측정<ol>
<li>평균 체중 25± 2g의 8주된 ICR 수컷 마우스 3개중 3개를 준비한다.</li>
		<li>5 mg / mL IONPs 용액을 포함하는 10 % 젤라틴 젤라틴 젤의 20 mL을 준비하십시오.</li>
		<li>젤라틴 젤을 40 -50 °C로 가열하고 즉시 젤라틴 용액의 500 μL을 동물의 오른쪽 유방 패드에 주입하십시오. 참고: 자기 유발 고열저 실험은 시험관내 시험과 동일한 파라미터를 사용하여 가열기계로 수행하였다.</li>
		<li>교대자기장(AFM)과 적외선 열화상 카메라를 켭니다. 수냉자기 유도 구리 코일의 중앙에 마우스의 오른쪽 유방 패드를 놓습니다.</li>
		<li>적외선 열화상 카메라를 켜고, 관심 영역(마우스의 오른쪽 유방 패드)을 10분 동안 지속적으로 영상화하고 관심 영역의 온도를 실시간으로 기록한다.</li>
		<li>유도 10분 후 기계 및 적외선 열 화상 카메라의 전원 스위치를 끕니다. 구리 코일의 온도가 10분 동안 기준선으로 돌아올 때까지 기다립니다.</li>
		<li>다른 시료의 측정을 위해 4.3.4 ~ 4.3.6을 반복한다.</li>
		<li>적당한 무선 주파수 가열 기(AFM) 및 냉각기를 전원을 공급합니다. 참고: 고온에 주의하고, 손으로 직접 접촉하지 말고, 샘플을 제거하기 전에 냉각을 기다립니다.</li>
		<li>CO2 질식 및 자궁 경부 척추 탈구 또는 연구소의 동물 연구위원회에 의해 승인 된 모든 방법에 의해 마우스를 안락사.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Tumor+Synergistic+Therapy+by+Injectable+Magnetic+Hydrogel+Mediated+Generation+of+Hyperthermia+and+Highly+Toxic+Reactive+Oxygen+Species%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enhanced Tumor Synergistic Therapy by Injectable Magnetic Hydrogel Mediated Generation of Hyperthermia and Highly Toxic Reactive Oxygen Species.</a> ACS Nano. 13 (12), 14013-14023 (2019).</li>
<li>Alzaraa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+microbubbles+in+the+experimental+and+clinical+setting%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Targeted microbubbles in the experimental and clinical setting.</a> American Journal of Surgery. 204 (3), 355-366 (2012).</li>
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여기서, 우리는 하나의 나노 치료 플랫폼에서 자기 조립, 자기, 음향 및 광학 반응성을 시너지 효과를 통해 산화철 나노 입자 쉘 마이크로 버블 (NSM)을 제조하는 프로토콜을 제시했습니다. IONP는 공기 코어 주위에 조밀하게 포장되어 자기 껍질을 형성했으며, 이는 표적화를 위해 외부 자기장에 의해 제어될 수 있습니다. 일단 전달되면, IONPs의 방출은 초음파 트리거에 의해 달성될 수 있습니다. 방출된 IONP는 PTT 및 MHT용 NIR 라이트 및 AFM 또는 둘 다의 조합으로 활성화될 수 있다.
전체 프로토콜 동안 NSM의 합성 단계는 전체 프로토콜의 기초인 중요한 역할을 합니다. 동시에, 시험관내 IONPs의 제어방출은 NSM의 음향 반응을 검증했다. 수성 용액의 광열 측정 프로토콜과 수성 용액의 자기 고열 측정 프로토콜은 또한 각각 NSM의 자기 및 광학 반응을 검증했습니다.
NSM을 성공적으로 준비하려면 IONP의 솔루...

