Name: 24 잘 조직 배양 플레이트를 사용하여 Aedes aegypti에 대한 개선 된 Fecundity 및 불임 분석 (EAgaL 플레이트) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: 학습하세요 24공 배양 플레이트를 활용한 Aedes aegypti 개체 수준 번식 적합성 평가 방법입니다. 이 프로토콜은 산란 수와 부화율 측정에 필요한 시간, 공간, 노동력을 크게 절감하여 모기 생식 생물학 및 벡터 생물학 연구에 효율적인 고처리량 스크리닝 기술을 제공합니다.

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우리는 자금 조달을 위한 텍사스 A&M 농업 연구 곤충 벡터 질병 보조금 프로그램에 감사드립니다. 또한 원고 작성 시 이 방법과 제안을 개발하는 데 도움을 준 Adelman Lab 회원과 케빈 마일스 랩 회원에게도 감사드립니다. 또한 이 원고를 더 잘 만들 수 있도록 도와준 리뷰어와 편집자들에게 감사드립니다.

1. 플레이트 준비
<ol><li>~1.6mm(1/16in)비트(도 2)를가진 가정용 드릴을 사용하여 24개의 잘 조직 배양 플레이트 뚜껑(웰당 4~6홀)에 구멍을 뚫는 구멍을 뚫는다. 참고: 이 구멍은 모기가 알을 낳을 수 있는 뚜껑에 축적되는 아가로즈에서 물 응축을 방지합니다. 여성 Ae. aegypti ("리버풀"변형)의 표준 크기는 ~ 3.11 mm 날개 길이입니다. 접시에서 탈출하지 않도록 작은 모기를 사용할 때 구멍의 크기를 줄이는 것이 좋습니다.</li>
	<li>oviposition 실험 전날, 접시를 철저히 씻고 헹구고 실온에서 30-60 분 동안 1-5 % 표백제에 담급니다. 탈이온화된 물을 철저히 헹구고 건조시다. 참고 : 이 과정은 아가로즈에서 성장하는 곰팡이와 박테리아의 기회를 감소시킵니다.</li>
	<li>용융 아가로즈를 2%로 탈온된 물에 넣고 1,000 μL 파이펫(도3A,B)을사용하여 24개의 웰 플레이트의 각 웰에 용융 아가로즈의 500 μL을 즉시 첨가합니다. 아가로즈가 식히고 파이펫 팁을 막히기 시작하면 아가로즈를 다시 가열하고 새 파이펫 팁을 사용합니다. 참고: 여성이 알을 낳을 수 있는 벽에 아가로즈 조각을 남길 수 있기 때문에 파이펫 팁으로 우물의 벽을 만지지 말고 이미징과 계산 과정을 복잡하게 만듭니다.</li>
	<li>사용하기 전에 실험실 벤치(그림 3C,D)에서하룻밤 동안 우물 벽에 응축을 말리십시오. 참고: 혈액 공급에서 유충 영상에 이르는 EAgaL 플레이트 분석의 타임라인은 식민지모기(Ae. aegypti "Liverpool")가 14h 빛:10h 의 어두운 빛 주기, 27°C, 80% 상대 습도, 500 개의 유충49.5cm x 29.2 cm 이하 의 29.2 cm 이하 의 수액 조건인 도4에 묘사됩니다. 각 실험실은 특히 다른 균주, 다른 모기 종뿐만 아니라 다른 양육 프로토콜을 사용할 때 모기가 사용되는 EAgaL 플레이트를 테스트하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>2. 모기 먹이주기
참고: 애벌레 영양이 모기 피트니스 파라미터10,11에영향을 미치기 때문에 모든 치료 그룹 및 대조군을 위해 균일한 조건하에서 사육된 모기를 사용하는 것이 중요합니다. 충분한 음식과 혼잡하지 않은 조건에서 후면 애벌레. 여성 모기가 짝짓기가 보장되고 적어도 3 일 동안 성숙되도록 남성의 면전에서 닫아 두십시오.
<ol><li>혈액 공급을 강화하기 위하여 혈액 공급하기 전에 적어도 16 시간 전에 여성 모기에서 물 및/또는 설탕의 어떤 근원든지 제거하십시오.</li>
	<li>인공 공급에 대한 물 순환기를 37°C에서 가열하고 15-30 분(그림 5A)에대한 인공 공급에 배치 척추 혈액을 사용하여 여성 모기를 공급합니다.</li>
	<li>CO2 또는 얼음으로 모기를 마취시키고, 얼음 에 유리 접시로 옮기고, 암컷이 배설및 계란 발달을 마칠 때 72 시간 이상 30 % 자당 수를 제공하는 용기에 혈액(그림 5B)으로채광된 모기를 선택합니다. 참고: 암컷이 자당물의 농도가 낮을 경우, 48시간 이후에 자당수와 젖은 표면을 제거하여 암컷이 배란되는 것을 방지하십시오.</li>
</ol>3. 오비포지션
<ol><li>모기를 접시에 옮기기 전에 약 1시간 전에, 이송 파이펫을 사용하여 각 플레이트에 2-3 방울(~80-120 μL)의 물을 넣습니다.</li>
	<li>적어도 72 h 혈액 먹이 후, CO2 또는 얼음에 모기를 녹여, 얼음에 유리 접시에 전송, 개별적으로 얼음에 24 우물 접시의 반전 뚜껑에 각 모기를 배치(그림 6A). 참고 : 이 절차는 Ioshino 외9에서적용되었습니다.</li>
	<li>모든 24 개의 모기가 배치되면, 반전 플레이트 바닥(도 6B)로뚜껑을 덮고, 신선한, 새로운 고무 밴드와 함께 뚜껑과 접시를 고정하고 환경 챔버 (또는 양육 실)에 배치 (또는 양육 실)(도 6C)모기가 복구 할 때까지 (~10-15 분) 및 플레이트 오른쪽 을 위로 돌려(그림 6D).</li>
