Name: 자동 이미징 시스템을 사용한 iPSC의 합류점 측정. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 학습하세요 자동 이미징 시스템을 사용한 iPSC 합류점 측정 방법을. 다양한 세포외기질 코팅 조건에서 유도만능줄기세포의 성장률을 평가하여 최적의 배양 환경을 확립하는 이 기법은 재생의학 연구에 필수적입니다.

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이 연구는 Fondazione Bambino Gesù와 Ricerca Corrente (이탈리아 보건부)의 C.C. 보조금으로 지원되었습니다.  엔리코 베르티니 박사(신경과학과, 신경근 및 신경퇴행성 질환 부서, 밤비노 제수 어린이 연구 병원 분자 의학 연구실), 스테파니아 페트리니 박사(공초점 현미경 핵심 시설, 연구 실험실, 밤비노 제수 어린이 연구 병원), 줄리아 페리콜리(종양혈액학과, 유전자 및 세포 치료과, 밤비노 제수 어린이 연구 병원) Roberta Ferretti(종양 혈액학, 유전자 및 세포 치료학과, 어린이 연구 병원 밤비노 제수)는 과학적 토론과 기술적 도움을 제공합니다. 마리아 빈치는 "Children with Cancer UK 펠로우십"을 수상했습니다.

1. 96웰 플레이트 코팅
참고: 동일한 플레이트에서 다른 코팅을 테스트했지만 별도의 웰에서 테스트했습니다( 보충 파일 참조).
<ol><li>매트리겔을 DMEM에서 1:100으로 희석한다. 96웰 플레이트에 웰당 100μL를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 용액을 제거하고 100μL의 DMEM으로 웰을 두 번 세척합니다.</li>
	<li>PBS (칼슘 및 마그네슘 포함)에 희석 된 라미닌 (20 μg / mL, LN-521). 웰에 100 μL를 첨가하고 4°C에서 밤새 배양한다. 다음날 세포를 파종하기 전에 DMEM으로 두 번 세척하십시오.</li>
	<li>희석 완충액에 비트로넥틴(10μg/mL)을 희석합니다. 96웰 플레이트에 웰당 100μL를 추가하고 실온에서 1시간 동안 배양한다. 세포를 도금하기 전에 PBS (칼슘과 마그네슘이없는)로 우물을 씻으십시오.</li>
	<li>HU-피브로넥틴(30μg/mL)을ddH2O에 희석하고 웰에 100μL를 넣고 실온에서 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포를 파종하기 전에 배지로 웰을 씻으십시오.</li>
</ol>2. 배양에서 iPSC의 유지 관리
참고: iPSC는 상업적으로 구입했습니다. iPSC는 건강한 인간 섬유아세포에서 파생되었으며 에피솜 기술을 사용하여 재프로그래밍되었습니다.
<ol><li>-80°C 냉동고 또는 액체 질소로부터, 동결보존된 iPSCs를 37°C 수조에서 해동시킨다. 생물학적 안전 캐비닛으로 옮기기 전에 세포가 들어있는 바이알을 70 % 에탄올로 청소하십시오.</li>
	<li>15mL 멸균 원뿔형 튜브에서 1000μL 피펫으로 5mL의 사전 예열된 세포 배양 배지(예: mTeSR1)에 세포 현탁액을 한 방울씩 추가합니다.</li>
	<li>실온(RT)에서 5분 동안 304 x g 의 셀을 원심분리합니다.</li>
	<li>배지를 제거하고 세포 펠릿을 4mL의 세포 배양 배지에 재현탁합니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 6웰 플레이트(6웰 세포 배양 접시당5 iPSC 10개)의 2개 웰에 플레이팅하고, 여기서 마우스 배아 섬유아세포(MEF)가 이전에 플레이팅되었습니다. DMEM (10 % 태아 소 혈청, 1 % L- 글루타민 및 1 % 페니실린-스트렙토 마이신 함유)에서 2.4 x 104 / cm2 의 밀도로 iPSC를 도금하기 이틀 전에 MEF를 시드합니다.</li>
	<li>파종 후 세포 배지에 10μM의 ROCK 억제제 Y-27632를 보충합니다.</li>
