생체 내 눈 챔버에서 인간 췌장 이식 및 기여 호스트 세포의 생체 내 이미징 및 정량화

ACE는 최적의 이미징 광경입니다. 그것은 접목 상황에서 그들의 기능 및 생존가능성을 공부하기 위하여 islet 세포의 생체 내 화상 진찰에서 장기적으로 그것을 반복하는 것을 지원합니다. 그것은 또한 실시간으로 생리및 병리학 조건 하에서 그밖 양상을 공부하기 위하여 확장될 수 있습니다.

ACE 기술의 장점은 동일한 개별 인간 췌장 섬이 장기간 세포 분해능으로 비침습적으로 따를 수 있다는 사실에 있습니다. 베타 세포 대체 요법의 성공률은 계속 개선됩니다. 그러나, 생체 내에서 섬 접목및 생존의 효율성을 평가하는 것은 여전히 도전남아있다.

이 방법은 islet 이식의 결과를 평가하고 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 췌장 섬만으로만 제한되지 않습니다. 그것은 또한 영향을 받는 조직을 공부 에 적합.

예를 들어, 당뇨병 합병증에서, 신장 구체 또는 간 조각 처럼, 그냥 몇 가지 이름을. 따뜻한 가열 패드에 마우스를 배치하기 시작하려면 머리 홀더에 배치하고 코 마스크를 착용합니다. 엄지와 검지 손가락을 사용하여 머리를 약간 들어 올립니다.

측면에 금속 조각으로 고정. 귀 조각이 귀 바로 아래 머리를 고정하는지 확인합니다. 피하 시 마우스 뒷면에 buprenorphine 용액을 주입합니다.

눈꺼풀을 부드럽게 후퇴하여 무딘 집게를 사용하여 이식합니다. 눈을 밖으로 팝업 느슨하게 폴리 에틸렌 튜브로 덮여 핀셋의 쌍으로 고정. 안구건조증을 PBS가 있는 페트리 접시로 옮은 후, 눈칸에 약 20~30개의 섬을 집어들수 있습니다.

25 게이지 바늘 레벨을 위쪽으로 사용하여 각막에 팁을 조심스럽게 삽입하고 단일 측면 절개를 합니다. 섬으로 미리 로드된 캐뉼라로 각막을 조심스럽게 들어 올리고 섬이 천천히 눈에 들어올립니다. 천천히 캐뉼라를 철회하고 눈젤을 눈에 바르게 발라주세요.

10분 후, 집게를 제거하고 눈꺼풀을 잡고 눈을 정상 위치로 다시 놓습니다. 두 개의 광자 현미경으로 이식된 인간 섬의 이미징을 위해, 현미경 의 밑에 헤드 홀더 플랫폼을 놓고 각막과 렌즈 사이 침수 액체로 눈에 눈 젤을 관리하십시오. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 눈의 위치를 객관적으로 배치하고 이식된 인간 섬을 이미지화합니다.

자동 불발성을 제거하려면 이미지 처리 탭으로 이동하여 채널 산술을 선택하고 채널 1을 뺀 채널 2를 입력합니다. 이렇게 하면 새 채널 4가 만들어집니다. 혈관의 이름을 바꿉니다.

이 프로세스를 반복하고 채널 3 마이너스 채널 2를 입력하여 새 채널 5를 만들고 토마토의 이름을 모두 바꿉니다. islet을 정의하려면 수동으로 새 표면을 만들고 마법사에서 수동으로 편집하도록 선택합니다. 포인터를 선택 모드와 3D 뷰로 유지합니다.

볼륨을 클릭하여 섹션을 시각화합니다. 드로잉 탭에서 윤곽을 선택하고 그림을 클릭하여 슬라이스 위치 1에서 시작하여 개실 테두리 주위에 윤곽그리기를 시작합니다. 그런 다음 새 슬라이스 위치로 이동하고 드로잉 윤곽을 반복합니다.

주막 상단의 마지막 슬라이스로 마무리하고 표면 탭 만들기를 클릭하여 끝납니다. 다음 세그먼트, 아슬렛 혈관 및 아슬렛 토마토 형광은 아슬렛 마스크를 사용하여. 이전에 정의된 islet 마스크 개체를 선택하고 편집 탭으로 이동하여 새 창을 여는 모든 탭의 마스크를 클릭합니다.