	<li>암컷 모기가 24-48h에 대한 배란을 허용하고 큰 케이지에 접시에서 그들을 해제하여 여성을 제거합니다. 참고: 개별 여성을 추적하는 것이 중요하다면 판을 식히면 마취하고 얼음 위에 개별적으로 제거하십시오. 지연된 oviposition 및 계란 계산을 방해하는 어두운 배설물은 암컷이 72h 의 혈액 후 식사(PBM)(그림 7D)보다일찍 접시로 옮겨졌을 때 관찰되었다.</li>
</ol>4. 계란 계수
<ol><li>때때로 모기가 우물의 벽과 사진에서 해결하기 어려운 아가로즈 / 플라스틱 표면의 여백에 알을 낳는 것처럼 24 개의 우물각우물을 확인하십시오. 젖은 페인트 브러시를 사용하여 아가로즈의 벽과 가장자리에 놓인 알을 아가로즈의 평평한 표면으로 이동하여 모든 계란이 균일 한 평면에 있고 서로 겹치지 않도록합니다. 참고: 아가로즈의 가장자리는 일반적으로 아가로즈 용액의 표면 장력으로 인해 카메라의 초점 평면에서 벗어났습니다.</li>
	<li>집게를 사용하여, 화상 진찰 계란을 방해할 수 있는 우물에 있는 부러진 다리, 날개 및 그밖 입자를 제거합니다(그림 7C).</li>
	<li>스테레오현미경 조명기(그림7A)를사용하여 이미징하기 전에 어두운 모기 계란과의 대비를 높이기 위해 접시 아래에 백서를 삽입합니다.</li>
	<li>현미경 모드에서 컴팩트한 디지털 카메라를 사용하여 각 웰의 이미지를 가져 가므로 사용자가 1cm 에 가까운 물체에 집중할 수 있습니다. 이 기능을 통해 카메라를 플레이트에 직접 배치하여 삼각대 나 스탠드없이 계란을 이미지할 수있습니다(그림 7A). 덩어리에 놓인 개별 계란을 구별하려면 미세하거나 미세한 모드를 사용하여 고해상도 이미지를 캡처하여 클로즈업 세부 사항을 볼 수 있습니다. 참고: 새 이미지와 이전 이미지 간의 혼동을 방지하기 위해 사용하기 전에 카메라의 메모리 카드를 지웁습니다.</li>
	<li>플레이트의 각 웰을 촬영한 후, 이미징 주문 라벨로 플레이트 전체의 이미지를 촬영하여 나중에 각 플레이트를 구별합니다(그림7E).</li>
	<li>아가로즈 플러그와 알이 건조되는 것을 방지하고 배아 발달 및 부화를 유도하기 위해 각 우물에 이송 파이펫이 있는 얇은 층 ~5방울의 물(~200 μL)을 추가합니다. 처음 몇 시간 동안 수분에주의를 기울이고 아가로즈 또는 증발에 의한 흡수로 인한 수분 손실이 있을 수 있기 때문에 매일 확인하십시오. 유충이 부화하기에 는 레벨이 너무 낮을 때 물을 추가합니다. 참고: 물의 증발은 접시 내에서 플레이트 내에서 그리고 플레이트 더미 내에서 균일하게 발생합니다. 건조는 다음과 같은 순서로 발생하는 것으로 관찰되었습니다 : 1) 코너 우물 (A1, A6, D1, D6)이 가장 빨리 건조; 플레이트의 바깥쪽 가장자리에 2) 우물 (A2-A5, B1, B6, C1, C6, D2-D5); 그리고 마지막 3) 내부 우물. 플레이트가 쌓이면 상단 플레이트가 가장 빨리 건조됩니다.</li>
	<li>ImageJ (피지)와 컴퓨터에 이미지를 전송하고 "[플레이트 ID]_[잘 ID].jpg"[그림8A,B)와같은 쉬운 조직을 위해 파일이름을 변경합니다.</li>
	<li>스프레드시트 파일을 만들어 계란 번호(즉, fecundity)와 애벌레 숫자를 기록하고 해치 율(즉, 다산)을계산합니다(예: 도 9E).</li>
	<li>ImageJ (피지)12와 이미지를 열고 각 계란을 표시하는"멀티 포인트"도구를 사용(그림 9A−C); "+" 또는"–"덩어리로 계란을 계산하는 키"를 사용하여 확대 또는 축소. 모든 계란을 표시 한 후, 마크의 수를 제기하기 위해 멀티 포인트 아이콘을 두 번 클릭(그림 9D). 결과를 스프레드시트에 기록합니다.</li>
</ol>5. 불임 평가
참고 : 2 일 만에 첫 번째 인스타 애벌레가 우물에서 닫히기 시작할 수 있습니다. 모든 실행 가능한 계란이 부화되도록 이미징 / 카운트 전에 3-5 일을 더 기다립니다.
<ol><li>20mL의 물에 1/16 스푼(~168 mg)의 육수 사료(즉, 일반 모기 애벌레 다이어트)를 혼합하여 큰 고체 입자가 정착하기를 기다리며 애벌레 음식을 준비합니다(그림10A−D). 음식없이 오랫동안 살아남지 못하기 때문에 부화 된 애벌레가 있는 우물에 음식 (상체)을 추가하십시오. 참고: 음식 입자를 과도하게 첨가하여 부화된 애벌레의 이미징 및 계수를 방해할 수 있습니다.</li>
	<li>우물에 물을 첨가한 후 약 5-8일 후에 는 15-20분 동안 분쇄된 얼음으로 덮어 유충을 마취시켜 접시를 식힙니다.</li>
