Name: 세포간 구획-특이적 레독스-에민감한 녹색 형광 단백질을 이용한 세포 산화 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-18T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 배우세요 세포내 구획-특이적 산화환원 상태 평가 방법을 레독스-민감한 형광 프로브를 이용하여 학습하세요. 이 기술은 손상 없이 살아있는 세포에서 산화 스트레스를 실시간 모니터링할 수 있어 다양한 세포 유형에 적용 가능합니다.

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세포에서 사이토솔 특이적 roGFP를 표현하기 위한 구성 및 재조합 아데노바이러스는 각각 폴 T. 슈매커, 박사, 프레이버그 의과 대학, 노스웨스턴 대학 및 ViraQuest Inc.의 실험실에서 생성되었다. 이 연구는 NIH 국립 생물 의학 연구 우수성 센터 (COBRE NIGMS), 국립 일반 의료 시스템 약리학 및 독성학 교육 프로그램 보조금 T32 GM106999를 통해, 암 치료 보조금 P20GM109005에 호스트 반응의 연구 센터에 의해 지원되었다, UAMS 재단/의료 연구 인다우먼트 어워드 AWD00053956, UAMS 연말 총리 상 AWD00053484. 유동 세포측정 핵심 시설은 COBRE NIGMS를 통해 P20GM103625를 부여하는 미생물 병리학 및 호스트 염증 반응 센터에 의해 부분적으로 지원되었다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIH의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. ATA는 터키 과학 기술 연구 위원회 (TUBITAK) 2214-A 장학금에 의해 지원되었다.

