Name: 현장 별 DNA 분열을 위한 병렬 높은 처리량 단 분자 운동 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: 학습하세요 단일 분자 수준에서 DNA 절단 속도를 정량 분석하는 고처리량 병렬 분석법을. NdeI 제한효소를 활용하여 최대 1000개 DNA 분자를 동시에 측정하고 효소 활성 및 DNA 상호작용 역학을 상세히 규명하는 이 기법은 DNA 결합 메커니즘 연구에 필수적인 통계적 신뢰성을 제공합니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 보조금 MCB-1715317에 의해 지원되었다.

1. 유동 셀 만들기
<ol><li>커버립 세척<ol>
<li>커버를 염색 항아리에 넣고 에탄올 (EtOH)으로 초음파 처리한 다음 1 M KOH (각 30 분)로 초음파 처리합니다. EtOH에서 KOH 강수량을 피하기 위해 세척 사이에 ddH2O로 철저히 헹구십시오.</li>
		<li>EtOH와 KOH 세척 단계는 총 4개의 세척(EtOH 2개, KOH 2개)에 대해 1x로 반복합니다. 염색 항아리에 ddH2O에 청소 커버립을 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>깨끗한 면도기를 사용하여 로딩 및 출구 튜브 (8cm 길이)를 자르고 깨끗한 유리 슬라이드의 구멍에 삽입하십시오. 입구에 PE-20을 사용하고 PE-60을 콘센트에 사용하십시오. 에폭시 5 분 튜브를 확보하고 여분의 튜브를 잘라. 참고: 유리 슬라이드는 2'' x 3'' x 1mm를 측정합니다. 구멍은 15mm 간격으로 쌍으로 드릴링됩니다. 각 쌍은 단일 채널의 양쪽 끝을 형성합니다. 더 작은 ID를 가진 튜브는 인렛에 사용되며, 이는 업스트림 데드 볼륨을 감소시키고 따라서 필요한 혼합시간(그림 1)을감소시킨다.</li>
	<li>줄을 서서 유리 슬라이드의 구멍 위로 잘라 채널 패턴이있는 미리 절단 양면 테이프를 적용합니다. 좋은 밀봉을 달성하기 위해 플라스틱 집게로 부드럽게. 참고: 이 실험에 사용된 양면 테이프는 두께120μm이며 채널의 너비는 2mm이고 길이는 15mm입니다. 채널은 칼 프린터(재료의 표)를사용하여 절단됩니다. 하나의 커버슬립에 최대 4개의 채널을 맞출 수 있습니다. 플로우 셀의 이미지는 그림 1을 참조하십시오.</li>
	<li>백킹을 벗겨낸 후 테이프 위에 깨끗한 커버슬립(압축 공기로 건조)을 바르고 플라스틱 집게로 다시 부드럽게 하여 좋은 밀봉을 합니다.</li>
	<li>에폭시 플로우 셀을 밀봉하고 치료할 수 있도록 커버슬립에서 가장자리를 제거합니다.</li>
</ol>2. 테더링을 위한 표지된 DNA의 준비
<ol><li>PCR 튜브에서 0.02 U/μL 고충실도 DNA 폴리머라제, 200 μM dNTPs, 0.5 μM 전방 프라이머, 0.5 μM 역 프라이머 및 M13mp18 벡터 DNA의 250 ng를 포함하는 PCR 반응 믹스 50 μL을 준비한다. 참고: 여기서, 전방 프라이머(비오틴-CCAACTTAATCGCCTTGC) 및 역프라이머(디고시겐닌-TGACCAT타타타카타택트CGC)는 M13mp18 DNA의 원형 게놈에서 6338에서 107까지 의 위치를 아우르는 약 1,000bp 길이의 영역을 증폭하도록 선택되었다. 증폭 된 영역의 중간에 단일 NdeI 사이트가 있습니다. 포워드 프라이머는 5~디곡시게닌으로 표시되어 있으며, 이는 커버슬립에 항디곡시게닌을 결합합니다. 역프라이머는 5개의 비틴으로 표시되어 있으며, 이는 스트렙타비딘 코팅 구슬을 묶습니다.</li>
	<li>열순환기에서 PCR 튜브를 삽입하고 표 1에표시된 대로 사이클을 따릅니다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 PCR 정리 키트로 PCR 제품을 정화합니다. 참고: 재료 표에지정된 키트를 사용하여 일반적인 DNA 수율은 ~2 μg입니다.</li>
</ol>3. DNA와 구슬의 테더링
<ol><li>완충 A 10mL 준비 (1 M Tris-HCl [pH = 7.5], 50 mM NaCl, 2 mM MgCl2,1 mg /mL β 카제인, 1 mg / mL 플로론 F-127). 진공 건조기에서 적어도 1 h.</li>
	<li>유동 셀을 기능화하려면 PBS에 25 μL의 항디곡시겐 FAB 단편(20 μg/mL)을 유량 채널에 주입합니다. 젤 로딩 팁을 사용하여 PE-60 튜브에 맞춥니까. 실온(RT)에서 30분 동안 배양합니다.</li>