	<li>계란과 마찬가지로 접시를 얼음 위에 두면서 각 우물의 이미지를 가져 가라. 애벌레 이미지의 경우, 대비를 향상시키기 위해 접시 아래에 검은 색 재료를 삽입하여 어두운 배경을 제공합니다. 접시의 각 웰을 촬영 한 후, 나중에 각 플레이트를 구별하는 이미징 주문 라벨전체 플레이트의 이미지를 가져 가라. 참고: 절제운동이 계산을 손상시킬 수 있기 때문에 접시가 얼음 위에 있는 동안 이미지를 촬영합니다. 플레이트는 재사용 가능합니다. 동결 하 고 다음 사용을 위해 청소 모기와 아가로즈를 제거 합니다. EAgaL 플레이트는 애벌레를 고급 단계로 사육하는 데 적합하지 않습니다.</li>
	<li>ImageJ (피지)와 이미지를 열고 각 애벌레를 클릭하여 계산하는"멀티 포인트"도구를사용합니다. 3-5 일 기간 동안 일부 애벌레는 특히 유충의 낮은 수와 우물에서, 몰이 되었을 수 있습니다. 따라서, 계산할 때, 몸의 약간머리 전용 애벌레처럼 보이는 창고 큐티클(즉, 엑설비아)을 제외하거나, 수축된 애벌레(도10E)를제외한다. 결과를 스프레드시트에 기록합니다.</li>
</ol>6. 분석 수행
<ol><li>fecundity 및 불임 분석에 필요한 모든 데이터를 수집한 결과 적절한 통계 분석을 수행하고 선호하는 소프트웨어를 사용하여 그래프를 작성합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Bond, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+irradiation+dose+to+Aedes+aegypti+and+Ae.+albopictus+in+a+sterile+insect+technique+program%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization of irradiation dose to Aedes aegypti and Ae. albopictus in a sterile insect technique program.</a> PLoS One. 14 (2), 0212520(2019).</li>
<li>Fernandes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+larvae+treated+with+spinosad+produce+adults+with+damaged+midgut+and+reduced+fecundity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti larvae treated with spinosad produce adults with damaged midgut and reduced fecundity.</a> Chemosphere. 221, 464-470 (2019).</li>
<li>Inocente, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insecticidal+and+Antifeedant+Activities+of+Malagasy+Medicinal+Plant+%28Cinnamosma+sp.%29+Extracts+and+Drimane-Type+Sesquiterpenes+against+Aedes+aegypti+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Insecticidal and Antifeedant Activities of Malagasy Medicinal Plant (Cinnamosma sp.) Extracts and Drimane-Type Sesquiterpenes against Aedes aegypti Mosquitoes.</a> Insects. 10 (11), 373(2019).</li>
<li>Marrelli, M. T., Moreira, C. K., Kelly, D., Alphey, L., Jacobs-Lorena, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+transgenesis%3A+what+is+the+fitness+cost%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Mosquito transgenesis: what is the fitness cost.</a> Trends in Parasitology. 22 (5), 197-202 (2006).</li>
<li>da Silva Costa, G., Rodrigues, M. M. S., Silva, A. A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+blood-free+diet+for+Anopheles+darlingi+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Toward a blood-free diet for Anopheles darlingi (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. , 217(2019).</li>
