Name: 단세포 게놈 응용을 위한 지방 조직 핵의 격리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 배우세요 지방 조직에서 단일 핵을 분리하는 방법으로, 형광 활성화 세포 분류를 통해 고품질의 단일 세포 전사체 프로파일링을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 지방 세포 조직 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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우리는 알버트 아인슈타인 유전체학 코어에서 데이비드 레이놀즈와 기술 지원을위한 흐름 사이토메트리 코어에서 징항 장 감사드립니다. 우리는 국립 보건원 (NIH) (DK110426) 및 아인슈타인 마운트 시나이 당뇨병 연구 센터 (DK020541) 및 뉴욕 비만 연구 센터 (DK026687)의 파일럿 및 타당성 보조금 (K.S.에 모두)의 지원을 인정합니다. 우리는 또한 핵심 지원에 대한 알버트 아인슈타인 암 센터 (CA013330)에 감사드립니다.

알버트 아인슈타인 의과 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 절차에 따라 동물 관리 및 실험이 수행되었습니다.
1. 조직 소화 및 리시스 완충제 준비
<ol><li>조직 소화 버퍼를 준비합니다.<ol>
<li>지방 조직의 모든 그램에 대해 ~ 1 mL의 소화 버퍼를 준비하십시오.</li>
		<li>1.5 U/mL 콜라게나아제 D 와 2.4 U/mL 디스파제 II를 계량하고 인산염 완충식식염수(PBS)를 추가합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>핵 준비 버퍼(NPB)를 준비한다.<ol>
<li>10m HEPES, 1.5 mM MM 염화 마그네슘, 염화 10m 칼륨, 250mM 자당, 뉴클레아제 없는 물에서 0.1% NP-40을 준비한다. 잘 섞으세요. 자당은 다른 성분보다 용해하는 데 더 많은 시간이 걸릴 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.5% 소 세럼 알부민(BSA) 용액을 준비한다.<ol>
<li>EDTA를 포함하는 PBS에서 0.5%의 BSA를 준비합니다. 멸균 여과 된 세포 배양 등급 PBS를 사용하는 것이 좋습니다 (재료표참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 지방 조직의 효소 소화
<ol><li>Aune 외13에따라 지방 조직을 추출하기 위해 마우스를 해부한다. PBS를 포함하는 접시에 고립 된 조직을 수집합니다. 티슈를 종이 타월로 옮기고 말리십시오. 그런 다음 티슈를 깨끗한 접시에 놓습니다.</li>
	<li>염화칼슘을 소화 완충제에 추가하여 최종 농도10mM에 넣습니다. 소량의 소화 버퍼를 접시에 넣고 지방 조직을 철저히 다진다. 필요한 소화 버퍼의 양은 격리된 조직의 양을 기준으로 합니다. 일반적으로 ~1mL 이하가 사용됩니다.</li>
	<li>다진 조직에 준비된 소화 완충제의 약 절반(예를 들어, 5마리의 마우스의 경우 ~10mL)을 넣습니다. 서학적 파이펫을 사용하여 샘플을 50mL 원심분리기 튜브로 이송합니다. 남은 버퍼를 추가하여 접시를 씻고 시료를 포함하는 50mL 튜브로 옮겨넣습니다. 파이펫을 여러 번 위아래로. 그런 다음 12-15 분 동안 37 °C에서 200-210 rpm에서 흔들어서 배양하십시오.</li>
</ol>3. 아디포세포 절연
<ol><li>인큐베이션 후 샘플에 대해 1:1 비율로 0.5%의 BSA를 추가합니다. 여러 번 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요. 원심분리기는 실온(RT)에서 5분 동안 300 x g의 샘플을 원심분리하여 기질 혈관 분획(SVF)을 회전시합니다. adipocyte 분획은 샘플의 맨 위 층에 남아 있습니다.</li>
	<li>50mL 원심분리기 튜브 위에 40 μm 셀 필터를 놓고 샘플을 필터링하여 상단 층을 수집하고 튜브 하단에 SVF를 남깁니다. 상단 층(adipocyte 분획)을 튜브 위로 거꾸로 뒤집고 0.5% BSA를 사용하여 필터를 세척하고 튜브에서 샘플을 수집하여 새로운 튜브로 옮겨냅니다.</li>
	<li>시료 크기와 파이펫을 위아래로 조정하여 0.5% BSA의 총 부피를 10-15mL로 가져오거나 시료를 섞기 위해 잠시 위아래로 흔들어 줍니다. RT에서 5 분 동안 300 x g에서 샘플을 다시 원심 분리합니다.</li>
</ol>4. 핵 분리
<ol><li>넓은 보어 파이펫 팁을 사용하고 시료의 상단 층을 얼음 위에 놓인 100 μm 셀 필터로 조심스럽게 전달하여 잔여 SVF를 남깁니다.</li>
	<li>충분한 양의 NPB로 필터를 헹구고 세척하고 필터를 폐기하십시오. 이 단계에서 앞으로 얼음에 샘플을 가능한 한 자주 가지고 새는 및 / 또는 건강에 해로운 핵을 피하기 위해 신속하게 작동합니다. 얼음에 미래의 단계에서 사용할 미세 원심 분리튜브를 미리 칠하는 것이 도움이됩니다.</li>
	<li>간헐적으로 부드럽게 섞어 2분 이상 얼음 위에 샘플을 놓습니다. 얼음의 잠복기는 샘플 크기와 형에 최적화되어야 합니다. 원심분리기는 10분 동안 4°C에서 1,000 x g에서 원심분리기.</li>
	<li>상체를 제거하고 NPB의 1 mL에서 펠릿을 다시 분리하십시오. 샘플을 깨끗한 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오. 옮기는 동안, 파편과 지질이 들어 있는 튜브의 벽을 만지지 마십시오. 샘플에 0.6 U/μL RNase 억제제를 추가하고 혼합합니다. 원심분리기는 4°C에서 1,000 x g에서 10분 동안 다시 원심분리기. 참고: 작은 샘플에 대한 이 단계에서 원심 분리 속도와 시간을 줄여야 합니다.</li>