	<li>처음 4-5주 동안 MEF에서 iPSC를 성장시킨 다음 mTeSR1에서 관심 있는 코팅 중 하나(1단계 및 표 1 참조)를 사용하여 피더 프리 조건(MEF 프리 조건)에서 성장시킵니다.</li>
	<li>iPSC가 70-80% 합류점일 때 RT에서 3-5분 동안 0.5mM EDTA 처리를 사용하여 1:4 통과합니다. 6웰 플레이트의 경우 0.5mM EDTA 1mL를 추가합니다(또는 다른 유형의 플레이트의 경우 비례 양). 피더가없는 조건에서 새 웰로 옮기고 37 ° C, 5 % CO2, 20 % O2에서 배양합니다.</li>
	<li>매일 새로운 mTeSR1로 배지를 교체하고 2일마다 세포를 분할합니다.</li>
</ol>3. 세포 합류의 특성 분석
<ol><li>실험을 위해 96웰 플레이트를 사용하십시오.</li>
	<li>MEF가 계대배양되지 않았는지 확인하기 위해 피더가 없는 상태에서 최소 1개월 배양한 후 웰당 10,000개의 세포를 시드합니다. 일회용 계수 슬라이드를 사용하여 광학 현미경으로 세포를 계수하십시오.</li>
	<li>실험을 세 번 수행하십시오. 따라서 3 개의 웰에서 각 파종 조건을 테스트하십시오.</li>
	<li>명시야 모드에서 세포분석기를 사용하여 파종 후 1일째부터 자동 이미지 획득을 수행합니다. 5일 동안 24시간마다 자동 이미지 획득을 수행합니다. 실험 파라미터에 대한 자세한 내용은 보충 파일을 참조하십시오.</li>
	<li>자동 대비 및 자동 노출을 사용하여 셀을 더 잘 시각화합니다.</li>
	<li>합류 분석에 대한 분석 설정( 보충 파일 참조)을 웰당 60%, 80% 및 100%의 마스크를 적용하여 웰 경계의 빛 굴절로 인한 초점 변화를 평가합니다. 위에서 언급한 다른 마스크 분석 설정을 사용하여 각 시점에서 세포 합류를 분석합니다.</li>
</ol>4. 통계 분석
<ol><li>정량적 결과를 평균(SEM)의 표준 오차± 평균으로 보고합니다.</li>
	<li>서로 다른 코팅 조건의 전반적인 차이를 비교하려면 동일한 표본을 사용하여 데이터를 얻고 스튜던트 쌍 표본 t-검정을 수행합니다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되며 보고된 모든 p-값은 양측입니다.</li>
</ol>5. 세포골격 마이크로필라멘트의 특성 분석
<ol><li>RT에서 10분 동안 PBS 중 4% 파라포름알데히드(4% PFA)로 세포를 고정한 후 PBS에서 2회 세척(총 10분)합니다.</li>
	<li>100 μL의 블로킹 용액 (PBS 중 5 % BSA, 0.1 % 트리톤으로 구성)을 RT에서 1 시간 동안 각 웰에 첨가하십시오.</li>
	<li>블로킹 용액을 제거하고 샘플을 PBS로 10분 동안 두 번 세척한다.</li>
	<li>샘플당 100μL의 팔로이딘-접합체 작업 용액을 추가하고 RT에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>PBS로 세포를 두 번 세척합니다 (RT에서 10 분).</li>
	<li>Hoechst 33342로 핵을 염색하고 RT에서 10분 동안 PBS에서 1:10000으로 희석합니다.</li>
	<li>Hoechst 용액을 제거하고 매번 10분 동안 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.</li>
	<li>샘플을 H2O로 세척하고 화학 후드 아래에서 건조시킵니다.</li>
	<li>100μL의 장착 매체(예: PBS:글리세롤, 1:1)를 추가하여 세포를 덮고 샘플의 형광을 보존합니다.</li>
	<li>백색광 레이저(WLL) 소스와 405nm 다이오드 레이저가 장착된 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 Ex/Em 493/517nm에서 세포를 관찰합니다. HC PLAPO 40x 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 순차적 컨포칼 이미지를 획득합니다. 검사된 모든 샘플에 대해 동일한 레이저 출력, 빔 스플리터, 필터 설정, 핀홀 직경 및 스캔 모드를 사용합니다.</li>
</ol>