<li>Gonzales, K. K., Tsujimoto, H., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+serum+and+BSA%2C+but+neither+red+blood+cells+nor+hemoglobin+can+support+vitellogenesis+and+egg+production+in+the+dengue+vector+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Blood serum and BSA, but neither red blood cells nor hemoglobin can support vitellogenesis and egg production in the dengue vector Aedes aegypti.</a> PeerJ. 3, 938(2015).</li>
<li>Gonzales, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effect+of+SkitoSnack%2C+an+Artificial+Blood+Meal+Replacement%2C+on+Aedes+aegypti+Life+History+Traits+and+Gut+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The Effect of SkitoSnack, an Artificial Blood Meal Replacement, on Aedes aegypti Life History Traits and Gut Microbiota.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11023(2018).</li>
<li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Candidate+Iron+Transporters+From+the+ZIP%2FZnT+Gene+Families+in+the+Mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of Candidate Iron Transporters From the ZIP/ZnT Gene Families in the Mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380(2018).</li>
<li>Ioshino, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oviplate%3A+A+Convenient+and+Space-Saving+Method+to+Perform+Individual+Oviposition+Assays+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Oviplate: A Convenient and Space-Saving Method to Perform Individual Oviposition Assays in Aedes aegypti.</a> Insects. 9 (3), 103(2018).</li>
<li>Price, D. P., Schilkey, F. D., Ulanov, A., Hansen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+mosquitoes%2C+large+implications%3A+crowding+and+starvation+affects+gene+expression+and+nutrient+accumulation+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Small mosquitoes, large implications: crowding and starvation affects gene expression and nutrient accumulation in Aedes aegypti.</a> Parasites & Vectors. 8, 252(2015).</li>
<li>Valerio, L., Matilda Collins, C., Lees, R. S., Benedict, M. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+vector+arthropod+culture%3A+an+example+using+the+African+malaria+mosquito%2C+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Benchmarking vector arthropod culture: an example using the African malaria mosquito, Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae).</a> Malaria Journal. 15 (1), 262(2016).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
</ol>