참고: 이 프로토콜은 70%-80% 컨실릭 MDA-MB-231 셀에 최적화되었습니다. 다른 세포주를 위해, 세포의 수 및 감염의 복합성 (MOI)는 재최적화되어야 합니다.
1. 세포 준비 (1 일)
<ol><li>MDA-MB-231 세포주를 75cm2 플라스크로 유지하여 10mL의 덜벡코의 수정된 이글 배지(DMEM)를 37°C에서 37°C로 보충하여 5%CO2 가습대기 대기시. 참고: DMEM은 10% FBS, 37°C, 및 5%CO2 가습대기로 전체 프로토콜 전반에 걸쳐 모든 부착 및 치료 인큐베이션에 사용됩니다.</li>
	<li>실험을 위해 MDA-MB-231 세포를 준비한다.<ol>
<li>플라스크 내에서 배지를 흡인시키고, 2분 동안 0.25%의 트립신-EDTA 용액의 2mL로 세포를 분리하고, 6mL의 완전한 매체(10%의 FBS를 가진 DMEM)로 트립신 활성을 비활성화한다. 원심 분리는 5 분 동안 150 x g에서 세포를 흡인하고 완전한 배지의 5 mL에서 세포를 일시 중단합니다.</li>
		<li>동일한 볼륨 셀 서스펜션과 0.4% 트라이팬 블루를 혼합합니다. 이 혼합물의 10 μL을 가지고 자동화 된 세포 카운터로 세포를 계산합니다. 참고: 쿨터 카운터 또는 혈전계도 세포 계수에 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>혈류 세포 분석 및 1mL의 중간 1mL에서 150,000개의 세포를 잘 파종하기 위해 세포를 6웰 플레이트로 시드한다. 셀 부착을 위해 16h를 기다립니다.</li>
		<li>세포를 형광 이미징을 위한 4웰 챔버 슬라이드로 시드하고 우물당 0.5mL의 배지25,000세포를 시드한다. 셀 부착을 위해 16h를 기다립니다. 참고 : 치료 우물 뿐만 아니라 종자 제어 우물. 대조군 우물 중 하나를 사용하여 세포 수를 결정합니다(선택 사항: 세포에 대한 부착 기간이 두 배시간보다 짧은 경우, 세포 수는 파종 밀도와 동일하다고 가정할 수 있고, 다른 하나는 비감염 대조군(0 MOI)을 위해 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 아데노바이러스 로GFP 전관 (2일차, 3일)
주의: 아데노바이러스는 질병을 일으킬 수 있습니다. 세포를 변환하는 동안 여과 된 팁을 사용하고 팁, 파스퇴르 파이펫 및 10 % 표백제로 미세 원심 분리 튜브를 제거하십시오.
참고: 이 프로토콜은 사이토솔 특이적 roGFP로 입증되었지만 다른 셀룰러 구획(예: 미토콘드리아 또는 미토콘드리아 막 간 공간)은 이 동일한 프로토콜을 대상으로 할 수 있습니다.
<ol><li>MDA-MB-231 세포주(표 1)에 대해 각 MOI 값에 필요한 아데노바이러스(mL)의 부피를 계산하여 가장 높은 트랜스듀션 효율을 얻기 위해 MOI에 대한 용량 반응 곡선을 생성한다(표 1): <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61229/61229equ01.jpg"> 참고: mL당 플라크 성형 장치(PFU)로 표현되는 아데노바이러스 주식의 각 배치의 기능적 티터가 당사에서 제공한다. 트랜스포션을 위한 최적의 MOI는 세포 유형마다 다릅니다. 대부분의 포유류 세포의 경우 최적의 MOI 범위는 10에서 300 사이입니다. 세포 반응에 따르면, MOI 값을 다시 계산해야 한다(예를 들어, 세포가 세포 독성 반응을 갖는 경우 MOI 범위를 줄여야 하며, 세포가 트랜스포션 효율이 낮으면 범위가 증가해야 한다).</li>
	<li>신뢰할 수 있는 파이펫팅을 위해 세포 배양 배지(10% FBS를 가진 DMEM)를 갖춘 6 x10 10 PFU/mL 아데노바이러스 로GFP 용액의 1:100 희석을 확인하십시오.</li>
	<li>파이펫 및 0.0125 mL(12.5 μL), 0.025 mL(25 μL), 아데노바이러스 로GFP 희석의 0.05 mL(50 μL)를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가하여 각각 50, 100, 200 및 20사이클로Table 1구성된 150,000개의 세포를 변환합니다.</li>
	<li>파이펫및 4챔버 슬라이드 웰에 아데노바이러스 로GFP 희석의 0.0042mL(4.2 μL)를 추가하여 형광 이미징을 위한 100MOI를 가진 25,000개의 세포를 트랜스듀합니다(표1). 참고: 아데노바이러스 로GFP 구조와 셀 간의 가장 높은 상호 작용을 보장하기 위해 우물에서 최소한의 배지를 사용해야 합니다. 혈청의 높은 수준이 일부 세포 유형의 트랜스포션 효율에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문에 배양 배지의 혈청 함량은 상이한 세포주에 대해 감소될 필요가 있다.</li>
	<li> </li><li> </li><li><ol><li></ol></li></ol><ol><li><ol><li> </li><li><li></li><li><li></ol></li><li><ol><li></li></ol></li></ol><ol><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></ol></li></ol><img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61229/61229equ02.jpg"><ol start="2"><li><ol><li><li> </li><li> </li></ol></li></ol>

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</ol>

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유기체의 티올/이황화물 균형은 세포의 레독스 상태를 반영한다. 살아있는 유기체는 글루타티온, 시스테인, 단백질 티올 및 저분자-중량 티올을 가지고 있으며, 모두 산화 수준에 의해 영향을 받고 세포4의레독스 상태를 에코한다. 엔지니어링 된 roGFP는 CyS 잔류물7을통해 티올 / 이황화물 균형의 파괴적 정량화를 허용합니다. roGFP의 비율 메트릭 특성은 포유류 세포에 대한 신뢰할 수 있는 레독스 측정을 제공합니다. roGFP는 형질 전환 방법 및/또는 트랜스듀션 벡터를 통해 세포에 쉽게 도입될 수 있지만, 아데노바이러스 형질은 더 높은 효율을 갖는다.
세포의 레독스 상태는 세포 환경(예를 들어, 세포의 병합 및 매체의 부피)에 의해 쉽게 영향을 받습니다. 이 프로토콜의 경우, 최적화된 세포 종자 결합은 cm2당15,000개의 세포와 함께 60%-70%로 결정되었다. 분석 당...