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</ol>

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질병 모델링 및 향후 약물 스크리닝에 iPSC를 사용하고 정밀 의학에 적용 할 수 있기 때문에 iPSC는 관련성이 높은 기술이되며 이러한 이유로 배아 줄기 세포의 생리적 상황과 더 유사한 체외 배양 조건을 명확하게 이해할 필요가 있다고 생각합니다. 이러한 맥락에서 우리는 세포가 건강하고 미분화 상태를 유지할 수 있는 조건을 이해하기 위해 야생형 iPSC를 사용하여 다양한 ECM 코팅을 테스트했습니다. 이 외에도, 임계점은 MEFs 및 Matrigel의 이종 생성 성분에서 iPSC의 배양이며, 이는 삼중 간의 실험적 변동성을 설명 할 수 있으며 이는 기계 론적 연구26을 수행하는 능력을 방해합니다.
이 연구에서는 고함량 이미지 분석기 세포분석기를 사용하여 이종성이 없는 기질(예: LN-521, 비트로넥틴, Hu-Fibronectin)에 대한 iPSC의 합류를 테스트했습니다. 자동 이미지 분석 시스템을 사용하는 이유는 Trypan blue ...

유도 만능 줄기 세포 (iPSC)는 체세포에서 얻어지며 다른 세포 유형으로 분화 될 수 있습니다. 그들은 종종 질병 발병 기전을 모델링하거나 약물 스크리닝을 수행하는 시스템으로 사용되며 개인화 된 의학의 맥락에서 사용될 수있는 잠재력을 제공합니다. iPSC는 큰 잠재력을 가지고 있기 때문에 신뢰할 수 있는 모델 시스템으로 사용하기 위해 완전히 특성화하는 것이 중요합니다. 우리는 이전에 저산소 환경에서 iPSC를 성장시키는 것의 중요성을 보여주었습니다.이 세포는 해당 과정에 의존하고 호기성 환경은 산화 환원 불균형을 유발할 수 있습니다1. iPSC는 또한 다른 배양 조건, 특히 세포 외 환경에 취약합니다. 배양 조건의 최적화는 그들을 건강하고 증식시키는 핵심 문제입니다. 건강한 iPSC 배양은 일반적으로 특정 인간 장애 또는 세포 과정의 분자, 세포 및 기능적 특징을 이해하는 데 사용되는 모델의 종말점인 건강한 분화 세포로 이어질 것입니다.
이 연구에서는 간단한 프로토콜을 사용하여 별도의 웰에서 서로 다른 코팅 조건을 사용하여 iPSC의 합류를 테스트했습니다. iPSC가 제대로 부착되기 위해서는 쥐 배아 섬유아세포(MEF)의 영양층이 필요하지만 iPSC와 MEF가 공존하면 두 개의 세포 집단이 존재하기 때문에 RNA 또는 단백질 추출과 같은 분석을 수행하기가 어렵습니다. 피더 층을 피하기 위해 세포 외 기질 (ECM)에 속하는 다양한 단백질을 사용하여 천연 세포 틈새를 재현하고 피더가없는 iPSC 배양을 가졌습니다. 특히, Matrigel은 엥겔브레스-홀름-스웜(EHS) 마우스 육종에서 추출한 가용화된 기저막 제제로, 세포외 기질 단백질(즉, 라미닌, 콜라겐 IV, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 엔탁틴/니도겐 및 성장 인자)이 풍부합니다2,3. 다른 사용 된 코팅 조건은 대신 ECM을 구축하는 데 관련성이 알려진 정제 된 단백질입니다 : 라미닌 -521은 배아의 내부 세포 덩어리에서 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSC)에 의해 분비되는 것으로 알려져 있으며 출생 후 신체에서 가장 흔한 라미닌 중 하나입니다 4,5,6,7,8,9, 10,11; 비트로넥틴은 hPSC 12,13,14,15,16의 성장 및 분화를 지원하는 것으로 알려진 이종 무함유 세포 배양 매트릭스입니다. 피브로넥틴은 척추동물의 발달과 만능 상태의 배아 줄기세포의 부착 및 유지에 중요한 ECM 단백질이다 17,18,19,20,21,22,23,24,25. 다양한 코팅 조건을 사용할 수 있기 때문에 iPSC의 합류에 미치는 영향 측면에서 비교합니다.