	<li>인큐베이션 후 주사기를 사용하여 채널을 통해 0.5 mL의 버퍼 A를 당겨 채널을 플러시한다. 채널에 공기를 도입하지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>기능화 후, 역현미경에 유동셀을 장착한다. 콘센트 튜브를 주사기 펌프에 연결하고 입구 튜브를 완충액 A가 함유된 미세원심분리기 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>수동으로 0.5mL 이상의 버퍼 A를 당겨 시스템을 플러시하고 펌프를 프라임합니다. 펌프를 10 μL/분에서 최소 5분 동안 실행하여 시스템을 상형화하게 합니다.</li>
	<li>구슬(재료의표)을준비하기 위해, 10 mg/mL 스톡 구슬의 구슬과 파이펫 1.6 μL의 스톡 병을 완충 A의 50 μL로, 다음 소용돌이로 소용돌이.</li>
	<li>자기 분리기를 사용하여 버퍼를 피펫하고 버퍼 A의 50 μL에서 다시 중단한 다음 소용돌이를 반복합니다.</li>
	<li>총 3개의 세차재에 대해 3.7 2배의 반복단계를 반복합니다. 마지막 세척을 위해 완충 A및 소용돌이의 100 μL에서 다시 중단하여 160 μg/mL의 최종 농도를 달성하십시오.</li>
	<li>DNA와 구슬을 복잡하게 하기 위해 먼저 완충A에서 0.5 pM의 DNA 기판을 480 μL을 준비한다. 그런 다음 160 μg/mL 비드 서스펜션의 20 μL에서 파이펫을 피펫팅하기 전에 구슬을 소용돌이시게 합니다. 회전에 3 분 동안 놓습니다.</li>
	<li>3분 후, ~15분 동안 또는 충분한 비드 테더링이 관찰될 때까지 10 μL/min의 유속으로 즉시 채널로 로드합니다. 참고: 구슬을 너무 조밀하게 포장하여 표면에서 서로 상호 작용해서는 안 됩니다(토론 섹션 참조).</li>
	<li>모든 무료 구슬의 채널을 세척하려면 입구 튜브를 완충 A의 신선한 튜브로 전환하고 50 μL/min에서 최소 10분 또는 느슨한 구슬이 관찰되지 않을 때까지 흐릅니다.</li>
</ol>4. 데이터 수집 및 분석
<ol><li>데이터 수집을 준비하기 위해 입구 튜브를 최소 100μL(0.25-4.00 U/mL)의 NdeI(0.25-4.00 U/mL)를 포함하는 마이크로센트심분리기 튜브에 넣고, 유량 채널을 통해 영구 자석을 낮추고, 암필드 이미징을 위한 광원을 축에서 분리한다. 참고: 함께 epoxied 두 개의 환상희토 자석은 데이터 수집 중에 캔틸레버 광학 포스트를 사용하여 유동 채널의 활성 표면 에서 8mm 를 유지합니다. 오프축 라이트 코스에는 거위 넥 램프가 사용됩니다.</li>
	<li>상용 현미경, 비디오 카메라 및 데이터 수집소프트웨어(재료 표)를 사용합니다. 소프트웨어에서"노출"탭을 클릭하고"노출 시간"을10MS로 설정합니다. "타임랩스" 탭 및 설정 "이미지 카운트" 600,"지속 시간"~20 분,"간격"~ 2 초. "실행"을클릭하여 데이터 수집을 시작합니다.</li>
	<li>주사기 펌프에서 유속량을 150 μL/min으로 설정하고 사출 부피를 80RunμL로 설정합니다. 주입 후 펌프를 끄고 밸브를 닫아 데이터 수집 중에 흐름을 방지합니다.</li>
	<li>데이터가 수집되면 개방형 이미지 분석소프트웨어(재료 표). "파일"탭 에서 "가져오기" | "이미지 시퀀스". 팝업 메뉴에서 이미지 파일을 찾아 "열기"를 클릭합니다.</li>
	<li>"이미지"풀다운 메뉴 아래에"Theshold" 조정"을선택하여 임계값을 설정합니다. 슬라이더 막대를 사용하여 임계값 값을 설정하여 이미지의 구슬에 해당하는 밝은 반점을 식별합니다.</li>
	<li>"분석"풀다운 메뉴에서"파티클 분석"을클릭하여 각 프레임의 밝은 반점을 계산합니다. "확인"을클릭한 다음"예"를선택하여 모든 이미지를 처리합니다. 결과 파일을 저장합니다. 참고: 이렇게 하면 녹화된 각 비디오 프레임에 구슬 수가 포함된 데이터 파일이 저장됩니다.</li>
	<li>데이터 분석소프트웨어(자료 표)를열고"파일"풀다운메뉴에서 "텍스트 파일에서 가져오기"를클릭하여 결과 파일을 가져옵니다. 비드 카운트 데이터를 대 시간 플롯합니다.</li>
	<li>"분석" 풀다운 메뉴에서"곡선 맞춤"을클릭하여Analyze구슬 수와 시간을 맞춥습니다. "자연지수" 방정식을 선택하고 클릭 "적합시도" | "괜찮아요" 참고: 샘플 주입 후 기록된 데이터만 피팅 영역에 포함해야 합니다. 피팅 함수의 지수에 맞는 매개 변수는 절단 속도가 될 것입니다.</li>
</ol>