산화 스트레스는 1985년 헬무트 시에 의해 "이전의 항산화제 균형에 대한교란"1로정의되었으며, 유기체 의 질병, 영양 및 노화 별 레독 스 상태를 얻기 위한 과다한 연구가 수행되었다1,,2,,3. 그 이후로 산화 스트레스에 대한 이해가 더 넓어지고 있습니다. 질병 및/또는 노화에 대한 항산화제를 사용하는 가설을 테스트하는 것은 산화 스트레스가 해를 끼칠 뿐만 아니라 세포에 다른 역할을 한다는 것을 보여주었습니다. 또한, 과학자들은 자유 래디칼이 신호 변환2에중요한 역할을한다는 것을 보여주었습니다. 이러한 모든 연구는 거대 분자의 감소 산화 (redox) 비율의 변화를 결정하는 중요성을 강화합니다. 효소 활성, 항산화제 및/또는 산화물 및 산화 제품은 다양한 방법으로 평가될 수 있습니다. 이들 중, 티올 산화를 결정하는 방법은 틀림없이 세포에 있는 산화방지제와 청록산제 사이 균형에 보고하기 때문에, 유기체4. 구체적으로, 글루타티온(GSH)/글루타티온 디설파이드(GSSG) 및/또는 시스테인(CyS)/시스테인(CySS)의 비율은 유기체2의레독스 상태를 모니터링하기 위한 바이오마커로 사용된다.
프로옥시드와 항산화제 사이의 균형을 말하는 데 사용되는 방법은 주로 세포 내의 감소/산화 단백질 또는 작은 분자 의 수준에 의존합니다. 서양 얼룩 및 질량 분광법은 감소/산화 된 거대 분자 (단백질, 지질 등)의 비율을 광범위하게 평가하는 데 사용되며 GSH / GSSG 비율은 분광성5로평가 될 수 있습니다. 이러한 방법의 일반적인 특징은 세포 리시스 및/또는 조직 균질화에 의한 시스템의 물리적 인 섭류입니다. 이 분석은 또한 다른 셀룰러 구획의 산화 상태를 측정할 필요가 있을 때 도전이 됩니다. 이러한 모든 혼란은 분석 환경에서 아티팩트를 유발합니다.
레독스에 민감한 형광 단백질은 세포 내 의 교란을 일으키지 않고 레독스 균형을 평가하기 위한 유리한 시대를 열었다6. 그(것)들은 셀룰러 세포 기관 사이 상호 토크를 조사하기 위하여 구획 특정 활동 (예를 들면, 미토콘드리아및 cytosol의 redox 상태를 말하는)의 정량화를 허용하는 다른 세포내 구획을 표적으로 할 수 있습니다. 황색 형광 단백질 (YFP), 녹색 형광 단백질 (GFP), 및 HyPeR 단백질은 마이어와 동료6에의해 검토됩니다. 이러한 단백질 중, 레독스 에 민감한 GFP (roGFP)는 CyS (예: 488 nm/ em. 525 nm) 및 CySS (예. 405 nm / 525 nm) 잔류물의 다른 형광 판독으로 인해 독특하며, 이는 다른 홍옥에 민감한 단백질과는 달리 비율 메트릭 분석을7,허용합니다. 비율 측정 출력은 표현 수준, 검출 민감도 및 광표백8사이의 차이에 균형을 맞추기 때문에 유용합니다. 세포의 세포 형 구획 (사이토솔, 미토콘드리아, 핵) 또는 상이한 유기체 (박테리아 및 포유류 세포)는 roGFP7,,9,,10을수정하여 표적으로 할 수 있다.
roGFP 의 소법은 특히 실시간 시각화 실험을 위해 형광 이미징 기술을 사용하여 수행됩니다. roGFP의 흐름 세포 측정 분석은 미리 정해진 시간 점을 가진 실험에도 가능합니다. 현재 문서는 형광 현미경 검사법과 유동 세포측정법의 사용이 모두 설명되어 아데노바이러스 형질 전염을 통해 roGFP (cytosol 표적)를 과발현하는 포유류 세포에서 백강체 상태의 비율 메트릭 평가를 수행합니다.