<table><tbody><tr><td>10 mL 스트라이프 혈청학 피펫, 폴리스티렌, 개별 종이/플라스틱 포장, 멸균</td><td>Corning</td><td>4488</td><td>Tool</td></tr><tr><td>15 mL 고선명 폴리프로필렌(PP) 원추형 원심분리기 튜브</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td>Tool</td></tr><tr><td>1x PBS(Ca2+ 포함; Mg2+)</td><td>Thermofisher</td><td>14040133</td><td>Medium</td></tr><tr><td>1x PBS (Ca2+ 제외; Mg2+)</td><td>Euroclone</td><td>ECB4004L</td><td>Medium</td></tr><tr><td>5 mL Stripette 혈청학 피펫, 폴리스티렌, 개별 종이/플라스틱 포장, 멸균</td><td>Corning</td><td>4487</td><td>도구</td></tr><tr><td>세포 배양 마이크로플레이트, 96 WELL, PS, F-Bottom</td><td>Greiner Bio One</td><td>655090</td><td>지원</td></tr><tr><td>세포 배양 플레이트, 6 웰</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>지원</td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium- high glucose)</td><td>Sigma</td><td>D5671</td><td>Medium</td></tr><tr><td></td><td>EDTA Sigma</td><td>ED4SS-500g</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>Epi Episomal iPSC Reprogramming Kit</td><td>Invitrogen</td><td>A15960</td><td>Reagent</td></tr><tr><td>FAST - READ 102</td><td>Biosigma</td><td>BVS100</td><td>Tool</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Merck</td><td>FC010</td><td>코팅</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>시약</td></tr><tr><td>H2O</td><td></td><td>MILLIQ</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>Thermofisher</td><td>33342</td><td>시약</td></tr><tr><td>Laminin 521</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>77003</td><td>코팅</td></tr><tr><td>L-글루타민(200mM)</td><td>Gibco</td><td>LS25030081</td><td>시약</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning Matrigel hESC 인증 매트릭스</td><td>354277</td><td>코팅</td></tr><tr><td>마우스 배아 섬유아세포(MEF)</td><td>Life Technologies</td><td>A24903</td><td>코팅</td></tr><tr><td>MTESR1 Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85851</td><td>Medium</td></tr><tr><td>MTESR1 Supplement</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>85852</td><td>Medium</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>시약</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Sigma</td><td>P1951</td><td>시약</td></tr><tr><td>Vitronectin</td><td>줄기 세포 기술</td><td>7180</td><td>코팅</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>시그마</td><td>Y0503</td><td>시약</td></tr></tbody></table>

자동 이미징 시스템을 사용한 ipsc의 합류점 측정.