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<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nature Communications. 7, 11409(2016).</li>
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<li>Williams, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+molecule+DNA+flow+stretching+microscope+for+undergraduates%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">A single molecule DNA flow stretching microscope for undergraduates.</a> American Journal of Physics. 79 (11), 1112-1120 (2011).</li>
<li>Song, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tethered+particle+motion+with+single+DNA+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Tethered particle motion with single DNA molecules.</a> American Journal of Physics. 83 (5), 418-426 (2015).</li>
<li>Etson, C. M., Todorov, P., Walt, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+Restriction+Endonucleases+Reaction+Mechanisms+via+Dwell-Time+Distribution+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Journal%22%5BJournal%5D)">Elucidating Restriction Endonucleases Reaction Mechanisms via Dwell-Time Distribution Analysis.</a> Biophys Journal. 106 (2), 22(2014).</li>
<li>Piatt, S., Price, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+dwell+times+with+the+Generalized+Method+of+Moments%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analyzing dwell times with the Generalized Method of Moments.</a> PLoS One. 14 (1), 0197726(2019).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

프로토콜은 실험 중에 가닥 분리가 관찰되는 경우 모든 SSDC 시스템의 역학을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 분열의 검출은 테더드 비드의 분리를 관찰하여 영향을 받아 가닥 분리의 순간을 표시한다. 모든 앞단계는 골짜기를 감지하기 전에 발생합니다. 따라서 총 전송 시간만 기록됩니다.
유동 세포 커버슬립은 항체 단백질을 깨끗한 유리에 비특이적으로 흡착하여 기능화된다. 불충분하게 세척된 유리는 항체의 결합에 영향을 미칠 수 있습니다. 테더링에서 비드 밀도는 충분히 낮아서 구슬이 상호 작용하지 않도록해야 합니다. 부착점의 표면 밀도는 기능화 중에 항체의 농도에 의해 조절될 수 있다. 구슬의 총 수는 시야의 크기에 따라 다릅니다. 이 경우, 수백에서 1,000개의 묶인 구슬은 좋은 통계를 위해 충분했으며 비드 비드 상호 작용을 피했습니다. 비드 주입 하는 동안, 표면 테더링은 라이브 비디오를 통해 모니터링 되었다. 비드 주사는 예상 된 비드 수가 사이 있을 때 중지 되었다 500 그리...