<table><tbody><tr><td>0.25% Trypsin-EDTA</td><td>Gibco by Life Sciences</td><td>25200-056</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>4웰 챔버 슬라이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>154526</td><td>형광 이미징을 위한 세포 시딩 재료</td></tr><tr><td>세포 여과기 캡이 있는 5ml 튜브</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td>유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁 튜브</td></tr>, <tr><td>6웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>353046</td><td>유세포 분석을 위한 세포 파스딩 재료</td></tr><tr><td>15ml 원뿔형 튜브</td><td>MidSci</td><td>C15B</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>75cm2 환기 캡 조직 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>4306414</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>아데노바이러스 세포질 특이적 roGFP</td><td>ViraQuest</td><td>VQAd roGFP</td><td>roGFP 구성 Schumaker 박사가 친절하게 제공한</td></tr> 클래스 <tr><td>II, 유형 A2 안전 후드 캐비닛</td><td>Thermo Scientific</td><td>1300 시리즈 A2</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>백작 자동 세포 계수</td>기 <td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td>세포 계수</td></tr>기 <tr><td>백작 세포 계수기 챔버 슬라이드</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>세포 계수</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco by Life Sciences</td><td>11995-065</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>여과된 피펫 팁, 멸균, 20 &micro; l</td><td>Fisherbrand</td><td>02-717-161</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>여과 피펫 팁, 멸균, 1000 &micro; l</td><td>Fisherbrand</td><td>02-717-166</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>LSRFortessa</td><td>기기 유세포 분석을 위한 FITC 및 BV510 대역통과 필터가 장착된</td></tr> 기기 형<tr><td>광 현미경</td><td>고급 현미경 그룹(AMG)</td><td>Evos FL</td><td>형광 이미징</td></tr><tr><td>과산화수소 30%</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>양성 대조군</td></tr><tr><td>Light Cube, 맞춤형</td><td>생명 과학</td><td>CUB0037</td><td>roGFP 발현 세포의 형광 이미징(예: 405nm)</td></tr><tr><td>Light Cube, GFP</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMEP4651</td><td>roGFP 발현 세포의 형광 이미징(예: 488nm)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>American Tissue Culture Collection</td><td>HTB-26</td><td>인간 상피 유방암 세포주</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브, 2ml</td><td>Grenier Bio-One</td><td>623201</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco by Life Sciences</td><td>10010-023</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>피펫 컨트롤러</td><td>Drummond</td><td>Hood Mate 모델 360</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>혈청학 피펫, 1ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11B</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>혈청학 피펫, 5ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>혈청학 피펫, 10ml</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td>세포 배양</td></tr><tr><td>조직 배양 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>HERACell 150i</td><td>세포 배양용 CO2 인큐베이터</td></tr><tr><td>Trypan blue stain 0.4%</td><td>Invitrogen</td><td>T10282</td><td>세포 계수</td></tr></tbody></table>

세포간 구획-특이적 레독스-에민감한 녹색 형광 단백질을 이용한 세포 산화 평가

Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein

세포 내 산화/감소 균형을 측정하면 유기체의 생리학적 및/또는 병리학적 레독 상태에 대한 개요를 제공합니다. 티올은 감소된 디티올 과 산화 된 이황화물 비율을 통해 세포의 레독스 상태를 조명하는 데 특히 중요합니다. 엔지니어링 된 시스테인 함유 형광 단백질은 레독스에 민감한 바이오 센서의 새로운 시대를 열어주습니다. 그 중 하나인 레독스에 민감한 녹색 형광 단백질(roGFP)은 아데노바이러스 트랜스듀싱을 통해 세포에 쉽게 도입될 수 있어 세포 과정을 방해하지 않고 세포구획의 레독스 상태를 평가할 수 있습니다. 감소된 시스테인과 roGFP의 산화 된 낭포진은 각각 488 nm와 405 nm에서 흥분 최대가 있으며 525 nm에서 방출됩니다. 이러한 감소 및 산화 형태의 비율을 평가하면 셀 내의 레독스 균형을 편리하게 계산할 수 있습니다. 이 방법 문서에서는, 불멸의 인간 삼중 음성 유방암 세포 (MDA-MB-231)는 살아있는 세포 내의 레독스 상태를 평가하기 위하여 이용되었다. 프로토콜 단계는 세포성 roGFP를 발현하기 위하여 아데노바이러스를 가진 MDA-MB-231 세포주 변환, H2O2를가진 처리 및 유동 세포질 및 형광 현미경 검사법을 가진 시스테인 및 cystine 비율의 평가를 포함합니다.