암은 전 세계적으로 매년 수백만 명의 사망자와 엄청난 경제적 손실을 초래하는 치명적인 질병중하나입니다 1. 클리닉에서는 외과 절제술, 방사선 요법 및 화학 요법과 같은 기존의 항암 요법은 여전히 만족스러운 치료 효능2를제공할 수 없다. 이러한 치료법의 한계는 높은 독성 부작용, 높은 재발율 및 높은 전이 비율3이다. 예를 들어, 화학요법은 종양 부위4에정확하게 화학 요법의 낮은 전달 효율로 고통받고 있다. 세포외 매트릭스 및 높은 종양 간질 유체 압력을 포함하여 생물학적 장벽을 통해 종양 조직 깊숙이 침투하는 약물의 무능력은 또한 낮은 치료효능5에대한 책임이 있다. 게다가, 종양 저항은 일반적으로 단 하나 화학요법6에의하여 처리를 수신한 환자에서 일어납니다. 따라서, 광열요법(PTT) 및 자기 고온혈요법(MHT)과 같은 종양의 열절이 발생하는 기술은 종양 저항을 감소시키는 유망한 결과를 보여주었으며 임상 시험7,8,9에서출현하고 있다.
PTT는 레이저 에너지의 조사 하에 광열 변환 제의 작용에 의해 암세포의 열 절제를 유발합니다. 생성된 고온(50°C 이상)은 완전한 세포괴사(10)를유도한다. 최근에는 산화철 나노입자(IONPs)가 근적외선(NIR)광(11)에의해 활성화될 수 있는 광열 변환제임을 입증하였다.  근적외선 영역에서 낮은 어음 흡수 계수에도 불구하고, IONPs는 저온(43°C) 광열 요법, 정상 조직에 대한 열 노출로 인한 손상을 감소시키고 종양 전이에 대한 항종양 면역을 개시하기 위한 변형된치료법이다. PTT의 한계 중 하나는 레이저의 낮은 침투 깊이입니다. 깊은 앉은 종양의 경우, 자기장(AFM)을 번갈아 가며 산화질소 나노입자라고도 하며, 이는 PTT13,14에대한 대체 요법이다. MHT의 주요 장점은자기장(15)의높은 침투이다. 그러나, IONP의 요구된 상대적으로 높은 농도는 그것의 임상 적용을 위한 중요한 불이익 남아 있습니다. 동물내 고형종양에 대한 나노의학(또는 나노입자)의 전달 효율은 순환, 축적,침투(16,17)를 포함한 일련의 장애물로 인해 1-10%였다. 따라서, 높은 조직 침투를 달성할 수 있는 능력을 가진 통제되고 표적으로 한 IONPs 납품 전략은 암 처리에 큰 관심사입니다.
초음파 매개 나노 입자 전달은 마이크로 버블 캐비테이션(18,19)이라고불리는 현상으로 인해 종양 조직 깊숙이 나노 입자의 침투를 용이하게하는 능력을 보여주었다. 본 연구에서는 자체 조립, 자기, 음향 및 광학 반응성을 하나의 나노테라피 플랫폼에서 시너지 효과를 통해 IONP 쉘 마이크로버블(NSM)을 제조합니다. NSM에는 약 5.4 μm의 직경을 가진 공기 코어와 산화철 나노 입자의 쉘이 포함되어 있습니다. NSM은 자기적으로 종양 부위로 유도될 수 있다. 그런 다음 IONPs의 방출은 마이크로 버블 캐비테이션 및 마이크로 스트리밍과 함께 초음파에 의해 트리거됩니다. 마이크로 스트리밍으로부터 받은 모멘텀은 종양 조직으로 IONPs의 침투를 용이하게 합니다. PTT 와 MHT는 NIR 레이저 조사 또는 AFM 응용 프로그램 또는 둘 다의 조합으로 달성 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>808nm 레이저 출력</td><td>장춘 신산업 광전자 공학 기술</td><td>MDL-F-808-5W-18017023</td><td></td></tr><tr><td>Calcein-AM</td><td>Thermo Fisher SCIENTIFIC</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>함수 발생기</td><td>Keysight</td><td>33500B 시리즈</td><td>20MHz, 임의 파형 생성 기능이 있는 2채널</td></tr><tr><td>젤라틴 젤</td><td>시그마</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>가열 기계</td><td>Shuangping</td><td>SPG-06- II</td><td></td></tr><tr><td>수제 초점 트랜스듀서</td><td></td><td></td><td>주파수=855, R-X=36.2W+5.8W, |Z|-&theta;=37W+8&deg;</td></tr><tr><td>균질화기</td><td>SCILOGEX</td><td>D-160</td><td>8000-30000 rpm</td></tr><tr><td>수중청음기</td><td>T& C</td><td>NH1000</td><td></td></tr><tr><td>ICR 수컷 마우스</td><td>OG Pharmaceutical. Co. Ltd</td><td></td><td>, 8주 된</td></tr><tr><td>유도 결합 플라즈마 발광 분광법</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>적외선 열화상 카메라.</td><td>FLIR</td><td>E50</td><td></td></tr><tr><td>철(II,III) 산화물</td><td>Alfa Aesar</td><td>1317-61-9</td><td>50-100nm APS 분말</td></tr><tr><td>레이저 파워 미터</td><td>장춘 신산업 광전자 공학 기술</td><td></td><td></td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>Keysight</td><td>DSOX3054T</td><td>대역폭 500MHz, 샘플링 속도 5GS/S, 4</td></tr>채널 <tr><td>RF 전력 증폭기</td><td>T& C</td><td>AG1020</td><td>신호 소스는 외부 신호 소스에도 연결할 수 있습니다. 게인은 0에서 100%까지 조정할 수 있습니다. 주파수 스윕, 펄스 및 삼각형과 같은 여러 기능이 있습니다.</td></tr><tr><td>로스웰 파크 기념 연구소 -1640</td><td>KeyGEN BioTECH</td><td>KGM31800</td><td></td></tr><tr><td>도데실황산나트륨</td><td>시그마</td><td>151-21-3</td><td></td></tr></tbody></table>