사이트별 DNA 분열(SSDC)은 많은 게놈 트랜잭션의 핵심 단계이다. 예를 들어, 세균 제한 수정(RM)1 및 CRISPR2 시스템은 특정 서열에서 외국 DNA를 인식하고 c떠나서 파지 및 플라스미드에 의한 공격으로부터 세포를 보호합니다. II형 RM에서, 제한 엔도니션리스(REs)는 단백질-핵산 상호작용3을통해 짧은 4-8염기쌍(bp) 서열을 인식한다. Cas9과 같은 CRISPR 관련 엔도누리스는 crRNA가 엔도니클리스4에바인딩된 대상 사이트의 혼성화를 통해 사이트에 바인딩됩니다. 사이트별 이중 좌초 휴식(DSBs)의 생성은 또한 많은 DNA 재조합 이벤트5의첫 번째 단계이다. 예를 들어, V(D)J 재조합에 의해 생성된 항원 결합 영역의 다양성은 특정 표적 부위6의인식 및 분열을 필요로 한다. 일부 트랜스포슨은 7뿐만아니라특정 DNA 서열을 표적으로 하는 것으로 알려져 있다. 당연히 Cas9와 같은 이러한 공정에 관여하는 많은 사이트 별 뉴클레아제는 유전자 편집 기술의 핵심 구성 요소입니다8. 또한, 새로운 사이트별 엔도나클레스(즉, 아연 핑거 뉴클레아제9 및 TALENS10)도게놈을 편집하도록 설계되었다.
많은 방법은 핵산의 사이트 별 분열의 운동학을 측정하기 위하여 채택되었습니다. 여기에는 겔 분석,형광(11,,12)및 시퀀싱 기반방법(13)이포함됩니다. DNA의 단일 분자에서 DSBs가 가닥 분리 후 비드의 움직임에 의해 검출될 수 있도록 하는 마이크로비드의 테더링으로 중요한 발전이 이루어졌습니다. 이러한 방법에서, 다른 유형의 힘은 비드 포스트 분열의 가닥 분리 및 움직임을 보장하기 위해 사용된다. 한 경우, 광학 트랩은 EcoRV14에의해 DNA의 분열을 측정하는 데 사용되었습니다. 이러한 실험에서 대상 검색은 조사의 목적이며, 사이트별 바인딩이 속도 제한 단계되도록 조건이 최적화되어 있습니다. 광학 트랩의 한 가지 단점은 한 번에 단일 DNA만 관찰할 수 있다는 것입니다. 또한, 가닥 분리를 테스트하기 위해 주기적인 큰 당기는 힘을 적용해야 한다.
또 다른 기술은 흐름과 약한 자기력의 조합을 사용하여 연속적인 방식으로 구드를당긴다(15). 이러한 방식으로, NdeI에 의한 확산 제한 분열이 측정된다. 이 방법을 사용하면 한 번에 수백 개의 DN을 동시에 측정할 수 있으므로 단일 실험에서 통계적 유의를 얻을 수 있습니다. 자기 핀셋을 기반으로 한 실험도 사용되었습니다. 이러한 연구에서는, 레트로바이러스 인테그라스는 삽입 올리고뉴클레오티드(16)에 DSB를 포함시킴으로써 연구되었다.16 성공적인 통합은 묶인 DNA에 DSB를 통합하고 부착된 비드의 손실을 초래했습니다. ATP 의존형 III 제한 엔토누리스 에코피의 유사한 연구에서, 수십 개의 DNA가 단일실험(17)에서관찰되었다. 자기 핀셋은 긴장뿐만 아니라 DNA 루핑이 반응 중에 제어및 모니터링될 수 있다는 이점을 보유하고 있습니다.
여기에 제시된 DNA의 대규모 테더링의 최근 개선을 활용하는 SSDC 운동학을 측정하기 위한 매우 병렬적인 단일 분자 방법이 있습니다. 본 방법은 DNA복제(18)및 DNA 19의 윤곽 길이, 및REs(15)에의한 절단을 측정하는 데 사용되는 이전 방법의 개선 및 확장이다.19 이 기술에서, 인식 서열의 단일 사본을 포함하는 선형 DNA는 한쪽 끝에 비오틴으로 제조되고 다른 쪽은 디곡시게닌을 제조한다. 비오틴은 파라마그네틱 마이크로비드에 공동으로 부착된 스트렙타비딘을 결합합니다. DNA 비드 복합체는 항 디곡시겐 FAB 단편으로 기능화된 미세유체 채널로 주입됩니다. 그런 다음 DNA는 디곡시게닌의 결합을 통해 표면 부착 점에 결합하여 흡착된 FAB 단편에 결합합니다. 영구 자석으로 가해지는 약한 자기력은 비포장물이 표면에 특별히 달라붙지 않도록 합니다. 시료는 골짜기 반응을 활성화하기 위해 유동 채널에 빠르게 주입(&30 s)할 수 있다. 데이터 수집 중에 흐름이 꺼져 있습니다. 각 DNA가 갈라질 때, 비드가 목표의 초점 계획에서 위아래로 이동하는 프레임을 기록하여 정확한 분열 시간을 결정할 수 있으므로 비디오 레코드에서 사라집니다. 남은 구슬의 프레임별 개구부는 반응 진행 상황을 정량화하는 데 사용될 수 있다.