저자는이 연구에 대한 이해의 충돌을 선언하지 않습니다.

EAgaL 플레이트는 FT 방법에 비해 Aedes aegypti에서 개별 적인 fecundity 및 불임 검사를 수행하기 위해 노동, 시간 및 공간을 크게 줄입니다. FT 방법과 EAgaL 플레이트 간의 예비 비교결과 모든 단계(영상 기술이 FT 방법에 적용되었다)(표1)에대한 짧은 시간.. 참고로, 시작 및 분석당 추정치(24개의 웰 EAgaL 플레이트 대 24FT)의 비용은 표 2에제공됩니다.
EAgaL 플레이트를 사용할 때 고려해야 할 몇 가지 사항이 있습니다. 초기 관심사는 그러한 작은 공간에 놓인 모기가 제한된 움직임으로 인해 모든 알을 낳지 않을 수 있다는 것이었습니다. 이것이 사실인지 확인하기 위해 모기는 EAgaL 플레이트에서 48 h를 보낸 후 48 h를 추가로 종이 타월로 줄 지어있는 oviposition 컵이있는 큰 케이지로 집합적으로 옮겨졌습니다. 모기는 실제로 추가...

벡터 매개 병원균으로부터 인간을 보호하기 위한 모기의 통제는 중요한 공중 위생 목표입니다, 주로 모기에 의해 운반된 병원체의 대부분을 위한 효과적인 백신의 부족 때문입니다. 많은 연구는 현장 적용 인구 감소 전략1,2,3과함께 모기체력을감소시키는 것을 목표로합니다. 여기에는 형질전환 모기 및/또는 CRISPR/Cas9 녹아웃 라인을 만드는 광범위한 연구가 포함됩니다. 이러한 인구 수정 접근 방식은 개별 피트니스 매개 변수4에대한 상세한 평가가 필요합니다. 여성 모기의 적합성을 평가하는 종래의 실험실 기법은 100mL 용기5,변형된 50mL 원추형 튜브 또는 드로소필라 사육을 위한 튜브의 개별 봉쇄를 포함하며, 배란용 습기가 많은 표면을 제공함으로써 변형된 드로소필라 의 튜브(즉, 계란 종이)1,2,6,7. 이러한 방법은 상대적으로 큰 공간(예를 들어, 30cm x 30cm x 10cm: 최대 100개의 드로소필라 튜브에 대한 W x L x H)(도1)가필요하며, 계란을 계산하고 유충을 부화하기 위한 개별 계란 용지의 조작이 필요하며, 이는 노동 집약적일 수 있다. 이 원고는 모기 알을 계산하고 이러한 문제를 회피하기 위해 oviposition 표면으로 24 개의 우물 판과 아가로즈를 사용하여 해치 비율을 결정하는 방법을제시합니다 8.
동시에, Ioshino외. 9는 개별 여성에게서 얻은 계란 계수를 수행하기 위하여 12 및 24 의 우물 판을 사용하여 상세한 방법을 기술했습니다. 그들의 프로토콜은 시간과 공간9를절약하는 기존의 방법에서 상당한 개선을 나타냈다. 그러나, 그(것)들이 기술한 프로토콜은 계란이 수시로 밑에 또는 주름에서 찾아낸다기 때문에, 수를 얻기 위하여 각 개별 종이를 전개하는 것을 요구하는 oviposition를 위한 표면으로 젖은 필터 종이를 계속 이용하기 위하여 계속합니다. 그들의 프로토콜은 또한 화상 진찰 기술의 사용 또는 애벌레 계산을 위한 방법을 포함하지 않았습니다.
제시는 달걀 번호 (즉, fecundity)와 해치 비율 (즉, 불임)에 대한 적합성 애서를 수행하는 향상된 방법입니다 (즉, 불임) agarose를 사용하여 oviposition 표면으로 24 잘 조직 배양 플레이트 포맷으로 ae. aegypti는 습한 표면에 배란하는 aegypti. 이 플레이트는 Egg, 아가 로즈 및 L아르바에서 "EAgaL"플레이트로 명명되었습니다. 이 24 개의 웰 플레이트는 개별 모기에게 알을 낳기 위한 최소한의 표면을 제공하므로 며칠 동안 계란과 부화 된 애벌레를 계산하고 유지하는 데 필요한 시간과 노력을 단순화하고 크게 줄입니다. EAgaL 플레이트는 oviposition 표면에 반투명 아가로즈를 사용하며, 부화 시 계란 을 처리하고 계란과 애벌레를 찾을 필요가 없습니다. 각 웰을 촬영하는 것은 결과에 대한 장기 보관 된 기록을 설정하고 시간이 제한된 양육 / 처리 프로세스에서 시간과 공간 모두에서 계산 프로세스를 분리합니다.