	<li>상체를 제거하고 핵 세척 버퍼 의 1 mL에서 재연 (2 % BSA / PBS + 0.6 U / μL RNase 억제제).</li>
	<li>30 μm 필터가 있는 깨끗한 튜브에 이중 필터를 넣습니다. 핵 세척 버퍼의 소량(~300 μL)으로 필터를 세척합니다. 또는 더 작은 시료의 경우 마이크로센심심분리기 튜브에 맞는 30 μm 필터를 사용하여 직접 필터를 입력합니다.</li>
	<li>건강한 핵의 성공적인 분리를 확인합니다.<ol>
<li>트라이팬으로 샘플의 작은 알리쿼트염색을 하고 자동화된 세포 카운터를 사용하여 평균 죽은 크기와 죽은 세포를 평가합니다. 대부분 핵을 함유하는 시료의 평균 죽은 크기는 7-10 μm 사이여야 합니다.</li>
		<li>DAPI를 사용하여 샘플의 작은 알리쿼트에 염색하고 20배 이상의 목표 이상의 현미경으로 검사합니다. 핵막은 온전해야 하며 핵은 둥글게 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. FACS 정화 및 핵 농도 단계
<ol><li>즉시 FACS 단계로 진행하여 핵을 정화하고 과도한 이물질을 제거합니다. 수집 버퍼에는 핵 세척 버퍼가 포함되어야 합니다. FACS 동안 버퍼가 희석됩니다. 분류 하는 동안 희석을 고려 하는 BSA 와 RNase 억제제의 높은 농도 준비 하는 것이 도움이 됩니다. FACS 수집 블록은 냉각 모드에 있어야 합니다.</li>
	<li>핵을 정렬한 후, 원심분리기는 500 x g에서 5분 동안 4°C에서 5분 동안 샘플을 농축하였다. 500-1,500 핵/μL의 농도를 달성하기 위해 핵 세척 버퍼의 적절한 부피로 재구성한다. 모든 상체를 제거하려고 시도하지 마십시오. 이렇게 하면 핵손실이 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>혈세포계와 DAPI 염색 알리쿼트를 사용하여 최종 카운트에 대고 핵을 시각화한다. 그런 다음 제조업체의 프로토콜에 따라 snRNA-seq로 즉시 진행합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+importance+of+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1509-1517 (2009).</li>
<li>van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-activated+brown+adipose+tissue+in+healthy+men%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cold-activated brown adipose tissue in healthy men.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1500-1508 (2009).</li>
<li>Virtanen, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+brown+adipose+tissue+in+healthy+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Functional brown adipose tissue in healthy adults.</a> The New England Journal of Medicine. 360 (15), 1518-1525 (2009).</li>
<li>Nedergaard, J., Bengtsson, T., Cannon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+evidence+for+active+brown+adipose+tissue+in+adult+humans%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Unexpected evidence for active brown adipose tissue in adult humans.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (2), E444-E452 (2007).</li>
<li>Saito, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+incidence+of+metabolically+active+brown+adipose+tissue+in+healthy+adult+humans%3A+effects+of+cold+exposure+and+adiposity%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity.</a> Diabetes. 58 (7), 1526-1531 (2009).</li>
<li>Yoneshiro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruited+brown+adipose+tissue+as+an+antiobesity+agent+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Recruited brown adipose tissue as an antiobesity agent in humans.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (8), 3404-3408 (2013).</li>
<li>Cypess, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+brown+adipose+tissue+by+a+%CE%B23-adrenergic+receptor+agonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Activation of human brown adipose tissue by a β3-adrenergic receptor agonist.</a> Cell Metabolism. 21 (1), 33-38 (2015).</li>