다음은 NdeI를 사용하여 수집된 전체 프로토콜과 예제 데이터입니다. 이 기술을 어떻게 적용할 수 있는지의 예로, 단백질 농도의 범위에 대한 절단 비율은 필수 금속 보조인인 마그네슘의 두 가지 농도로 측정됩니다. 프로토콜의 이 응용은 NdeI를 사용하지만, DNA 기판 설계를 변화시킴으로써 임의의 부위 별 뉴클레아제와 함께 사용하기 위해 방법을 조정할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>5분 에폭시</td><td>Devcon</td><td>14250</td><td></td></tr><tr><td>안티 디곡시제닌 FAB 단편</td><td>Roche Diagnostics</td><td>11214667001</td><td></td></tr><tr><td>카메라 및 소프트웨어</td><td>Jenoptik</td><td>GRYPHAX SUBRA</td><td></td></tr><tr><td>데이터 분석 소프트웨어</td><td>Vernier Inc.</td><td></td><td></td>LP</tr><tr><td>양면 테이프</td><td>Grace Biolabs</td><td>SA-S-1L</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 95%</td><td>VWR</td><td>89370-082</td><td></td></tr><tr><td>포워드 프라이머: digoxigenin-CCAACTTAATCGCCTTGC</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>TE2000</td><td></td></tr><tr><td>나이프 프린터</td><td>실루엣</td><td></td><td></td></tr><tr><td>M13mp18 DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>N4040S</td><td></td></tr><tr><td>MyOne streptavidin beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>NdeI 효소</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>PCR cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>pluronic F-127</td><td>Anatrace</td><td>P305</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙 PE-20</td><td>BD Intramedic</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 튜빙 PE-60</td><td>BD Intramedic</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Mastermix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0492S</td><td></td></tr><tr><td>희토류 자석 0.5 "OD 0.25"ID</td><td>국내 수입</td><td>NSN0814</td><td></td></tr><tr><td>희토류 자석 0.75" OD 0.5" ID</td><td>국내 수입품</td><td>NSN0615</td><td></td></tr><tr><td>리버스 프라이머: 비오틴-TGACCATTAGATACATTTCGC</td><td>통합 DNA 기술</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>Kent Scientific</td><td>Genie Plus</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-소 우유</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td>의 카제인</tr></tbody></table>