자기 고열증 및 포토열 조합 암 치료를 위한 자기, 음향 및 광학 삼중 반응 마이크로 버블

Magnetic-, Acoustic-, and Optical-Triple-Responsive Microbubbles for Magnetic Hyperthermia and Pothotothermal Combination Cancer Therapy

종양 부위의 통제 방출뿐만 아니라 표적 및 심층 침투 전달을 목표로 하는 항암제의 정밀 전달이 도전되고 있다. 여기서는 자체 조립, 자기, 음향 및 광학 반응성을 하나의 나노치료 플랫폼에서 시너지 효과를 통해 산화철 나노입자 쉘 마이크로버블(NSM)을 제조합니다. 산화철 나노입자는 자기 및 광열 제의 역할을 합니다. 일단 정맥 주사되면, NSM은 종양 부위로 자기로 유도될 수 있다. 초음파는 미세 거품의 캐비테이션 효과로 인해 종양 깊숙이 나노 입자의 침투를 용이하게하는 산화철 나노 입자의 방출을 유발합니다. 그 후, 자기 고온증 및 광열 요법은 종양 이질성으로 인한 암 내성을 위한 용액인 병용 암 요법을 위해 종양상에서 수행될 수 있다. 이 프로토콜에서는 구조적, 화학적, 자기 및 음향 특성을 포함하는 NSM의 합성 및 특성화가 수행되었다. 또한, 열치료에 의한 항암 효능은 체외세포 배양을 이용하여 조사되었다. 제안된 납품 전략 및 조합 치료는 납품과 항암 효과 둘 다 를 향상시키기 위하여 암 처리에 있는 중대한 약속을 보유합니다.

이 연구에서 사용되는 삼중 반응형 나노입자 껍질 마이크로버블(NSM)은 계면활성제와 IONPs의 혼합물을 교반하여 제조하였다. 액체 및 가스 코어 의 인터페이스에서 자체 조립 된 IONPs (50 nm)는 조밀하게 포장 된 자기 껍질을 형성합니다. NSM의 형태는 도 1A에 표시됩니다. 결과 NSM은 구형 모양과 평균 직경 5.41 ± 1.78 μm(그림1B)을제시하였다. 그 결과 NSM이 성공적으로 준비되었다는 결과가 나타냈습니다. 물에 보관할 때, 마이크로버블은 1년 이상 그대로 유지되었고,19일이상 완충및 세포배양배지에서 안정적이었다. 도 1D에도시된 바와 같이, 적용된 초음파의 주기 수를 증가시켜 Fe의 단계별 방출이 이루어졌다. 10 사이클 후, 약 20% Fe가 출시되었습니다. 50개의 초음파 주기까지, 풀어 놓인 Fe의 양은 약 80%에 고원에 도달했습니다. 이 결과는 외부 초음파 트...