<li>Song, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-+and+high-thermogenic+brown+adipocyte+subpopulations+coexist+in+murine+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Low- and high-thermogenic brown adipocyte subpopulations coexist in murine adipose tissue.</a> The Journal of Clinical Investigation. 130 (1), 247-257 (2020).</li>
<li>Cinti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CL316%2C243+and+cold+stress+induce+heterogeneous+expression+of+UCP1+mRNA+and+protein+in+rodent+brown+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%3A+Official+Journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">CL316,243 and cold stress induce heterogeneous expression of UCP1 mRNA and protein in rodent brown adipocytes.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 50 (1), 21-31 (2002).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+stress+induces+glycolytic+beige+fat+formation+via+a+myogenic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Thermal stress induces glycolytic beige fat formation via a myogenic state.</a> Nature. 565 (7738), 180-185 (2019).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PloS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Transcriptional+and+Epigenomic+Profiling+from+Specific+Cell+Types+within+Heterogeneous+Tissues+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Transcriptional and Epigenomic Profiling from Specific Cell Types within Heterogeneous Tissues In Vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+stromal+vascular+cells+to+beige%2Fbrite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).</li>
<li>Zheng, G. X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+digital+transcriptional+profiling+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells.</a> Nature Communications. 8, 14049(2017).</li>
<li>Pollen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-coverage+single-cell+mRNA+sequencing+reveals+cellular+heterogeneity+and+activated+signaling+pathways+in+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Low-coverage single-cell mRNA sequencing reveals cellular heterogeneity and activated signaling pathways in developing cerebral cortex.</a> Nature Biotechnology. 32 (10), 1053-1058 (2014).</li>
<li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+full-length+total+RNA+sequencing+uncovers+dynamics+of+recursive+splicing+and+enhancer+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-cell full-length total RNA sequencing uncovers dynamics of recursive splicing and enhancer RNAs.</a> Nature Communications. 9 (1), 619(2018).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37 (8), 925-936 (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li>
<li>Peterson, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+quantification+of+proteins+and+transcripts+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells.</a> Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10 (1), 2907(2019).</li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