<table><tbody><tr><td>1.6 mm &Phi; 드릴 비트</td><td></td><td></td><td>양자택일로 가열된 못</td></tr>은 <tr><td>1000 &mu; L 피펫 팁(긴)</td><td>Olympus 플라스틱</td><td>24-165RL</td><td></td></tr><tr><td>24웰 조직 배양 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>930186</td><td>고리형 뚜껑 플레이트가 있는 투명하고 평평한 바닥</td></tr><tr><td>아가로스</td><td>VWR</td><td>0710-500G</td><td></td></tr><tr><td>컴팩트 디지털 카메라</td><td>Olympus</td><td>TG-5/TG-6</td><td></td></tr><tr><td>컴퓨터(Windows, Mac 또는 Linux)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>탈이온수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>피지 (imageJ) 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>다운로드 : https://fiji.sc/</td></tr> <tr><td>집게</td><td>Dumont</td><td></td><td>날카로운 집게는 모기의 몸을 부러뜨릴 수 있습니다</td></tr><tr><td>유리 페트리 접시</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>가정용 표백제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>가정용 전기 드릴</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>조명기 실체 현미경 (구즈넥)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-1000 피펫</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>페인트 브러시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>디지털 카메라 이미지를 기록하기위한 고무 밴드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> SD 카드 (DSHC, SDXC가 더 좋아야 함)<tr><td>스프레드 시트 소프트웨어 (Microsoft Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>모든 스프레드 시트 소프트웨어 작동</td></tr><tr><td>TetraMin 생선 음식</td><td>테트라</td><td></td><td>그라운드 커피 그라인더, 블렌더 또는 모르터 & 유 봉</td></tr><tr><td>전송 피펫</td><td>VWR</td><td>16011-188</td><td></td></tr></tbody></table>

24 잘 조직 배양 플레이트를 사용하여 aedes aegypti에 대한 개선 된 fecundity 및 불임 분석 (eagal 플레이트)

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

모기는 다양한 병원균의 벡터로서 중요한 공중 보건 문제를 나타냅니다. 모기 피트 니스 매개 변수의 평가를 필요로 하는 그 연구에 대 한, 특히 계란 생산 및 개별 수준에서 해치 속도, 기존의 방법은 높은 노동 강도 와 실험실 공간 요구 사항으로 인해 조사자에 상당한 부담을 넣어. 설명된 간단한 방법은 각 웰에 아가로즈를 가진 24개의 잘 조직 배양 판을 사용하고, 각 웰의 디지털 이미징을 사용하여 시간과 공간 요구 사항이 크게 감소된 개별 수준에서 계란 수와 해치 비율을 결정합니다.

모기는 전술한 절차에 따라 후보철 수송기(FeT) 또는 대조군 유전자(EGFP), 혈액 공급, EAgaL 플레이트 방법을 이용한 fecundity 및 불임 출력을 측정한 dsRNA를 주입하였다.
DsRNA 주사에 따라 FeT 발현이 침묵된 모기는 계란 수와 해치 비율 모두에서 현저한 감소를나타냈다(도 11A-C). 모든 제어 및 치료 모기는 72 h PBM 후 EAgaL 플레이트에 배치되었다. 태아 침묵 모기는 또한 지연 배설 및 작고 밝은 색깔의 계란(그림 12A,B)를전시했습니다. 예결과는 츠지모토등8에서도찾을 수 있다.
<img alt="Figure 1" cl...

설명된 것은 계란을 계산하고 24개의 잘 조직 배양 판을 사용하여 개별 모기의 해치 비율을 결정하는 시간과 공간 절약 방법이며, 이는 실질적으로 fecundity 및 불임 검사의 규모와 속도를 증가시킬 수 있습니다.