여기에 제시된 자기 조립을 통한 산화철 나노입자 껍질 마이크로버블(NSM)의 제조를 위한 프로토콜이 제시되어, 자기 고열증 및 광열 병용 암 치료를 위한 하나의 나노치료 플랫폼에서 자기 조립, 자기, 음향 및 광학 반응성을 시너지 효과를 낼 수 있다.

The precision delivery of anti-cancer agents which aim for targeted and deep-penetrated delivery as well as a controlled release at the tumor site has ...

이 프로토콜은 암 치료에서 나노 입자의 나노 의학 전달 및 항암 효능을 개선하기 위한 큰 가능성을 가지고 있습니다. 이 기술은 나노 의학의 제어 및 표적 전달을 위해 자기, 음향 및 광학 반응을 하나의 nanotherapeutic 플랫폼으로 시너지 효과를 내고 광열 및 자기 온열요법의 결합을 촉진합니다. 이 절차를 시연하는 것은 자기 온열요법을 위한 자기, 음향 및 광학 삼중 반응 마이크로 버블과 제 연구실의 광열 조합 암 치료 펠로우인 Siyu Wang입니다.나노 입자 껍질 미세기포 형성을 위해 자성 산화철 나노 입자를 탈이온수에 균일하게 분산시켜 밀리리터당 10밀리그램의 원액을 생성하고 나노 입자 용액을 초음파 세척기에 20분 동안 로드합니다. 초음파 처리가 끝나면 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에 150 마이크로 리터의 탈 이온수, 10 밀리 몰 도데 실황산 나트륨 150 마이크로 리터 및 초음파 처리 된 산화철 나노 입자 용액 400 마이크로 리터를 첨가한다. 다음으로, 얼음 수조에 골판이 있는 균질화기를 고정하고 나노 입자 용액을 얼음 수조에 놓습니다.균질화기 조사를 nanoparticle 해결책에 있는 가라앉히고 20, 분 당 000의 혁명에 3 분 동안 현탁액을 균질화하십시오. 균질화가 끝나면 용액을 실온에서 12시간 동안 안정화한 후 튜브를 자기 홀더에 넣어 나노 입자 껍질을 벗긴 미세 기포를 튜브 벽에 흡착시킵니다. 상등액을 1ml의 신선한 탈이온수로 3회 교체하여 나노 입자 껍질을 벗긴 미세 기포를 세척합니다.마지막 세척 후 튜브를 약간 흔들고 나노 입자 껍질을 벗긴 미세 기포 10마이크로리터를 깨끗한 유리 슬라이드에 옮깁니다. 형광 현미경과 20X 배율을 사용하여 나노 입자 껍질로 덮인 미세 기포를 이미지화합니다. 이미징 후 현미경 소프트웨어에서 이미지를 열고 자를 사용하여 자와 동일한 길이의 빨간색 선을 설정합니다.클릭 세트 및 스케일을 사용하여 눈금자의 길이를 입력하고 최소 200개의 개별 미세기포 직경에서 동일한 길이의 선을 그립니다. 그런 다음 보고서를 클릭하고 보고서를 봅니다. 마이크로버블의 음향 반응을 측정하기 위해 1.5밀리리터 튜브에 800마이크로리터의 탈이온수에 200마이크로리터의 나노 입자 껍질을 벗긴 마이크로버블을 희석하고 함수 발생기, 증폭기, 임피던스 정합 및 수제 초점 변환기를 연결합니다.트랜스듀서를 인공 직육면체 싱크 바닥 중앙에 놓고 수중청음기를 오실로스코프와 연결하여 출력 초음파 강도를 모니터링합니다. 트랜스듀서가 물에 잠길 만큼 충분한 탈이온수를 추가하고 함수 발생기를 스윕 모드로 조정합니다. 10에서 900킬로헤르츠의 주파수 범위를 조정하고 진폭을 20전압 피크 투 피크로 설정합니다.앰프를 사용하여 1초 시간 간격으로 초음파 강도를 0.1%로 조정하고 주기 지속 시간을 4초로 조정합니다. 나노 입자 튜브를 수제 초점 변환기 상단의 골격에 넣고 자석을 튜브 바닥에 부착합니다. 함수 발생기와 증폭기 전원을 켭니다.25초 초음파 사이클을 5회 수행한 후 함수 발생기를 끄고 자석을 제거합니다. 그런 다음 나노 입자 용액을 1ml의 탈 이온수로 교체하고 초음파 및 치료를 반복합니다. 