채널 선택 드롭다운 메뉴에서 혈관 채널을 선택하고 마스크를 적용하기 전에 중복 채널을 활성화합니다. 내부, 외부 및 0.000으로 바셀을 설정하여 새로운 채널 6을 만듭니다. 이 채널의 이름을 바꿉니다.

이전 단계를 반복하고 채널 선택 드롭다운 메뉴에서 토마토를 모두 선택하고 새 채널을 만들고 이름을 바꾸려면 아틀릿 토마토를 선택합니다. 그런 다음 장면 메뉴에서 새 표면을 만들고 마법사에서 자동 생성을 선택합니다. 원본 채널을 이전에 만든 이슬 vasculature로 설정하고 배경 빼기를 선택합니다.

선택적으로 필터를 사용합니다. 예를 들어 볼륨을 선택하고 선택한 서비스 개체를 제거할 수 있는 창에서 필터를 조정합니다. 마법사를 완료하고 새 표면 오브젝트인 islet vasculature의 이름을 지정합니다.

islet vasculature 서비스 개체에서 편집 탭으로 이동 하 고 마스크 모든 탭을 클릭, 새 창을 엽니 다. 채널 선택 드롭다운 메뉴에서 아일렛 토마토 채널을 선택하고 새로운 채널을 만드는 10.000으로 바셀을 외부 표면으로 설정합니다. 이 채널의 이름을 바꿀 토마토 혈관.

토마토 캡슐 형광 신호를 분할하려면 이미지 처리 탭에서 채널 산술을 선택하고 채널 7 마이너스 채널 8을 선택하여 새로운 채널을 생성합니다. 토마토 캡슐의 이름을 바꿉니다. 이전에 설명한 대로 새 표면을 만들고 마법사에서 소스 채널, 토마토 혈관 또는 토마토 캡슐을 선택합니다.

그런 다음 배경 빼기 작업을 수행합니다. 이스렛 백스캐터 파일을 열고 새 표면을 만듭니다. 마법사에서 자동 생성을 선택하고 관심 영역을 정의합니다.

필요한 경우 임계값을 절대 강도로 조정합니다. 표면 오브젝트를 클릭하거나 끌 수 있으며 해당 채널 강도를 교차 검사할 수 있습니다. 완료되면 마법사를 닫습니다.

마지막으로 정량화를 수행하고 장면 메뉴에서 생성된 표면 오브젝트를 선택하고 통계 탭으로 이동합니다. 자세한 볼륨 데이터를 검색하려면 자세한 탭을 선택하고 드롭다운 메뉴에서 특정 값과 볼륨을 선택합니다. 총 볼륨 값을 검색하려면 자세한 탭으로 이동하여 평균 값을 선택합니다.

이 프로토콜은 8주 된 여성 적색 형광 수령마우스의 눈의 내부 챔버로 비 표지된 인간 섬을 이식하는 데 사용되었다. 대화형 이미징 소프트웨어는 이미지에서 정량적 데이터를 추출하는 데 사용되었습니다. 생체 내 형광화상에서, 인간 적인 이슬균 이식편은 마우스 이슬이식에서 관찰되지 않은 조직 자동 형광으로부터의 상당한 간섭에 의해 손상되었다.

신호 대 노이즈 비율을 개선하기 위해 자동 형광 채널이 빼졌습니다. 그런 다음 islet 마스크라고 하는 islet 경계와 해당 채널이 수동으로 정의되었습니다. 마지막으로, 토마토 신호의 분할은 눈꺼풀 혈관및 눈꺼풀 캡슐 및 최종 표면 렌더링으로 정량적 데이터를 추출하는 데 사용되었습니다.

여기에서 이식 후 2주, 2개월, 5개월 및 8개월에 동일한 인간 적국 이식의 대표적인 세로 화상 진찰 세션으로. 원래 기록된 원시 데이터의 MIP 이미지, islet 자동 형광 제거 후 처리된 이미지 및 분할된 이스탈 개체가 표시됩니다. 눈꺼풀 주입을 수행할 때, 작은 볼륨으로 섬을 미리 로드하고 스테레오 현미경에 유연한 트윈 라이트 암을 사용하여 아실 공간을 강조하여 성공적으로 ACE에 섬을 주입하십시오.

생체 내 이미징에 이어 눈을 고정하고 항체 염색 및 종래의 공론학에 대해 더 자세히 조사할 수 있다. 이 기술은 특히 혈관화, 생존 력 및 대사 연구의 맥락에서, 생리적 조건하에서 개별 인간 섬의 기능적 연구에 매우 유용합니다.