Measuring the Confluence of iPSCs Using an Automated Imaging System

이 연구는 다양한 ECM 코팅 기판에서 성장하는 iPSC가 세포 합류에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 데 중점을 둡니다. 성장 섭동을 피하기 위해 단일 세포 현탁액의 세포를 계산할 필요 없이 실시간으로 iPSC 합류를 평가하는 프로토콜이 확립되었습니다. 고함량 이미지 분석 시스템을 사용하여 시간이 지남에 따라 4개의 서로 다른 ECM에서 iPCS 합류를 자동화된 방식으로 평가했습니다. 부착성 iPSC의 세포 합류를 평가하기 위해 다양한 분석 설정을 사용했으며 60, 80 또는 100% 마스크가 적용되었는지 여부에 관계없이 약간의 차이(라미닌의 경우 24시간 및 48시간)만 관찰되었습니다. 우리는 또한 라미닌이 Matrigel, vitronectin 및 fibronectin에 비해 가장 좋은 합류로 이어진다는 것을 보여줍니다.

이 연구에서는 다양한 코팅 조건에서 성장할 때 iPSC의 합류를 조사했습니다. 세포 분석기를 사용하여 5 일 만에 3 배로 쉽게 유익한 결과를 얻을 수있었습니다. iPSC는 플라스틱 용기에 거의 부착되지 않고 증식을 지원하기 위해 코팅이 필요하기 때문에 세포 배양의 건강을 나타내고 분화 가능성을 반영할 수 있으므로 인간 iPSC의 합류를 모니터링하기로 결정했습니다. 시험관 내 확장 후, 우리는 iPSC를 다른 ECM 기질에 파종하고 명시야에서 획득한 샘플 이미지를 관찰하고 혈관에 대한 접착력을 이해하기 위해 팔로이딘 염색(F-액틴이라고도 하는 액틴 필라멘트 염색에 사용됨)을 사용하여 세포를 분석했습니다(그림 1). 사실, phalloidin 염색은 용기 표면에 대한 세포 부착 정도와 용기에 사용되는 특정 코팅에 대한 세포 부착 정도를 시각화 할 수있게합니다. 코팅에 부착 된 세포는 붕괴 된 마이크로 필라멘트 대신 명확하게 보이는 세포 골격 마이크로 필라멘트를 보였다. phal...

이 프로토콜의 목표는 다양한 세포외 기질(ECM) 코팅 조건을 비교하여 차등 코팅이 유도만능줄기세포(iPSC)의 성장 속도에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것입니다. 특히, 우리는 iPSC 배양의 최적 성장을 얻기위한 조건을 설정하는 것을 목표로합니다.

자동 이미징 시스템을 사용한 iPSC의 합류점 측정.

This study focuses on understanding how growing iPSCs on different ECM coating substrates can affect cell confluence. A protocol to assess iPSC confluence ...