단일 핵을 분리하고 지방 조직 이질성을 연구하는 간단하고 견고한 방법이 제시됩니다. 전체 조직 RNA 시퀀싱에 비해,이 워크플로우는 세포 이질성 및 인구 별 마커의 편견보기를 제공합니다. 이것은 지방 세포 생물학, 분자 대사 및 비만 연구의 발전을 위해 중요하고 혁신적입니다.
이 프로토콜은 특히 snRNA-seq의 다운스트림 응용 프로그램에 최적화되어 있습니다. MoFlo XDP 고속 선별기로 건강한 핵을 격리하는 "정리" 단계는 핵 멤브레인 무결성을 유지하면서 원유 서스펜션에서 이물질과 골재를 완전히 제거합니다. 따라서, 이것은 액적 형성에 있는 포획 효율을 증가하고 검출된 유전자의 수의 손실 없이 단 1개의 실행에서 단 하나 핵 전사의 수천을 복구합니다. 조사된 단일 핵 또는 세포의 더 높은 수를 제공하는 물방울 계 단일 세포 플랫폼 외에도, 선별기 계 마이크로플레이트 및 유동성 C1플랫폼(15)은 전...

연구 에 따르면 갈색 지방 조직 (BAT)은 에너지를 분산시키는 놀라운 능력을 가지고 있습니다. 설치류와 인간 모두에서 뚜렷한 발달 기능을 갖춘 두 가지 유형의 열성 선포세포가 존재합니다: 베이지 색 지방 세포와 고전적인 갈색 지방세포. 고전적인 갈색 지방세포는 주로 중간 형 BAT 창고에 위치하지만, 베이지 색 지방 세포는 만성 감기 노출과 같은 특정 생리적 단서에 대한 응답으로 흰색 지방 조직 (WAT)에서 산발적으로 나타난다, 과정은 "브라우닝" 또는 "베이깅"으로 지칭되는 과정. 고급 이미징의 사용을 통해, 성인 인간은 UCP1+ BAT의 상당한 창고를 가지고 있음을 지금 분명하다, 특히 supraclavicular 영역1,,2,,3,,4. 성인 인간의 BAT의 양은 반대로 사도와 상관 관계가 있으며 만성 감기 노출5,,6 또는 β3-adrenergic 수용체고뇌7과같은 외부 단서에 의해 증가 될 수 있습니다. BAT 중재 에너지 지출은 비만 퇴치를 위한 실행 가능한 접근법을 제공할 수 있습니다.
최근까지 열발생 성 지방 세포는 균일 한 인구로 간주되었습니다. 그러나, 연구 결과는 발달 기원,,기판 사용 및전사8,9,910에서구별되는 다중 특수형 또는 하위 집단의 존재를 밝혔습니다. 예를 들어, 열발생, g-베이지 색 지방세포에 포도당을 우선적으로 사용하는 베이지 색 지방세포의 유형은 최근10에설명되었다. 갈색과 베이지 색 지방 조직에 있는 세포 모형의 불완전한 이해 및 특정 마커의 부족은 그들의 생물학 기능을 공부에 중요한 장벽을 구성합니다.
세포의 하위 집단을 격리하기위한 전통적인 방법은 몇 가지 알려진 마커 유전자의 발현에 기초한다. 단세포 유전체학에 있는 최근 어드밴스는 조직에 있는 하위 집단의 수의 편견없는 추정을 제공하기 위하여 단 하나 세포의 글로벌 유전자 발현 데이터의 사용을 가능하게 합니다. 이 프로토콜의 궁극적인 목표는 단세포 해상도에서 다양한 열발생 자극하에서 모든 지방 조직 특수형을 결정하는 것입니다. 다른 조직 및 세포 유형과는 달리, 지방 조직의 세포 하위 유형을 결정하는 것은 지질 채워진 지방 세포의 취약성 때문에 도전적입니다. 이 논문은 다운스트림 적용을 위한 지방 조직에서 snRNA 시퀀싱에 단일 핵을 분리하는 강력한 프로토콜을 소개합니다. 중요한 것은, 잘 일치하는 단일 핵 RNA 염기서열분석(snRNA-seq) 및 단세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 데이터 세트를 비교하는 최근 문헌은 snRNA-seq가 세포 유형 검출에서 scRNA-seq와 유사하며, 뇌111과같은 복잡한 조직에 대한 세포 커버리지에서 우수하다는 것을 밝혔다. 이 프로토콜은 로젠 외12에 의해 포화 조직에 최적화된 밀도 그라데이션 원심분리 방법을 MoFlo XDP 고속 선별기와 함께 핵 "정리" 단계와 결합합니다. 대표적인 결과에서 볼 수 있듯이, 마우스 산하 갈색 지방 조직에서 7,500개의 단일 핵을 분석한 결과, 겉보기에 균일한 갈색 지방 조직 내에서 여러 세포 유형을 확인했습니다. 전반적으로, 이 간단하고 강력한 프로토콜은 지방 세포및 지방 거주자 세포의 조직 수준 조직을 연구하기 위하여 적용될 수 있고, 아형 특이적 마커 유전자의 식별 및 adipose 선택적인 녹아웃/형질 전환 마우스의 발달 표현.