현장 별 dna 분열을 위한 병렬 높은 처리량 단 분자 운동 분석

Parallel High Throughput Single Molecule Kinetic Assay for Site-Specific DNA Cleavage

사이트별 DNA 분열(SSDC)은 많은 세포 과정의 핵심 단계이며 유전자 편집에 매우 중요합니다. 이 작품은 많은 단일 DNA 분자에서 SSDC를 동시에 측정할 수 있는 운동 분석을 설명합니다. 비드 테더드 기판 DNA는 각각 표적 서열의 단일 복사본을 포함하는 미세 유체 흐름 채널에서 제조된다. 외부 자석은 파라자성 구슬에 약한 힘을 적용합니다. 최대 1,000개의 개별 DN의 무결성은 넓은 분야의 낮은 배율 목표를 사용하여 암필드 이미징 에서 마이크로비드를 시각화하여 모니터링할 수 있습니다. 제한 엔도니엔탈리스의 주입, NdeI, 분열 반응을 시작합니다. 비디오 현미경 검사는 관련 비드가 목표의 초점 평면에서 위아래로 이동하는 프레임을 관찰하여 각 DNA 분열의 정확한 순간을 기록하는 데 사용됩니다. 프레임별 비드 카운팅은 반응을 정량화하고 지수핏으로 반응 속도를 결정합니다. 이 방법을 사용하면 단일 실험에서 단일 분자 SSDC 반응에 대한 정량적 및 통계적으로 유의한 데이터를 수집할 수 있습니다.

이 기술을 이용하여, NdeI의 SSDC 비율은 마그네슘(2mM 및 4mMMM)의 2개의 상이한 농도에서 단백질 농도(0.25-4.00 U/mL)의 범위에 대해 측정되었다. 이러한 각 조건은 실험당 수백에서 1,000개의 Tetheed DNA와 함께 적어도 두 번 복제되었습니다. 그림 2는 실험 설계를 설명합니다. 그림 3에서는 데이터 수집 및 분석 세부 정보의 예제를 보여 주습니다. 도 4는 이 비율이 마그네슘의 두 농도에서 단백질 농도에 어떻게 의존하는지 보여줍니다. 단백질 농도가 충분히 낮을 때, 비율은 단백질에 비례하고 마그네슘과 무관하다는 것을 관찰할 수 있다. 충분히 높은 단백질 농도의 경우, 속도는 마그네슘에 의존하지만 단백질 농도와 는 무관합니다.
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단일 분자 수준에서 DNA의 부위 별 분열을 측정하는 매우 병렬적인 방법이 기재된다. 이 프로토콜은 제한 엔도니올리스 NdeI를 사용하는 기술을 보여 줍니다. 이 방법은 사이트별 DNA 분열의 결과를 초래하는 모든 과정을 연구하기 위해 쉽게 수정될 수 있다.

현장 별 DNA 분열을 위한 병렬 높은 처리량 단 분자 운동 분석

Site-specific DNA cleavage (SSDC) is a key step in many cellular processes, and it is crucial to gene editing. This work describes a kinetic assay capable ...