이 프로토콜은 다양한 세포외 기질 코팅 기질에서 유도 만능 줄기세포 합류를 실시간으로 빠르게 평가할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 단일 세포 현탁액 계수가 필요하지 않아 계대형성에 민감한 iPSC에 대한 성장 교란을 방지할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 제 연구실의 박사후 연구원인 Valentina Magliocca입니다.기저막 매트릭스 코팅 플레이트를 설정하려면 기저막 매트릭스를 희석하고, DMEM에서 1 대 100 비율을 설정하고, 결과 용액 100마이크로리터를 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 모든 웰이 코딩되면 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다. 배양이 끝나면 기저막 매트릭스 용액을 버리고 웰당 100마이크로리터의 신선한 DMEM으로 각 웰을 두 번 세척합니다.라미닌 코팅 플레이트를 설정하려면 PBS의 라미닌 밀리리터당 20마이크로그램을 칼슘과 마그네슘으로 희석하고 새로운 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 라미닌 용액을 추가합니다. 그런 다음 접시를 밤새 섭씨 4도에서 배양한 후 시연된 대로 새로운 DMEM으로 웰을 두 번 세척합니다. 비트로넥틴 코팅 플레이트를 설정하려면 희석 완충액에 비트로넥틴 10마이크로그램을 희석하고 새로운 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 완충액을 추가합니다.실온에서 1시간 배양 후 웰당 칼슘과 마그네슘이 없는 100마이크로리터의 PBS로 웰을 세척합니다. 인간 피브로넥틴 코팅 플레이트를 준비하려면 이중 증류수에 피브로넥틴 1밀리리터당 30마이크로그램을 희석하고 새로운 96웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 피브로넥틴 용액을 추가합니다. 실온에서 45분 동안 배양한 후 시연된 대로 새 DMEM으로 웰을 세척합니다.iPSC 배양을 설정하기 이틀 전, 완전한 세포 배양 배지에서 2.4 x 10 - 4제곱센티미터 밀도의 마우스 배아 섬유아세포를 6웰 세포 배양 플레이트의 두 웰 각각에 파종하고 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. iPSC 배양을 설정하려면 섭씨 37도의 수조에서 동결 보존된 iPSC의 원액을 가열합니다. 세포가 방금 해동되면 70% 에탄올로 바이알을 세척하고 세포를 생물학적 안전 캐비닛에 넣습니다.1000마이크로리터 피펫을 사용하여 5ml의 예열된 세포 배양 배지가 들어 있는 멸균 15ml 원뿔형 튜브에 세포를 한 방울 한 방울 떨어뜨립니다. 원심분리로 세포를 수집하고 펠릿을 4ml의 신선한 세포 배양 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 1 x 10을 마우스 배아 섬유아세포 시딩된 6웰 플레이트의 두 웰 각각에 5번째 세포로 플레이트합니다.파종 후 ROCK 억제제 Y-27632 10마이크로몰로 세포 배양액을 보충하고 플레이트를 4-5주 동안 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다. 세포가 70-80% 포화도에 도달하면 실온에서 3-5분 동안 각 배양액을 1ml의 0.5 millimolar EDTA로 처리합니다. 세포가 분리되면 신선한 세포 배양 배지에서 1-4개의 비율로 세포를 분할하고 feeder-free 조건에서 6-well 플레이트의 나머지 4개 웰 각각에 세포를 플레이트링합니다.그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터로 다시 넣습니다. 피더가 없는 조건에서 최소 1개월 동안 배양한 후 세포 합류에 대한 다양한 코팅의 효과를 평가하려면 일회용 계수 슬라이드를 사용하여 계수 챔버를 사용하여 각 배양액의 세포를 계수합니다. 