CyS/CySS의 레독스 상태는 변환된 roGFP로 쉽게 분석됩니다. 형광 프로브는 감소된 형태와 산화 형태 사이의 비율을 정량화한다(각성 파장 488nm 및 405 nm, 각각). 형광 데이터는 유동 세포측정및 현미경 검사법 모두에 의해 얻어질 수 있다.
많은 수의 세포가 유동 세포측정을 사용하여 일관되고 편리하게 습득할 수 있습니다. 분석은 3개의 주요 단계로 이루어져 있습니다: 1) FSC 영역 필터를 가진 관심있는 세포 집단을선택(도 1A); 2) 전 488/em과 함께 roGFP 표현 세포를 게이트. 선택적 밴드패스필터(도 1B)가있는 525nm; 및 3) 전 405 nm/em을 가진 roGFP 발현 세포로부터 산화된 roGFP 함유 세포를 게이트. 525 nm 밴드 패스 필터(그림 1C).
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이 프로토콜은 셀 내의 세포 전체 구획 별 레독스 상태의 평가를 설명합니다. 레독스에 민감한 형광 프로브는 그대로 있는 세포에서 편리한 비율 측정 분석을 허용합니다.

Measuring the intracellular oxidation/reduction balance provides an overview of the physiological and/or pathophysiological redox status of an organism. ...