<table><tbody><tr><td>autoMACS 헹굼 솔루션</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>PBS with EDTA; 멸균 여과</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115</td><td></td></tr><tr><td>셀 필터 100 &mu; m</td><td>코닝</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>셀 필터 40&mu; m</td><td>코닝</td><td>431750</td><td></td></tr><tr><td>CellTrics (30 &mu; m)</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 자동 세포 계수기</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAF1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>시그마</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>MACS 스마트 스트레이너(30 & 마이크로; m)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td>스택형 필터</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>MoFloXDP 세포 분류기</td><td>Beckman Coulter</td><td>ML99030</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Protector RNase 억제제</td><td>Roche</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>S5-3</td><td></td></tr></tbody></table>

단세포 게놈 응용을 위한 지방 조직 핵의 격리

Isolation of Adipose Tissue Nuclei for Single-Cell Genomic Applications

갈색과 베이지 색 지방은 UCP1 (분리 단백질-1)에 의해 열발생에 대한 에너지를 발산하는 특수 조직 조직입니다 의존적이고 독립적 인 경로. 최근까지 열발생 성 지방 세포는 균일 한 인구로 간주되었다. 그러나, 최근 연구는 발달 기원, 기판 사용 및 전사에서 구별되는 다중 특수형 또는 하위 집단이 있다는 것을 표시했습니다. 단세포 유전체학의 진보에도 불구하고, 지방 분조직의 비편향분해는 지질이 채워진 지방세포의 연약한 특성 때문에 도전적이다. 제시된 프로토콜은 RNA 시퀀싱을 포함하여 다운스트림 응용을 위한 지방 조직에서 단 하나 핵의 효과적인 격리에 의해 이 장애물을 우회하기 위하여 개발되었습니다. 세포 이질성은 RNA 시퀀싱 및 생물정보 분석에 의해 분석될 수 있다.

분류되지 않은 세포 핵에는 다운스트림 단세포 RNA 염기서열분석에서 소음과 높은 배경을 생성하는 이물질과 이중핵이 포함되어 있습니다. 대표적인 FACS 게이트 전략은 그림 1에표시됩니다. 핵은 먼저 전방 분산(FSC) 및 측면 산란(SSC)(A)에 기초하여 선택된 다음, SSC(B)의 폭과 높이의 조합에 기초하여 단일만 선택되었다.AB 마지막으로 DAPI 양수 이벤트만 선택되어 컬렉션버퍼(C)로정렬되었습니다. 이 워크플로우는 핵 응집체 및 세포 이물질을 최소화한 고도로 정제된 단일 핵을제공한다(그림 2).
선별된 핵의 무결성을 확인하기 위해 DAPI 염색 후 현미경으로...

본 간행물은 성숙한 지방세포로부터 핵의 분리, 형광 활성화 선별에 의한 정제, 및 단세포 수준 전사학에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Brown and beige fat are specialized adipose tissues that dissipate energy for thermogenesis by UCP1 (Uncoupling Protein-1)-dependent and independent ...