세포를 매체 농도 200마이크로리터당 1 대 10에서 4번째 세포로 희석하고, 조건별로 하나의 덮개로 코팅된 96웰 플레이트의 3개의 웰 각각에 세포를 3배로 시딩합니다.모든 세포가 플레이트링되면 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 24시간 동안 넣습니다. 다음 날과 그 후 5일 동안 매일 최적의 시각화를 위해 자동 대비 및 자동 노출 설정을 사용하여 세포의 자동 이미징을 수행합니다. 웰 경계에서 광 굴절로 인한 초점 변화를 평가하려면 분석 설정을 컨플루언스 해석으로 설정하여 웰당 60, 80 또는 100%의 마스크를 적용하고 다른 마스크 해석 설정을 사용하여 각 시점에서 세포 합류를 분석합니다.서로 다른 코딩 조건의 전반적인 차이를 비교하려면 표본 데이터를 사용하여 학생의 쌍 표본 T-검정을 수행하고, 정량적 결과를 평균의 표준 오차를 더하거나 뺀 합류점의 평균 변화로 보고합니다. 세포골격 미세필라멘트의 특성화를 위해 먼저 실온에서 10분 동안 웰당 PBS에 4%파라포름알데히드 100마이크로리터로 세포를 고정한 다음 세척당 200마이크로리터의 PBS에서 10분 동안 2회 세척합니다. 이전에 배치된 커버 슬립을 플레이트에서 현미경 슬라이드로 옮깁니다.PBS에 함유된 5% 소 혈청 100마이크로리터와 0.1% 트리톤을 실온에서 1시간 동안 각 웰에 첨가하여 비특이적 결합을 차단하고 시연된 바와 같이 10분 PBS 세척 2회로 샘플을 세척합니다. 두 번째 세척 후 샘플당 100마이크로리터의 Phalloidin 접합체 작업 용액을 추가하여 실온에서 1시간 배양한 다음 PBS에서 10분 세척 2회. 다음으로, Hoechst 33342를 PBS에서 1:10, 000 농도로 희석하여 실온에서 10분 동안 핵을 염색한 후 PBS를 2회 세척합니다.두 번째 세척 후 세포를 물로 헹구고 화학 후드 아래에서 플레이트를 건조시킵니다. 유리 커버슬립이 건조되면 웰당 100마이크로리터의 적절한 장착 매체로 셀을 덮고 적절한 여기 및 방출 파장에서 백색광 레이저 소스와 405나노미터 다이오드 레이저가 장착된 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경에서 셀을 찾습니다. 그런 다음 63x 오일 이멀젼 대물렌즈를 선택하고 세포의 순차적 컨포칼 이미지를 획득합니다.Phalloidin staining을 사용하면 혈관 표면에 대한 세포 접착 정도, 특히 혈관에 사용된 코팅을 시각화할 수 있습니다. 코팅에 부착된 세포는 붕괴된 마이크로필라멘트 대신 명확하게 보이는 세포골격 마이크로필라멘트를 보여줍니다. 또한 명시야 이미징을 통해 코팅된 표면에 대한 iPSC의 접착 수준을 이미징할 수 있습니다.라미닌에 파종된 iPSC는 다른 코팅에 비해 시간이 지남에 따라 선형 방식으로 높은 세포 증식률을 보여줍니다. 이와 대조적으로 기저막 기질, 비트로넥틴 및 인간 피브로넥틴에 파종된 세포는 처음 96시간 동안 선형 증식 속도를 보였으며 사용된 마스크와 무관하게 마지막 24시간 동안 합류 곡선의 기울기가 증가했습니다. 서로 다른 코팅에 대한 24시간의 초기 차이는 세포 부착의 차이로 인한 것일 수 있으므로 세포 성장은 이후 시점을 위해 24시간 데이터로 정규화할 수 있습니다.관찰된 바와 같이, 서로 다른 코팅들 간의 합류 측면에서는 차이가 존재하지 않으며, 이는 라미닌 코팅 배양물 내에서 관찰된 차이는 계대 형성 시 이 코팅에 부착하는 iPSC의 능력이 증가했기 때문일 가능성이 가장 높다는 것을 시사합니다. 이 연구는 iPSC 배양을 위한 표준화된 방법론 개발에 기여할 수 있으며 향후 임상에서 사용할 수 있는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 현재 세포-ECM 접촉을 매개하고 자가 재생 능력 유지를 담당할 수 있는 주요 세포 표면 수용체의 생물학을 조사하고 있습니다.

