메틸화 RNA 면역 침전 분석연구 m⁵C 변형에 대한 애비독증

MeRIP라고도 하는 메틸화된 RNA 면역침전은 전체 전사체에서 메틸화된 그룹을 식별하도록 설계된 방법입니다. 많은 모델 유기체의 RNA 추출물에 적용할 수 있습니다. 이 방법은 간단하고 가혹한 화학적 처리가 필요하지 않으며 특정 변수가 있는 한 모든 RNA 변형을 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.

RNA 샘플을 추출하려면 먼저 관심 식물 조직 샘플 200mg을 액체 질소 분말로 분쇄하고 절차 내내 조직이 얼어 있는지 확인합니다. 다음으로, 구아니딘 티오시아네이트와 산 페놀이 함유된 RNA 추출 시약 1ml를 지상 식물 조직에 넣고 반전으로 잘 혼합하여 모든 조직이 젖었는지 확인합니다. 실온에서 10분 후 샘플을 원심분리하고 상층액을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다.

200마이크로리터의 1-브로모-3-클로로프로판을 상층액에 첨가하고 샘플을 격렬하게 와류로 만듭니다. 원심분리로 상을 분리하고 약 500마이크로리터의 상부 수성상을 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 500마이크로리터의 이소프로판올과 50마이크로리터의 3몰 아세트산나트륨을 샘플에 첨가하고 반전으로 잘 혼합합니다.

원심분리로 RNA를 침전시키기 전에 섭씨 영하 20도에서 10분 동안 샘플을 배양합니다. 상등액을 버린 후 펠릿을 80% 에탄올 500마이크로리터로 두 번 세척하고 99% 에탄올 500마이크로리터로 한 번 세척합니다. 마지막 세척 후 펠릿을 5-10분 동안 건조시킨 후 30마이크로리터의 RNase-free 물에 용해시킵니다.

분광광도계에서 RNA 농도를 측정하고 DNase 물 및 완충 용액에서 20마이크로그램의 RNA 샘플을 분해합니다. 섭씨 37도에서 30분 배양 후 적절한 부피의 DNase 불활성화 시약을 사용하여 효소를 제거하고 표준 프로토콜에 따라 모세관 전기영동으로 분리된 RNA의 품질과 순도를 확인합니다. DNase 분해 샘플의 RNA 무결성 수가 7보다 높으면 각 RNA 샘플을 새 튜브에 최소 12마이크로그램 추가합니다.

RNA 샘플 3마이크로그램당 이전에 준비된 각 시험관 내 전사체(1개는 메틸화되고 다른 하나는 비메틸화)를 0.1 나노그램으로 스파이크하고 각 튜브의 최종 부피를 RNase가 없는 물로 80마이크로리터로 가져옵니다. 그런 다음 개별 초음파 처리 튜브에서 각 RNA 샘플의 전체 부피를 초음파 처리하고 모세관 전기 영동으로 초음파 처리 효율과 RNA 샘플의 농도를 확인합니다. 단편화된 RNA의 평균 크기는 약 100개의 뉴클레오티드여야 합니다.

메틸화된 RNA 면역침전을 위해 각 초음파 RNA 샘플 9마이크로그램과 최대 60마이크로리터의 RNase-free 물을 새로운 개별 저결합 튜브에 추가하고 RNA를 수조에서 10분 동안 섭씨 70도까지 가열합니다. 배양이 끝나면 얼음물 수조에서 샘플을 10분 동안 냉각하고 각 샘플을 20마이크로리터의 새로운 낮은 결합 튜브로 옮겨 섭씨 영하 80도의 저장 공간을 입력합니다. 각 샘플의 나머지 40마이크로리터에 RNase-free 물을 추가하여 최종 부피 860마이크로리터에 도달하고 각 샘플을 면역침전을 위한 하나의 저결합 튜브와 모의 샘플로 하나의 저결합 튜브로 분할합니다.

각 샘플에 50마이크로리터의 10X MeRIP 버퍼와 10마이크로리터의 RNase 억제제를 추가합니다. 다음으로, 면역침전 튜브에 10마이크로리터의 항-M5C 항체를 추가하고 모의 튜브에 10마이크로리터의 물을 추가합니다. 파라필름으로 튜브를 밀봉하고 오버헤드 회전으로 섭씨 4도에서 12-14시간 동안 샘플을 배양합니다.

다음 날 아침, 샘플당 15ml 튜브 1개에 40마이크로리터의 비드를 추가합니다. 800마이크로리터의 MeRIP 버퍼로 5분씩 3회 세척하고 세척당 샘플당 오버헤드 회전으로 비드를 세척하고, 세척할 때마다 자석에 비드를 모아 버퍼를 폐기할 수 있도록 합니다. 세 번째 세척 후 샘플당 40마이크로리터의 새로운 MeRIP 버퍼에 비드를 재현탁하고 40마이크로리터의 재현탁 비드를 면역침전 및 모의 샘플 튜브에 추가하여 오버헤드 회전으로 섭씨 4도에서 2시간 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 튜브를 마그네틱 랙에 1분 동안 올려 놓은 후 비드를 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 버립니다. 0.01%Tween-20이 보충된 700마이크로리터의 MeRIP 버퍼로 비드를 오버헤드 회전으로 실온에서 세척당 10분 동안 5회 세척합니다. 마지막 세척 후, 200마이크로리터의 proteinase K 소화 완충액과 3.5마이크로리터의 proteinase K에 비드를 재현탁시켜 분당 800회전으로 흔들면서 섭씨 50도에서 3시간 동안 배양합니다.

배양이 끝나면 800마이크로리터의 RNA 추출 시약과 시연된 바와 같이 산 구아니디늄 티오시아네이트 페놀 클로로포름 추출 프로토콜로 RNA를 추출합니다. 추출 후 추출된 RNA 펠릿을 정확히 20마이크로리터의 RNase-free 물에 재현탁합니다. 이 그림에는 양호한 RNA 샘플의 대표적인 실행이 나와 있습니다.

초음파 처리 후 동일한 샘플에서 약 100 개의 뉴클레오티드 크기에서 왼쪽으로 이동 된 하나의 균일 한 피크의 존재를 관찰 할 수 있습니다. 낮은 농도는 단편화 중 RNA의 손실과 샘플의 부피 증가로 인해 발생합니다. 면역침전 및 모의 샘플의 품질은 정량적 역전사효소 PCR로 평가할 수 있습니다.

이 대표적인 분석에서 메틸화된 체외 전사체의 약 80%가 면역침전 샘플에서 회수된 반면 모의 샘플에서는 약 2%만 회수되었습니다. 메틸화되지 않은 대조군의 경우, 회수율은 면역침전과 모의 샘플 모두에서 1% 미만이었습니다. 심층 염기서열분석(deep sequencing)을 수행하고 판독값을 게놈(genome)에 정렬한 후, 피크 콜링(peak call) 알고리즘을 적용하여 입력과 비교하여 면역침전 샘플에서 풍부한 통계적으로 유의한 창을 식별할 수 있습니다.

염기서열분석 데이터를 사용하여 RNA 메틸화가 가장 자주 발생하는 동기를 확인할 수 있으며 이 동기는 특정 결합 단백질을 끌어내리는 미끼 역할을 할 수 있습니다.