섬유의 현재 프로토콜 평가자, 레독스 상태는 세포내 구획 별 방식으로 변경됩니다. 우리의 프로토콜은 산화 스트레스의 모든 생리적 또는 병리학 적 메커니즘을 더 잘 이해하고 모니터링 할 수 있습니다. 이 기술은 비비율 메트릭 출력을 사용하여 그대로 세포에서 타일 눈 황화물 비율의 비파괴 적정화를 허용하여 신호 발현 수준, 사진 표백 및 검출 민감도 사이의 차이를 상쇄할 수 있습니다.이 프로토콜은 식물에 있는 박테리아를 포함하여 각종 유기체에 적용될 수 있습니다. 실험의 첫날에 2 분 동안 동천성 유방암 세포주에서 세포를 치료하고, EDTA에서 0.2, 5 %의 2 밀리리터를 가진다. 세포가 분리되기 시작하면 완전한 배지및 퇴적물의 6밀리리터로 세포를 원심분리에 의한 반응을 체포한다.신선한, 완전한 매체의 5 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 세포를 계산하고 완전한 매체의 1 밀리리터 당 다섯 번째 세포에 1.5 배 10으로 희석합니다. 그런 다음 6웰 플레이트에서 잘 세포의 밀리리터 당 5 번째 세포당 1.5 배 10을 시드하고, 하룻밤 동안 세포 배양 배양에서 세포를 배양한다. 또는 바이러스 성 행 GFP 변환을 추가하지 않습니다.다음 아침, 12.5, 25 및 50 마이크로리터를 1-100의 마이크로리터를 10번 10번 희석하여 밀리리터당 10번째 플라크 성형 유닛에 완전한 배지에 바이러스 침식 GFP 용액을 첨가하지 않는다. 각각 50, 100 및 200 복합 감염으로 세포를 변환하기 위해 적절한 우물 또는 6 웰 플레이트에 추가합니다. 모든 샘플 웰스가 바이러스로 변환되면 세포를 세포 배양 인큐베이터로 16~24시간 동안 되돌려 보입니다.다음 날, 형광 현미경 검사법에 의해 세포를 시각화하고 세포가 추가 24 시간 동안 복구 할 수 있도록 바이러스없이, 매체로 상체를 대체. 최적의 유도 효율을 결정하기 위해 세포측정을 유동하여 세포의 형광 강도 및 형태학을 평가합니다. 생물 안전 수준 2 인증 생물학적 안전 캐비닛 내에서 에어로졸 또는 스플래시에서 감염을 일으킬 수있는 모든 절차를 수행해야합니다.세포의 레독스 상태를 평가하기 위해, 다음 아침, 1시간 동안 10 마이크로몰라 수소와 함께 6웰 플레이트의 세포와 적절한 우물을 배양한 후 EDTA에서 0.2 5%의 750 마이크로리터로 세포를 분리하는 것으로 입증되었다. 잘 당 완전한 매체의 두 밀리리터와 반응을 중지하고 개별 15 밀리리터 원판 튜브에서 각 조건에 대한 슈퍼 나츠를 당깁니다. 원심분리에 의한 세포를 퇴적시키고 500마이크로리터의 PBS를 두 번 원심분리하여 잘 씻어낸다.두 번째 세척 후, 40 마이크로 미터 의 메스를 통해 세포 현탁액을 빛으로부터 보호된 얼음의 유세포 측정 호환 튜브로 필터링합니다. 흐름 사이토미터 소프트웨어에서 감염 제어 샘플의 0 복합성을 실행합니다. 그런 다음 과산화수소 및 처리되지 않은 세포를 분석합니다.표시된 바와 같이 수식을 사용하여 산화된 행 GFP 의 감소된 형태 사이의 평균 형광 강도 비율을 계산할 수 있습니다. 다음은 유동 세포측정에 의한 다수의 세포를 선택하기 위한 게이팅 전략이 도시된다. 유동 세포측정은 또한 행 GFP 분석에 대한 용량 반응 곡선과 감염 입력의 가장 효율적인 복합성을 결정하는 데 사용될 수 있다.감염의 복합성에 따르면, 이 대표적인 분석에서 투여량 반응 곡선, 감염의 200 복합성은 가장 높은 도로 GFP 발현을 주었지만, 세포 형태는 세포 독성을 시사하는 효과가 있었다. 따라서 최적 전환 효율은 100의 감염의 복합성으로 결정되었다. 이러한 레독스 상태 분석에서, 산화 및 감소행 GFP는 차량에 대한 유동 세포측정 분석에서 형광 강도를 획득하고 4개의 10마이크로몰러 양성 제어 과산화수소 치료제를 얻었다.중첩 된 히스토그램은 과산화수소 10 마이크로 몰라 및 차량 처리 그룹 또는 감소 및 산화 침식 GFP에서 세포 수의 변화를 나타냅니다. 이 분석을 위해 산화 및 감소행 GFP 사이의 비율을 계산한 결과, 과산화수소 10개가 차량 처리에 비해 행 GFP의 산화를 3배 증가시킨 것으로 나타났다. 정확한 셀 번호를 갖는 것은 MRI 계산 및 재현성에 중요합니다.재현 가능한 결과를 얻으려면 연구자들은 항 바이러스 솔루션을 철저히 혼합하여 균일한 현탁액을 얻어야 합니다. 이 프로토콜은 연구원이 정상 세포 프로세스및 질병 진행의 광범위한 부분의 필수적인 부분으로 급속한 redox 변경을 실시간으로 연구할 수 있게 합니다.

assessment-cellular-oxidation-using-subcellular-compartment-specific

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 배양된 오가노이드에서 산화 스트레스를 시각화하는 기술에 대해 설명합니다. 이 연구는 서로 다른 ROS 조절제로 처리한 후 오가노이드에 존재하는 다양한 세포 유형에서 ROS 축적으로 인한 산화 스트레스 수준을 이해하는 데 도움이 됩니다.

형광 프로브 이미징 분석: 반응성 산소종 유도 처리로 처리된 배양된 장 오가노이드 세포의 산화 스트레스를 시각화하는 기술

우리는 살아있는 효모 세포에서 세포 내 해상도에서 미토콘드리아의 산화 환원 상태와 ATP 수준을 모니터링하기 위해, GFP를 기반으로하는 두 개의 비례, 유전자 인코딩 바이오 센서의 사용을 설명합니다.

생활 효모 세포에서 미토콘드리아 산화 환원 상태와 ATP를 측정 비례 바이오 센서

공 초점 주사 현미경은 살아있는 동물의 관류 심장이나 골격근에 단일 미토콘드리아 이벤트 이미징에 적용된다. 수퍼 옥사이드 깜박이고 막 잠재적 인 변동으로 단일 미토콘드리아 프로세스의 실시간 모니터링은 생리학 관련 맥락에서 병리학 섭동 동안 미토콘드리아 기능의 평가를 가능하게한다.