이 프로토콜은 이중 좌초 된 DNA 중단을 초래하는 모든 프로세스에 적용 할 수 있으며 운동학에 대한 자세한 정량적 데이터를 산출합니다. 이 방법은 단일 분자 해상도를 가지고 있지만, 단일 실험에서 최대 1000 DNA를 측정하므로 좋은 통계를 제공합니다. 이 방법의 1차 적용은 DNA 결합 및 수정에 관여하는 메커니즘을 연구하는 것입니다.예를 들면, 우리는 모든 DNA 결합 단백질과 관련있는 DNA 표적 검색을 공부에 관심이 있습니다. 처음으로이 기술을 시도 할 때, 단일 분자 밧줄은 섬세하다는 것을 기억, 한 번 형태, 주의처리해야합니다. 기능화 표면의 적절한 비율은 필수적입니다.흐름을 그렇게 하기위한 몇 가지 트릭이 있습니다. 데이터 수집 중에 샘플 튜브를 전환할 뿐만 아니라 시각적 데모를 사용하면 이 절차를 새로 사용할 수 있습니다. 커버 슬립을 씻으려면 염색 항아리에 놓고 에탄올로 30 분 동안 초음파 처리하십시오.탈이온화및 증류수로 철저히 헹구고, 수산화칼륨 1개에 담그고 30분 동안 초음파 처리합니다. 세척 시퀀스를 반복하여 세척 할 때마다 덮개 전표를 물로 헹구십시오. 청소된 커버 슬립을 물로 염색하는 항아리에 보관합니다.깨끗한 면도기를 사용하여 8센티미터 길이의 로딩 및 출구 튜브를 자르고 깨끗한 유리 슬라이드의 구멍에 삽입합니다. 튜브에 에폭시하고 그것을 확보하기 위해 5 분 동안 치료할 수 있습니다. 양면 테이프를 유리 슬라이드에 채널 패턴으로 미리 잘라내고 플라스틱 집게로 매끄럽게 하여 좋은 밀봉을 만듭니다.테이프에서 백업을 벗기고 깨끗한 커버 슬립을 적용하여 집게로 부드럽게 합니다. 이어서, 커버의 가장자리를 에폭시로 미끄러져 유동 세포를 밀봉하고 치료하게 한다. 원고 방향에 따라 PCR을 수행하여 테더링을 위해 표지된 DNA를 준비합니다.그런 다음 PCR 정리 키트로 PCR 제품을 정화합니다. 버퍼 A10 밀리리터를 준비하고 진공 건조기에서 1시간 이상 분해합니다. 유동 셀을 기능화하기 위해, PBS에 안티 디곡시겐과 팹 조각의 25 마이크로 리터를 유량 채널에 주입하여 PE60 튜브에 맞게 젤 로딩 팁을 사용한다.30 분 동안 실온에서 유동 셀을 배양합니다. 인큐베이션 후, 주사기로 채널을 통해 버퍼 A의 0.5 밀리리터를 당겨 채널에 공기를 도입하지 않도록주의하십시오. 그런 다음, 반전 된 현미경에 흐름 세포를 산.콘센트 튜브를 주사기 펌프에 연결하고 입구 튜브를 버퍼 A.수동으로 버퍼 A의 0.5 밀리리터를 당겨 시스템을 플러시하고 펌프를 프라임하는 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 그런 다음 펌프를 분당 10 마이크로리터에서 5분 이상 실행하여 시스템을 상형화할 수 있도록 합니다. 구슬의 스톡 병을 소용돌이, 및 파이펫 1.6 버퍼 A의 마이크로 리터로 구슬의 마이크로 리터, 다음 다시 소용돌이.구슬을 자기 분리기 위에 놓고 버퍼를 피펫합니다. 버퍼 A의 50 마이크로 리터에서 다시 중단하고 그들을 소용돌이. 마지막 세척 후, 밀리리터 당 160 마이크로 그램의 최종 농도에 대한 버퍼 A의 100 마이크로 리터에서 구슬을 다시 중단합니다.완충A에서 0.5 피코몰라 표지 DNA 기판의 480 마이크로리터를 준비하고, 파이펫 20 마이크로리터의 비드 현탁액을 희석된 DNA로 준비한다. 혼합물을 회전에 3분간 놓습니다. 3분 후, 15분 동안 분당 10마이크로리터의 유속으로 또는 충분한 비드 테더링이 관찰될 때까지 즉시 채널에 샘플을 적재한다.입구 튜브를 완충 A의 신선한 튜브로 전환하여 모든 무료 구슬의 채널을 세척하고 분당 50 마이크로 리터에서 10 분 이상 또는 느슨한 구슬이 관찰되지 않을 때까지 흐릅니다. 또한 인라인 밸브를 사용하여 흐름을 차단하고 튜브를 전환하는 것이 좋습니다. 하나의 부드러운 동작으로 튜브를 전환하고 백플로우를 피하기 위해 새롭고 오래된 샘플 튜브의 액체 수준이 일치하는지 확인합니다.데이터를 수집하기 전에 DNA 분열 효소의 정확한 농도를 준비하고 입구 튜브를 샘플에 삽입합니다. 유동 셀 위에 자석을 낮춥춥시다. 펌프를 설정하여 분당 150 마이크로리터에 80마이크로리터의 샘플을 주입하고 데이터 수집을 시작합니다.데이터 수집에 1 분, 펌프를 활성화. 여기에 반응 전후에 테더드 구슬의 대표적인 이미지가 표시됩니다. 데이터 분석은 분열 반응 전반에 걸쳐 테더드된 구슬의 수를 정량화하기 위해 수행되었다.이 기술은 밀리리터 당 0.25에서 4 단위에 이르는 단백질 농도에 대한 Nde1의 부위 특이적 DNA 절단 비율을 측정하고, 마그네슘의 2개의 상이한 농도를 측정하는 데 사용되었다. 각 조건은 실험 당 몇 100 에서 1000 테더 DNA와 함께 적어도 두 번 복제되었다. 충분히 낮은 단백질 농도에서, 속도단백질에 비례하 고 마그네슘과 무관하다.고단백 농도의 경우, 비율은 마그네슘에 의존하지만 단백질 농도와는 무관합니다. 이 프로토콜을 시도할 때 튜브 및 흐름 채널의 기포가 실험을 실행할 수 있음을 명심하십시오. 튜브를 전환하는 동안 라인에 공기를 허용하지 말고 사용하기 전에 모든 버퍼를 분해하십시오.테더링 방법을 사용하면 DNA에서 긴장의 효과가 반응에 미치는 영향을 탐구할 수 있습니다. 이는 데이터 수집 중에 자석 강도를 변화거나 흐름을 적용하여 달성할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