미세 기포의 광학 처리를 위해 레이저를 설정하려면 먼저 레이저 전원 공급 장치를 켜십시오.몇 분 후 광섬유 결합 808 나노미터 레이저 다이오드를 레토르트 스탠드에 고정하고 광섬유를 사용하여 레이저 빔을 샘플 스테이지로 향하게 합니다. 볼록 렌즈를 사용하여 샘플 스테이지에 초점을 맞추면 6mm 직경의 광점을 얻고 레이저 파워 미터로 전력 출력을 측정할 수 있습니다. 그런 다음 전력을 제곱센티미터당 1와트로 조정합니다.광열 측정을 수행하려면 개별 1.5ml 원심분리기 튜브에 서로 다른 농도의 산화철 나노 입자 1ml 부피를 준비하고 첫 번째 튜브를 레이저 빔의 초점 영역에 놓습니다. 샘플의 기준 온도를 기록하고 레이저 및 적외선 열화상 카메라를 켭니다. 샘플을 10분 동안 연속으로 조사하면서 실시간으로 온도를 기록합니다.그런 다음 레이저와 카메라를 끄고 영역의 온도가 기준선으로 돌아올 때까지 기다렸다가 동일한 방식으로 다른 샘플 농도를 측정합니다. 수용액에서 자기 온열요법을 측정하려면 시연된 대로 다양한 산화철 나노 입자 희석액을 준비하고 하나의 희석액을 물 차가운 자기 유도 구리 코일의 중앙에 놓습니다. 교대 자기장과 적외선 열화상 카메라를 켜고 실시간으로 온도를 기록하면서 10분 동안 샘플을 지속적으로 유도합니다.치료가 끝나면 교대 자기장과 카메라를 끕니다. 구리 코일의 온도가 기준선으로 돌아오면 다음 샘플을 측정합니다. 나노 입자 껍질을 벗긴 마이크로버블은 일반적으로 평균 직경이 약 5.41마이크로미터인 구형 모양을 나타냅니다.마이크로 버블은 최대 1년 동안 손상되지 않은 상태로 유지되지만, 철분의 단계적 방출은 초음파 주기의 수를 증가시켜 달성할 수 있습니다. 수용액에서 산화철 나노 입자 매개 광열 측정은 시간이 지남에 따라 산화철 나노 입자 온도의 급격한 증가를 보여주며, 철 농도 밀리리터당 5 밀리그램에서 근적외선 레이저 광에 10 분 동안 노출되면 섭씨 30도 온도 상승이 달성됩니다. 대조군과 비교했을 때, 유방암 세포주를 고농도의 철로 배양할 때 형태나 살아있는 세포 수의 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 산화철 나노 입자의 우수한 생체 이용률을 시사합니다.방사선 조사에서 나노 입자 처리된 암세포는 모양이 둥글어지고 세포사멸을 나타내는 생존력 감소를 보여주었습니다. 조사 후 5분이 지나면 젤라틴 주입 부위의 온도가 섭씨 약 20도 급격히 상승합니다. 교대 자기장 요법에 노출되었을 때, 다양한 농도의 산화철 나노 입자의 열상 이미징은 나노 입자 껍질을 벗긴 마이크로 버블의 교대 자기장 반응 특성을 보여줍니다.또한, 교대 자기장 요법에 노출된 마우스의 전체 이미징은 관심 영역 내에서 상당히 빠른 온도 변화를 보여줍니다. 나노 입자 용액을 교반하는 동안 균질화 프로브가 용액 내에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 이 프로토콜은 또한 암 치료에서 나노의학 전달의 문제를 해결하기 위해 종양 조직으로의 침투를 개선하고 개선할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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명암 초음파 마약 베어링 Nanoparticle 배달 및 Microvascular 절제를 통해 마우스에서 Gliomas의 치료 타겟

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빠른 스캔 전자 스핀 공명 이미징 생리 학적으로 중요 매개 변수에 대한 새로운 길을 엽니 다<em&gt; 생체</em

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