24 잘 조직 배양 플레이트를 사용하여 Aedes aegypti에 대한 개선 된 Fecundity 및 불임 분석 (EAgaL 플레이트)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

이 절차는 모기 연구원이 개별적인 수준에서 그들의 모기의 생식 적 적합성을 쉽게 해결하는 것을 허용합니다. 기존의 방법에 비해, 이 프로토콜은 개별 수준에서 모기의 fecundity 및 다산을 시험하는 데 필요한 시간, 공간 및 노동력을 크게 감소시킵니다. oviposition 실험을 위한 플레이트를 준비하여 시작합니다.1.6밀리미터 비트의 가정용 드릴을 사용하여 24웰 배양 판의 뚜껑에 잘 4~6홀을 드릴한다. 실험 하루 전에 접시를 씻고 헹구고 실온에서 30~60분 동안 1%에서 5%의 표백제에 담급니다. 그런 다음, 실행 탈이온 물에서 철저하게 판을 헹구고 건조.2%아가로즈를 탈온된 물에 녹이고 24웰 플레이트의 각 웰에 용융 아가로즈 500마이크로리터를 즉시 추가합니다. 모든 응축을 건조하기 위해 밤새 실험실 벤치에 접시를 둡니다. 혈액 공급 하기 전에 적어도 16 시간, 여성 모기에서 물 또는 설탕의 어떤 소스를 제거.먹이주기 당일, 물 순환기를 섭씨 37도로 가열하고 15~30분 동안 인공 피더에 척추혈액을 공급합니다. 그런 다음 모기를 얼음에 유리 접시로 옮기습니다. 혈액으로 가득 채진 사람을 선택하고 30 %의 자당 물이있는 용기에 넣습니다.암컷이 배설및 계란 발달을 완료하는 데 적어도 72 시간을 허용하십시오. 모기를 24웰 플레이트로 옮기기 약 1시간 전에 이송 파이펫을 사용하여 2~3방울의 물을 각 우물에 넣습니다. 이산화탄소로 모기를 쓰러뜨리고 얼음 위에 있는 유리 접시로 옮겨넣습니다.그런 다음 각 모기를 24웰 플레이트의 반전 뚜껑에 개별적으로 놓습니다. 24마리의 모기가 모두 배치되면 뚜껑을 뒤집어 놓은 플레이트 바닥으로 덮고 신선한 새로운 고무 밴드로 고정하고 모기가 회복될 때까지 환경 챔버에 놓습니다. 그런 다음 플레이트를 오른쪽으로 돌립니다.암컷 모기가 24~48시간 동안 배란하도록 허용하십시오. 그런 다음 접시에서 큰 케이지로 방출하여 암컷을 제거합니다. 계란을 계산하기 전에, 그들은 사진에서 해결하기 어려운 아가로즈와 플라스틱 표면의 여백에 있는 잘 각 우물을 확인합니다.젖은 페인트 브러시를 사용하여 이 달걀을 평평한 표면으로 이동하여 모든 계란이 균일한 평면에 있고 서로 겹치지 않도록 합니다. 집게를 사용하여 화상 진찰 계란을 방해할 수 있는 우물의 부러진 다리, 날개 및 기타 입자를 제거하십시오. 현미경 모드로 컴팩트한 디지털 카메라를 설정하여 사용자가 1센티미터에 가까운

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

유전자가 뎅그열 바이러스에 대한 잠재적 내화물로 식별되면, 그것은 모기 내에서 바이러스 감염을 방지에의 역할에 대해 평가해야합니다. 이 프로토콜은 모기의 뎅그열 감염의 범위가 assayed 수있는 방법을 보여줍니다. 문화, 멤브레인 수유 모기 인간의 혈액에있는 바이러스를 성장하고, 모기 midgut에서 바이러스 titers을 시금에 대한 기술은 증명됩니다.

모기 (A. aegypti)와 감염 표현형 결정에 뎅그열 감염 프로토콜

이 프로토콜은 clonal 세포 라인 선택과 자신의 동족 GPCRs에 합성 arthropod neuropeptides의 구조 - 활동 관계를 분석하기 위해 칼슘 bioluminescence 분석에 대한 지침을 제공합니다. 이 분석은 합성 아날로그 설계 및 펩타이드 / 약물 리드 발견 수용체 deorphanization 및 구조 - 활동 관계 연구에 사용될 수 있습니다.