8 oxoguanine의 DNA glycosylase의 glycosylase 활동 시간 코스 제품의 형성과 선형 정상 상태 위상 버스트를 전시 이상성입니다. 각각 8-oxoguanine 및 제품 DNA에서 glycosylase 릴리스의 절제에 해당 담금질 흐름 기술, 버스트 및 정상 상태 속도를 측정 할 수 있습니다, 활용.

DNA의 Glycosylase 활동에 대한 정상 상태, 전 정상 상태 및 단일 매출 운동 측정

박테리오파지 T7의 복제 단백질을 사용하여 지연 가닥 시작의 동역학을 조사하기 위해 민감한 겔 기반 불연속 분석법을 설명합니다.

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quantum-dot-labeled DNA와 total internal reflection fluorescence microcopy를 사용하여 unlabeled protein을 사용하면서 restriction endonucleases의 반응 메커니즘을 조사할 수 있습니다. 이 단일 분자 기법을 사용하면 개별 단백질-DNA 상호 작용을 대규모로 다중화하여 관찰할 수 있으며, 데이터를 풀링하여 잘 채워진 체류 시간 분포를 생성할 수 있습니다.

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of restriction Endonuclease-mediated DNA cleavage(제한 엔도뉴클레아제 매개 DNA 절단의 단일 분자 체류 시간 분석)

SAMHD1은 인체 건강과 질병에 중요한 역할을 하는 디옥시뉴클레오시드 삼인산삼인산삼인산가수분해효소입니다. 여기에서는 SAMHD1 기질, 활성제 및 억제제로서 소분자 및 뉴클레오티드 유사체를 평가할 수 있는 384웰 마이크로플레이트 형식으로 배포된 다목적 효소 결합 SAMHD1 활성 분석을 제시합니다.

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핵산-대사 효소를 분석하기 위해 변형된 합성 올리고뉴클레오티드를 사용

우리는 발광 기반 염색체 외 리포터 기질 세트를 사용하여 세포에서 이중 가닥 절단 복구 경로 숙련도를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

고처리량 및 정량적 발광 기반 리포터 분석을 사용한 DNA 이중 가닥 파손 복구 활성 평가

이 프로토콜은 CMG helicase에 의한 DNA 풀림의 실시간 시각화를 위한 단일 분자 분석을 수행하는 방법을 보여줍니다. (1) DNA 기질 준비, (2) 형광 표지된 Drosophila melanogaster CMG helicase를 정제하는 방법, (3) 전반사 형광(TIRF) 현미경 검사를 위한 미세유체 플로우 셀을 준비하는 방법, (4) 단일 분자 DNA 풀기 분석에 대해 설명합니다.

CMG Helicase를 이용한 DNA 풀림의 단일 분자 실시간 시각화

이 프로토콜은 형광 현미경 기반 단일 분자 DNA 복제 분석의 개요를 설명하여 DNA 중합효소와 G-4중 구조와 같은 장애물 간의 상호 작용을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

G-Quadruplexes에서 DNA 중합효소 역학의 단일 분자 형광 시각화

학습하세요 단일 분자 수준에서 DNA 절단 속도를 정량 분석하는 고처리량 병렬 분석법을. NdeI 제한효소를 활용하여 최대 1000개 DNA 분자를 동시에 측정하고 효소 활성 및 DNA 상호작용 역학을 상세히 규명하는 이 기법은 DNA 결합 메커니즘 연구에 필수적인 통계적 신뢰성을 제공합니다.

현장 별 DNA 분열을 위한 병렬 높은 처리량 단 분자 운동 분석

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