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Research

연구

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Biology

생물학

이 프로토콜은 dissociated의 연결을 문화와 immunocytochemistry를 사용하여 뇌 부분에서 모두 버렸네 번호를 계량하는 방법 세부 사항. 구획 특정 항체를 사용하여, 우리는 presynaptic 터미널뿐만 아니라 postsynaptic 전문 사이트를 라벨. 우리는이 표시에 의해 생성되는 신호 사이에 colocalization 지점으로 시냅스를 정의합니다.

Quantifying 시냅스 : 시냅스 번호를 수치 Immunocytochemistry 기반 어세이

우리는 유도 결합 플라즈마 질량 분석법 (ICPMS) 미국 이산 액적 샘플 도입 시스템을 제시한다. 그것은 90 내지 7000 Hz의 주파수로 40-60 ㎛의 크기 범위 고도로 단 분산 액 적을 생성 저렴하고 일회용 미세 유체 칩에 기초한다.

ICPMS 샘플 소개를위한 미세 유체 칩

T 세포 면역학적 시냅스에서 필라멘트 액틴의 유속과 방향성을 조사하기 위해 라이브 셀 초해상도 이미징을 내부 전반사 형광과 결합하고 시공간 이미지 상관 분광법으로 정량화합니다.

구조화 조명 현미경 데이터의 시공간적 이미지 상관 분광학에 의해 정량화 T 세포에서 대뇌 피질 굴지 흐름

우리는 접착 포유류 세포에서 액틴 세포 골격의 이미징에 간섭 광 활성화 지역화 현미경 (iPALM), 3 차원 단일 분자 지역화 초 해상 현미경 법의 적용 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 다른 기존의 회절 제한 광학 현미경으로 해결되지 않은 남아있을 것입니다 나노 구조적 특징의 빛 기반 시각화 할 수 있습니다.

입체 슈퍼의 간섭 광 활성화 현지화 현미경으로 F-액틴 필라멘트의 해상도 현미경 (iPALM)

이 작업에서는 SMPS와 ICPMS 시스템의 결합을 설정하는 여러 단계와이를 사용하는 방법을 설명하는 실용적인 가이드가 제공됩니다. 세 가지 설명 예제가 제공됩니다.

스캐닝 모빌리티 사이 저 및 유도 결합 플라스마 질량 분석기 (SMPS-ICPMS)의 결합에 관한 실용 가이드

바인딩할 대상 수용 체 세포 표면에 항 체 구조와 클러스터링 변경 부여 수 있습니다. 이러한 동적 변경 내용이 대상 셀에 약물 개발 특성화에 대 한 영향을 미칠. 이 프로토콜 confocal 현미경 검사 법 및 이미지 상호 관계 분광학 ImageJ/피지 수용 체 세포 표면에 클러스터링의 척도를 통해 활용 합니다.

Confocal 현미경 검사 법 밝혀 세포 표면 수용 체 이미지 상관 분광학을 통해 집계

여기에 우리가 현재 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 슈퍼 해상도 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출 병합, 통합된 현미경 시스템 구축의 실용적인 가이드 포함 단일 분자 형광 공명 에너지 비용 효율적인 방법으로 하나의 설정으로 이미지를 전송 합니다.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

선물이 단일 레이블이 없는 단백질의 실시간 광학 탐지에 대 한 프로토콜으로 그들은 살아있는 세포에서 분 비 됩니다. 이 간섭 산란 (iSCAT) 현미경 검사 법, 다양 한 다른 생물 학적 시스템 및 구성에 적용 될 수 있는 기반으로 합니다.

레이블 무료 이미징의 단일 단백질 분 비 iSCAT 현미경 검사 법을 통해 살아있는 세포에서

여기에서 우리는 생활 C 에서 고해상도 현미경, 전산 도구 및 단일 세포 라벨링을 사용 하 여 조합 접근법을 제시 합니다. 신경 발달 중에 단일 세포 역학을 이해 하는.

등방성 라이트 시트 현미경 검사 및 자동 세포 계보 분석을 통해 아닌 간 분해능을 통한 배아 발생 발생

적절한 sarcomere 네트워크의 형성은 iPSC 유래 심근 세포의 성숙에 중요합니다. 우리는 줄기 세포 유래 심근세포의 구조적 성숙의 정량적 평가를 허용하고, 심장 발달을 촉진하는 배양 조건을 개선할 수 있는 슈퍼 분해능 기반 접근법을 제시한다.

단일 분자 국소화 현미경 검사를 사용하여 인간 iPSC 파생 심근세포에서 α-액티닌 네트워크 분석

마이크로패턴 어레이를 사용하여 단일 세포로부터 형광 리포터 타임 코스를 취득하는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 셀 어레이의 준비, 라이브 셀 스캐닝 시간 경과 현미경 검사법의 설정 및 작동 및 접착 부위당 세포 통합 형광 시간 과정의 자동화된 사전 선택, 시각적 제어 및 추적을 위한 오픈 소스 이미지 분석 도구에 대해 설명합니다.

세포 역학을 정량화하는 다목적 기술인 단세포 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징

학습하세요 자동 이미징 시스템을 사용한 iPSC 합류점 측정 방법을. 다양한 세포외기질 코팅 조건에서 유도만능줄기세포의 성장률을 평가하여 최적의 배양 환경을 확립하는 이 기법은 재생의학 연구에 필수적입니다.

자동 이미징 시스템을 사용한 iPSC의 합류점 측정.

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