단일 미토콘드리아 과산화물 온전한 마음에 점멸 또는 공 촛점 이미징 생체

여기에서 우리는 살아있는 제브라피시 배아의 산화 스트레스를 측정하는 프로토콜을 보고합니다. 이 절차를 통해 전체 배아 조직과 단일 세포 집단 모두에서 활성 산소 종(ROS)을 검출할 수 있습니다. 이 프로토콜은 정성적 분석과 정량적 분석을 모두 수행합니다.

제브라 피쉬 배아에서 산화 스트레스의 분석

이 논문은 세포 내 ROS 수준과 미토콘드리아 막 전위와 형태학을 동시에 정량화하기위한 고 - 내용 현미경 검사 워크 플로우를 제시한다. 세포 투과성 형광 리포터 분자 5- (and- 6) - 클로로 메틸 -2 ', 7'- 디클로로 디 히드로 플루 오렌 시스 디 아세테이트, 아세틸 에스테르 (CM-H 2 DCFDA) 및 테트라 메틸 로다 민 메틸 에스테르 (TMRM)...

고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

이 원고 xenobiotic 유발 산화 스트레스의 시험에 대 한 유전자 인코딩된 fluorogenic 기자 라이브 셀 이미징 응용 프로그램에서 사용을 설명합니다. 이 실험 방법은 많은 독성 산화 스트레스의 검색에 사용 되는 기존 방법의 단점을 피하는 동안 탁월한 spatiotemporal 해상도, 감도 및 특이성을 제공 합니다.

유전자로 인코딩된 Fluorogenic 센서를 사용 하 여 독성 산화 스트레스의 평가에 접근을 이미징

여기서, 우리는 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFH-DA)를 사용하여 총 세포 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 형광 현미경으로 부착 된 세포에서 세포 ROS 국소화를 시각화하고 형광 판 판독기와 ROS 강도를 정량화 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 간단하고 효율적이며 비용 효율적입니다.

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세신 디아세테이트 염색에 의한 부착세포에서 총 반응성 산소종 검출

이 프로토콜은 신경계 발달 중H2 O2의생리적 신호 역할을 평가하기 위한 배양 된 제브라피시 뉴런 및 애벌레에서 유전으로 인코딩 된 과산화수소 (H2O2)-바이오센서의 사용을 설명합니다. 그것은 다른 세포 유형에 적용 하 고 일반적인 개발에 반응성 산소 종 (ROS)를 공부 하는 실험 치료와 함께 수정 될 수 있습니다.

신경 발달 도중 ROS 살아있는 세포 화상 진찰

본 프로토콜은 질적 이미징 및 정량적 세포 분석 분석법을 사용하여 장 내 뮤뇨 오르노이드에서 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 잠재적으로 ROS에 선택된 화합물의 효력을 시험하기 위하여 그밖 형광 탐사선으로 확장될 수 있습니다.

반응성 산소 종 에 민감한 불소 성 프로브를 사용하여 뮤린 장 오르가노이드의 산화 스트레스 분석

이 문서는 공초점 살아있는 현미경 검사를 사용하여 1 차해 및 피질 뉴런에 있는 급성 동요에 기초 redox 상태 및 redox 반응에 있는 다름을 결정하는 프로토콜을 기술합니다. 프로토콜은 최소한의 수정으로 다른 세포 유형 및 현미경에 적용 될 수 있습니다.

비율 표시기를 사용하여 1 차 신경에 있는 미토콘드리아 글루타티온 Redox 상태의 살아있는 화상 진찰

배우세요 세포내 구획-특이적 산화환원 상태 평가 방법을 레독스-민감한 형광 프로브를 이용하여 학습하세요. 이 기술은 손상 없이 살아있는 세포에서 산화 스트레스를 실시간 모니터링할 수 있어 다양한 세포 유형에 적용 가능합니다.

세포간 구획-특이적 레독스-에민감한 녹색 형광 단백질을 이용한 세포 산화 평가

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