아류형으로 지방 조직의 분해는 지방 세포의 깨지기 쉬운 특성 때문에 도전하고있다. 이 프로토콜은 단일 핵의 효과적인 격리에 의해 이를 극복하기 위해 개발되었다. 이 워크플로우는 핵 응집체및 세포 이물질을 최소화한 고도로 정제된 단일 핵을 제공합니다.이것은 세포의 수천의 단세포 전사 프로파일링에 유리합니다. 이 간단하고 강력한 프로토콜은 그들의 지방 거주자 세포에 있는 지방 세포에 있는 지방 세포의 조직 수준 조직을 공부하기 위하여 적용될 수 있습니다. 그리고 특히, 페노티핑을 개발하기 위해 녹아웃 및 형질 전환 마우스를 지방으로 구성한다.이 프로토콜의 시각적 데모는 비도체 처리경험이 많지 않은 사람들이 지방 이질성에 대해 복제하고 통찰력을 가질 수 있도록 매우 중요합니다. 쥐에서 지방 조직을 수집 한 후 종이 타월로 말리고 깨끗한 접시에 놓습니다. 염화칼슘을 소화 완충제에 추가하여 최종 농도10mM에 넣습니다.그런 다음 조직에 작은 양을 추가하고 철저히 다진다. 다진 조직에 준비된 소화 버퍼의 약 절반을 추가합니다. 그리고 50mL 원심분리기 튜브로 샘플을 전송하기 위해 서학적 파이펫을 사용합니다.나머지 버퍼로 접시를 씻고 50 mL 튜브에 추가합니다. 샘플을 여러 번 위아래로 피펫합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 12~15분 동안 배양하고 200~210rpm에서 흔들리면 됩니다.인큐베이션 후, 샘플에 0.5%BSA를 1 대 1 부피 비율로 추가하고 파이펫팅으로 잘 섞는다. 원심분리기는 실온에서 5분 동안 300xg의 샘플을 원심분리하여 기질분획을 아래로 회전하여 위에 지방분획을 남깁니다. 400m 셀 필터를 50mL 튜브로 필터링하지만 상단 분획을 필터링합니다.그런 다음 필터를 튜브 위로 거꾸로 뒤집어 서 0.5%BSA를 사용하여 새 튜브로 교포를 전달하여 필터를 역세척합니다. BSA의 총 부피를 10~15mL로 가져오고 시료를 서학적 파이펫으로 위아래로 피펫합니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 300 xg에서 원심 분리합니다.원심분리 후, 넓은 보어 파이펫 팁을 사용하여 샘플의 상단 층을 얼음 위에 있는 100m 셀 필터로 조심스럽게 전달합니다. 충분한 양의 핵 제제 버퍼로 필터를 헹구고 폐기합니다. 이 단계에서는 얼음 샘플을 보관하고 신속하게 작업하십시오.샘플을 얼음 위에 최대 2분 간헐적으로 뒤집어 섞어 둡니다. 그런 다음 원심 분리기는 10분 동안 1000xg, 섭씨 4도에서 원심분리기를 합니다. 상체를 제거하고 핵 제제 완충제의 1mL에서 펠릿을 다시 분리한다.샘플을 깨끗한 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 오래된 튜브의 벽에 닿지 않도록 돌봅니다. L RNase 억제제 당 0.6 단위를 추가하고 혼합합니다. 그런 다음 샘플을 원심분리하여 10분 간 추가로 원심분리합니다.상체를 제거하고 펠릿과 핵 세척 버퍼 1mL을 재연한다. 30m 필터를 사용하여 샘플을 깨끗한 튜브로 이중 필터링합니다. 이어서, 약 300L의 핵 세척 버퍼로 필터를 세척한다.건강한 핵의 성공적인 분리를 확인하기 위해, trypan와 샘플의 작은 알리쿼트 얼룩과 죽은 세포의 평균 죽은 크기와 %를 평가하기 위해 자동화 된 세포 카운터를 사용합니다. DAPI를 가진 견본의 작은 알리쿼트에 얼룩및 20X 목표 이상으로 현미경의 밑에 그것을 검사합니다. 핵은 둥글고 그대로 핵막을 가져야 한다.백색 화살표는 그대로 막없이 핵을 나타냅니다. FACS로 핵을 세척한 후, 이 샘플을 섭씨 4도에서 5분 동안 500xg에서 원심분리하여 농축합니다. 그런 다음, 핵 세척 버퍼의 적절한 부피로 재구성한다.L 농도당 50~1500개의 핵을 달성하고 단세포 핵 RNA 세크를 진행한다. 세포 이물질과 이중을 제거하기 위해, 비화 세포 핵은 핵 응집체및 다중을 제외하기 위해 크기와 세분성으로 분류됩니다. 그리고 마지막으로 DAPI 긍정적 인 이벤트에 대한.이 채점 전략은 최소한의 응집체와 파편으로 고도로 정제된 단일 핵을 초래합니다. 현미경 검사법에 의해 검사될 때, 정렬된 핵은 둥글고 온전한 막을 가져야 합니다. 핵의 성공적인 정제는 또한 갈색 선포세포에 대한 마커 유전자인 초기 Ucp1 mRNA를 위한 프라이머를 사용하여 실시간 qRT-PCR으로 수행될 수 있다.크롬 플랫폼은 뮤린 상호 엽 지방 조직에서 7500 핵의 전사를 결정했다. 7개의 상이한 세포 모형은 t-SNE 치수 감소 및 k-means 군집으로 드러났습니다. 모든 클러스터는 Fabp4, 팬 안도세포 유전자 및 하위 집합을 발현하여 높은 수준의 Ucp1 mRNA를 발현했다.핵은 10x 유전체학으로부터 크롬을 포함하는 사실상 모든 단일 세포 수준의 유전자 발현 플랫폼을 실시할 수 있지만 핵을 분리하고 확인하였다.

isolation-adipose-tissue-nuclei-for-single-cell-genomic

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

때문에 비만 및 다른 동반 질환의 급격한 음의 연결, 역할 지방에 대한 연구는 질병에 재생 및 전반적인 건강을 보증합니다. 우리는 고립과 현장에서 사용하여 지방의 연구를 허용 지방 창고의 절제 및 생체 외 방법에 프로토콜을 제시한다.

