2020년 5월 20일
루프 매개 이소성 증폭(LAMP)은 병원체 검출 분야에 대한 폭넓은 관심을 받고 있는 이더스말 핵산 증폭 시험(iNAAT)이다. 여기서, 우리는 동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 추정 살모넬라를 확인하는 신속하고 신뢰할 수 있고 강력한 방법으로 다연구소 검증 살모넬라 LAMP 프로토콜을 제시합니다.
이 Salmonella LAMP 방법은 FDA의 세균 분석 매뉴얼에 동물 식품의 스크리닝 방법 및 추정 Salmonella 분리물에 대한 확인 방법으로 통합되었습니다. 이 방법은 빠르고 안정적이며 강력합니다. PCR과 비교하여 주요 장점으로는 신속한 테스트, 간단한 기기, 낮은 위음성률 및 유연한 작업 흐름이 있습니다.
살모넬라균과 같은 병원체에 대한 신속한 스크리닝은 오염 가능성이 있는 제품을 신속하게 검출하는 데 중요한 역할을 하며 인간과 동물의 질병이나 발병을 예방할 수 있습니다. LAMP 분석을 위한 DNA 템플릿을 준비하는 것으로 시작합니다. DNA 템플릿을 만드는 데 사용되는 샘플에는 두 가지 유형이 있습니다.
동물성 식품 샘플에서 템플릿을 준비하려면 25g의 식품 샘플을 무균 중량으로 멸균 필터 백에 넣습니다. 225ml의 멸균 완충 펩톤 물을 백에 넣고 섭씨 35도에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 후 백의 여과된 면에서 1ml를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
튜브를 900배 G로 1분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 16, 000 시간 G에 2 분 동안 표본을 원심 분리하십시오.
그리고 상등액을 버리기 위해, 시료 준비 시약 100 마이크로 리터에 펠릿을 재현탁시키고 건조 열 블록에서 섭씨 100도에서 10 분 동안 가열한다. 그런 다음 샘플을 실온으로 냉각하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 이 LAMP 분석을 위한 두 번째 유형의 샘플은 추정 살모넬라 배양물에서 직접 가져옵니다.
DNA 템플릿을 준비하려면 하룻밤 동안 배양한 살모넬라균 500마이크로리터를 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 섭씨 100도의 열 블록에서 10분 동안 가열합니다. 그런 다음 샘플을 실온으로 냉각하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 LAMP Master Mix를 준비하고 DNA 템플릿을 추가하는 데 사용되는 영역을 물리적으로 분리하십시오.
이소프로판올과 DNA 및 DNA의 분해 용액으로 작업 표면을 청소합니다. 그런 다음 피펫과 튜브 스트립 홀더를 청소합니다. 등온 마스터 믹스, 10X 프라이머 믹스, 분자 등급 물, 양성 대조군 DNA 및 DNA 템플릿을 실온에서 해동합니다.
LAMP 기기를 켜고 관련 s를 입력하십시오.amp르 정보. 원고의 지시에 따라 LAMP Master Mix를 준비하고, 간단히 와류 및 원심분리를 한 다음, 23마이크로리터의 Master Mix를 튜브 스트립의 각 웰에 분배합니다. 모든 DNA 템플릿을 소용돌이치고 간단히 원심분리합니다.
그런 다음 2마이크로리터의 DNA 템플릿을 적절한 웰에 추가하고 웰을 단단히 캡을 씌웁니다. 홀더에서 튜브 스트립을 제거하고 모든 시약이 튜브 바닥에 고였는지 확인하기 위해 두드립니다. 튜브 스트립을 LAMP 기기에 로드하고 LAMP 실행을 시작합니다.
LAMP 반응이 진행되는 동안 Temperature, Amplification, and Anneal 탭을 눌러 LAMP 실행 중 다양한 매개변수의 동적 변화를 확인합니다. LAMP 결과는 LAMP 계기판에서 실시간으로 또는 LAMP 소프트웨어를 사용하여 볼 수 있습니다. 계기판에서 결과를 해석하려면 관심 있는 LAMP 실행.
각 실행과 연결된 5개의 탭을 관찰합니다. Profile 및 Temperature 탭에는 LAMP 반응이 진행됨에 따라 샘플 웰의 프로그래밍된 온도와 실제 온도가 표시됩니다. Amplification 및 Anneal 탭은 각각 Amplification 및 Anneal 단계 동안의 형광 판독값과 형광 변화를 보여줍니다.