모기의 기능 분석을 위해 칼슘 Bioluminescence 분석 ( Aedes aegypti)와 틱 ( Rhipicephalus microplus) G 단백질 결합 수용체

RIDL ®(지배적인 치명적인 곤충을 운반하는 곤충의 방출) 시스템을 사용하여 Aedes aegypti의 인구 억제를 달성하기 위해 많은 수컷 모기를 풀어야 합니다. 이를 위해서는 대량 사육 기술과 기술을 사용하여 고품질의 남성 모기의 최대 수를 얻기 위해 신뢰할 수 있는 시스템을 제공해야 합니다.

브라질에서 필드 릴리스에 대 한 유전자 변형 Aedes aegypti의 대량 생산

계란에서 웜 (EIW) 분석은 달걀 누워 행동을 정량화 할 수있는 유용한 방법입니다. 달걀 부설의 변화는 모델 유기체의 행동 반응 할 수...

에 박테리아의 효과를 측정<em&gt; C. 엘레</em계란 보존 분석을 사용하여&gt; 행동

Aedes aegypti 모기 Wolbachia 감염 arboviruses의 전송을 억제 하는 자연적인 인구에 발표 되는. 우리 실험실 적응 및 선택 최소화 하기 위해 예방 조치를 복용 실험 및 필드 릴리스, 후면 Ae aegypti Wolbachia 감염 실험실에서 하는 방법을 설명 합니다.

Aedes aegypti 모기 감염 Wolbachia 유지

현미경 기생충 에드hazardia aedis를배양하는 프로토콜. 기생충은 애벌레 단계에서 수평 전송을 통해 다음에 Aedes aegypti 모기의 한 세대에서 통과하고 성인 단계에서 수직 전송에 선행됩니다. 살아있는 포포라진은 감염된 계란에서 장기적으로 살아남습니다.

Aedes aegypti 모기에서 현미경 포리디안 기생충 에드hazardia aedis의 전파

무균 곤충 기술 (SIT)은 화학적 통제에 내성이있을 수있는 의학적으로 중요한 특정 모기 개체군을 통제하는 데 사용됩니다. 여기에서는 Aedes aegypti 모기를 표적으로 하는 운영 SIT 프로그램에서 방출하기 위해 무균 수컷 모기를 대량 사육하고 준비하는 방법을 설명합니다.

운영 멸균 곤충 기술 프로그램에서 방출하기 위해 조사되고 표시된 수컷 Aedes aegypti 모기 준비

장내 미생물은 특정 또는 보존 메커니즘을 통해 숙주의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. Caenorhabditis elegans 는 그러한 미생물을 스크리닝하는 편리한 플랫폼입니다. 본 프로토콜은 웜 건강의 대용으로 사용되는 선충 스트레스 저항성에 미치는 영향에 대한 48개의 박테리아 분리주의 고처리량 스크리닝을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

여기에서 우리는 모델 유기체 C. elegans를 사용하여 배아 생존력과 생산된 배아(새끼)의 총 수를 결정하는 일반적인 방법을 제시합니다.

Caenorhabditis elegans의 배아 생존력 및 무리 크기 측정

본 프로토콜은 Aedes aegypti 모기의 생식력, 날개 크기, 생식력, 성비, 생존 능력, 발달 시간, 수컷 기여도 및 성체 수명을 포함한 일반적인 생명 매개 변수 데이터를 측정하는 방법을 설명합니다. 이러한 측정은 유전자 변형 모기의 적합성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

형질전환 Aedes aegypti 모기의 피트니스 비용 정량화

본 연구는 여러 실험 형식을 통합한 유연하고 표준화된 카 에노르하브디티스 엘레간 스 난자 부화 분석 플랫폼을 제시합니다. 이 접근법은 재현성, 확장성, 접근성을 높여 약물 효과와 발달 과정을 견고하게 평가할 수 있게 하면서도 연구 및 교육 환경 모두에 비용 효율적이고 쉽게 적응할 수 있습니다.

Caenorhabditis elegans에서의 간단하고 접근 가능한 난자 부화 검사: 약물 선별을 위한 적응 가능한 형식

학습하세요 24공 배양 플레이트를 활용한 Aedes aegypti 개체 수준 번식 적합성 평가 방법입니다. 이 프로토콜은 산란 수와 부화율 측정에 필요한 시간, 공간, 노동력을 크게 절감하여 모기 생식 생물학 및 벡터 생물학 연구에 효율적인 고처리량 스크리닝 기술을 제공합니다.

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