현지화, 식별 및 절제 쥣과 지방이 종점의

단일 핵 절연은 세포막의 해리 및 세제 기반 과구화에 의존하며 최적화가 필요하며 기술 적 유물을 도입하는 경향이있는 단계입니다. 당사는 전체 조직에서 직접 그대로 핵을 신속하게 분리하기 위한 세제 및 효소 없는 프로토콜을 시연하여 단일 핵 RNA-seq(snRNA-Seq) 또는 ATAC-seq에 적합한 핵을 산출합니다.

세제 및 효소 없는 방법을 사용하여 조직 전체에서 핵 분리

이 프로토콜은 형광 활성화 세포 분류 또는 면역자기 비드 분리를 통해 쥐 복강 내 백색 지방 조직(WAT) 저장소에서 지방 형성 및 섬유 염증성 기질 세포 하위 집단을 분리하는 기술적 접근 방식을 설명합니다.

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

이 연구는 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 쥐 갈색 지방 세포를 분리하는 새로운 방법을 설명합니다.

유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 쥐 견갑골 갈색 지방 조직에서 갈색 지방 세포 분리

여기에서 우리는 수질 신장 세포 유형의 표현을 개선하고 효소 조직 해리로 인한 유전자 발현 아티팩트를 방지하는 냉동 마우스 신장에서 고품질 핵을 분리하는 프로토콜을 제시합니다.

Single-Nucleus RNA 시퀀싱을 위한 성인 마우스 신장에서 핵 분리

여기에서는 단일 핵 RNA-seq, ATAC-seq 및 관절 다중오믹스(RNA-seq 및 ATAC-seq)에 대해 급속 냉동되고 보관된 간 조직에서 핵을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

단일 세포 다중오믹스를 위한 급속 동결 간 조직으로부터 핵 분리

우리는 핵 형광 표지가 있는 형질전환 리포터 마우스에서 분리된 지방 조직으로 핵 분류를 사용하는 지방 세포에 특히 고처리량 시퀀싱(ATAC-seq)을 사용하여 전치사 효소 접근 가능한 염색질 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다.

Fluorescence-Activated Nucleus Sorting을 사용한 지방 조직을 사용한 지방 세포 특이적 ATAC-Seq

여기에서 우리는 세포핵 준비를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 심장 조직을 단일 세포로 미세 해부 및 효소 해리한 후, 전구 세포를 동결한 다음, 순수 생존 세포를 분리하여 단일 핵 RNA 시퀀싱 및 고처리량 시퀀싱 분석을 통한 전이효소 접근 가능한 염색질에 대한 단일 핵 분석에 사용했습니다.

단일 세포 분해능에서 후성유전체 및 유전자 발현 프로파일링을 위한 마우스 심장 전구 세포에서 핵 분리

이 연구는 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위해 냉동 포유류 조직에서 고품질 핵을 분리하는 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 프로토콜을 설명합니다.

단일 핵 염기서열분석을 위해 냉동 포유류 조직에서 단일 핵을 분리하기 위한 간단하고 빠르며 부분적으로 자동화된 프로토콜

근육 간 지방 조직(IMAT)의 생물학은 인체 조직의 접근성이 제한되어 있기 때문에 대부분 탐구되지 않았습니다. 여기에서는 이 고유한 지방 저장소의 세포 구성을 식별하기 위해 단일 핵 RNA 염기서열 분석을 위한 냉동 인간 IMAT의 핵 분리 및 라이브러리 준비에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

인간 근육 간 지방 조직에서 핵 분리 및 다운스트림 단일 핵 RNA 염기서열분석

배우세요 지방 조직에서 단일 핵을 분리하는 방법으로, 형광 활성화 세포 분류를 통해 고품질의 단일 세포 전사체 프로파일링을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 지방 세포 조직 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

단세포 게놈 응용을 위한 지방 조직 핵의 격리

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