Results 탭에는 원고의 방향에 따라 해석할 수 있는 LAMP 결과의 표 보기가 표시됩니다. LAMP 결과를 보는 두 번째 방법은 LAMP 소프트웨어를 사용하는 것입니다. 소프트웨어로 결과를 해석하려면 왼쪽 패널에서 컴퓨터 아이콘을 클릭하고 파일 위치로 이동하여 관심 있는 LAMP 실행을 로드합니다.
각 실행과 연결된 7개의 탭을 관찰합니다. Profile 및 Temperature 탭에는 LAMP 반응이 진행됨에 따라 샘플 웰의 프로그래밍된 온도와 실제 온도가 표시됩니다. Amplification 및 Amplification Rate 탭은 증폭 단계 동안의 형광 판독값과 형광 변화를 보여줍니다.
Anneal 및 Anneal Derivative 탭은 Anneal 단계 동안 형광 판독값과 형광 변화를 보여줍니다. 결과 탭에는 LAMP 결과의 테이블 형식 보기가 표시됩니다. 그래프 이름(Graph Name), 웰 번호(Well Number), 웰 이름(Well Name) 및 피크 값(Peak Value)이라는 제목의 4개의 열이 있습니다.
8개 샘플 모두의 Amp Time 및 Anneal Derivatives가 표시됩니다. 결과는 원고의 지시에 따라 해석될 수 있습니다. LAMP 계기판과 LAMP 소프트웨어를 사용하여 분석 결과를 표시할 수 있습니다.
이 LAMP 실행에서 샘플 S1에서 S6은 Salmonella enterica serovar Infantis ATCC 51741의 10배 연속 희석액으로, 반응당 110만 개에서 11개의 집락 형성 단위에 이릅니다. 양성 대조군 또는 PC는 반응당 17, 000 집락 형성 단위의 Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2이며, 무 템플릿 대조군 또는 NTC는 분자 등급의 물입니다. NTC 웰은 LAMP 계기판에서 약 81°C의 빈 Tmax와 Aneal 온도를 가지며 LAMP 소프트웨어에서 blank Tmax와 빈 어닐링 온도를 갖습니다.
포지티브 컨트롤 웰은 두 플랫폼 모두에서 Tmax가 7분 45초이고 어닐링 온도가 약 섭씨 90도입니다. 샘플 S1 내지 S6은 Tmax가 6분 및 30초 및 12분 및 15초 사이이고 어닐링 온도가 약 섭씨 90도이며 모두 양성 검출을 나타냅니다. LAMP는 매우 효과적이며 많은 양의 DNA를 생성합니다.
따라서 교차 오염을 방지하기 위해 최상의 실험실 관행을 사용하는 것이 중요합니다. 오염된 동물성 식품을 농축하면 살모넬라균 수치가 높아질 수 있으므로 DNA 템플릿을 만들 때도 유사한 방법을 사용하십시오. LAMP로 검사한 동물 사료 검체 검사에서 양성 반응을 보인 경우 FDA의 세균 분석 매뉴얼(Bacteriological Analytical Manual)의 절차에 따라 배양 분리를 통해 확인해야 합니다.
음성 샘플은 이와 같이 보고될 수 있습니다. 이 LAMP 분석법이 FDA의 세균 분석 매뉴얼에 통합됨에 따라 식품 안전 검사에서 이 빠르고 강력하며 사용자 친화적인 기술을 광범위하게 적용할 수
있게 되었습니다.이 연구는 동물성 식품에서 살모넬라를 신속하게 검출하기 위한 검증된 루프-매개 이소성 증폭(LAMP) 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 전통적인 PCR에 비해 더 빠른 결과와 더 낮은 위양성 비율을 제공하여 잠재적 오염을 식별하는 신뢰할 수 있는 도구가 됩니다.
Rapid pathogen detection in animal food is critical for preventing contamination events that could impact both animal and human health. The LAMP method provides a reliable, inhibitor-tolerant nucleic acid test that supports timely screening and confirmation workflows in food safety testing. Its incorporation into the FDA BAM underscores its value as a standardized, deployable tool for biopharma and food safety laboratories seeking to reduce false negatives and accelerate decision-making.
The LAMP method fits within food safety testing workflows as a rapid screening tool followed by culture-based confirmation when positive, supporting a tiered testing strategy.