Name: 동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 살모넬라를 확인하기 위한 루프 중재 이더말 증폭 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 배우세요 동물성 식품에서 살모넬라를 신속하게 선별하고 확인하는 LAMP 방법을 사용하세요. 이 기술은 PCR보다 빠른 결과와 낮은 위음성률로 식품 안전 검사에 탁월합니다.

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저자는 살모넬라 LAMP 방법 검증 연구를 비판적으로 검토하기 위한 FDA의 미생물학 방법 검증 소위원회 (MMVS) 및 세균성 분석 매뉴얼 (BAM) 위원회의 회원들에게 감사드립니다.

<ol><li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Research. 28 (12), 63(2000).</li>
<li>Kaneko, H., Kawana, T., Fukushima, E., Suzutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+of+loop-mediated+isothermal+amplification+to+a+culture+medium+and+biological+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 70 (3), 499-501 (2007).</li>
<li>Francois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of a loop-mediated isothermal amplification reaction for diagnostic applications.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 62 (1), 41-48 (2011).</li>
<li>Yang, Q., Wang, F., Prinyawiwatkul, W., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robustness+of+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+food+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Robustness of Salmonella loop-mediated isothermal amplification assays for food applications.</a> Journal of Applied Microbiology. 116 (1), 81-88 (2014).</li>
<li>Nagamine, K., Watanabe, K., Ohtsuka, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+using+a+nondenatured+template%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification reaction using a nondenatured template.</a> Clinical Chemistry. 47 (9), 1742-1743 (2001).</li>
<li>Zhang, X., Lowe, S. B., Gooding, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brief+review+of+monitoring+methods+for+loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Brief review of monitoring methods for loop-mediated isothermal amplification (LAMP).</a> Biosensors & Bioelectronics. 61, 491-499 (2014).</li>
<li>Nagamine, K., Hase, T., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+reaction+by+loop-mediated+isothermal+amplification+using+loop+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers.</a> Molecular and Cellular Probes. 16 (3), 223-229 (2002).</li>
<li>Yang, Q., Domesle, K. J., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+for+Salmonella+detection+in+food+and+feed%3A+Current+applications+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Foodborne+Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification for Salmonella detection in food and feed: Current applications and future directions.</a> Foodborne Pathogens and Disease. 15 (6), 309-331 (2018).</li>
<li>Mori, Y., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+Expansion+of+its+practical+application+as+a+tool+to+achieve+universal+health+coverage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): Expansion of its practical application as a tool to achieve universal health coverage.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 26 (1), 13-17 (2020).</li>
<li>Mansour, S. M., Ali, H., Chase, C. C., Cepica, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+for+diagnosis+of+18+World+Organization+for+Animal+Health+%28OIE%29+notifiable+viral+diseases+of+ruminants%2C+swine+and+poultry%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Health+Research+Reviews%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification for diagnosis of 18 World Organization for Animal Health (OIE) notifiable viral diseases of ruminants, swine and poultry.</a> Animal Health Research Reviews. 16 (2), 89-106 (2015).</li>
<li>Kumar, Y., Bansal, S., Jaiswal, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+A+rapid+and+sensitive+tool+for+quality+assessment+of+meat+products%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Reviews+in+Food+Science+and+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A rapid and sensitive tool for quality assessment of meat products.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 16 (6), 1359-1378 (2017).</li>
<li>WHO. The use of loop-mediated isothermal amplification (TB-LAMP) for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: policy guidance. , Available from: 
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<li>Kundapur, R. R., Nema, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification%3A+Beyond+microbial+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Cogent+Biology%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification: Beyond microbial identification.</a> Cogent Biology. 2, 1137110(2016).</li>
<li>WHO. Salmonella (non-typhoidal) fact sheet. , Available from: 
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<li>FAO/WHO. Executive summary report of the joint FAO/WHO expert meeting on hazards associated with animal feed. , Available from: 
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<li>FDA. Compliance Policy Guide Sec. 690.800 Salmonella in Food for Animals. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf">https://www.fda.gov/downloads/iceci/compliancemanuals/compliancepolicyguidancemanual/ucm361105.pdf</a> (2013).</li>
<li>Bird, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+3M+molecular+detection+assay+%28MDA%29+2+-+Salmonella+for+the+detection+of+Salmonella+spp.+in+select+foods+and+environmental+surfaces%3A+collaborative+study%2C+first+action+2016.01%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+AOAC+International%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the 3M molecular detection assay (MDA) 2 - Salmonella for the detection of Salmonella spp. in select foods and environmental surfaces: collaborative study, first action 2016.01.</a> Journal of AOAC International. 99 (4), 980-997 (2016).</li>
<li>D'Agostino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+loop-mediated+amplification%2FISO+6579-based+method+for+analysing+soya+meal+for+the+presence+of+Salmonella+enterica%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Validation of a loop-mediated amplification/ISO 6579-based method for analysing soya meal for the presence of Salmonella enterica.</a> Food Analytical Methods. 9 (11), 2979-2985 (2016).</li>
<li>Ge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-laboratory+validation+of+a+loop-mediated+isothermal+amplification+method+for+screening+Salmonella+in+animal+food%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multi-laboratory validation of a loop-mediated isothermal amplification method for screening Salmonella in animal food.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 562(2019).</li>
<li>D'Agostino, M., Diez-Valcarce, M., Robles, S., Losilla-Garcia, B., Cook, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+loop-mediated+isothermal+amplification-based+method+for+analysing+animal+feed+for+the+presence+of+Salmonella%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A loop-mediated isothermal amplification-based method for analysing animal feed for the presence of Salmonella.</a> Food Analytical Methods. 8 (10), 2409-2416 (2015).</li>
<li>Galan, J. E., Ginocchio, C., Costeas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+characterization+of+the+Salmonella+invasion+gene+invA%3A+homology+of+InvA+to+members+of+a+new+protein+family%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional characterization of the Salmonella invasion gene invA: homology of InvA to members of a new protein family.</a> Journal of Bacteriology. 174 (13), 4338-4349 (1992).</li>
<li>Chen, S., Wang, F., Beaulieu, J. C., Stein, R. E., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+viable+salmonellae+in+produce+by+coupling+propidium+monoazide+with+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loop-mediated isothermal amplification.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (12), 4008-4016 (2011).</li>
<li>Yang, Q., Chen, S., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+Salmonella+serovars+in+shell+eggs+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">Detecting Salmonella serovars in shell eggs by loop-mediated isothermal amplification.</a> Journal of Food Protection. 76 (10), 1790-1796 (2013).</li>
<li>Yang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+loop-mediated+isothermal+amplification+for+the+rapid%2C+reliable%2C+and+robust+detection+of+Salmonella+in+produce%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of loop-mediated isothermal amplification for the rapid, reliable, and robust detection of Salmonella in produce.</a> Food Microbiology. 46, 485-493 (2015).</li>
<li>Yang, Q., Domesle, K. J., Wang, F., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+Salmonella+in+food+and+feed+by+coupling+loop-mediated+isothermal+amplification+with+bioluminescent+assay+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of Salmonella in food and feed by coupling loop-mediated isothermal amplification with bioluminescent assay in real-time.</a> BMC Microbiology. 16 (1), 112(2016).</li>
<li>Domesle, K. J., Yang, Q., Hammack, T. S., Ge, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+Salmonella+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+in+animal+food%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Validation of a Salmonella loop-mediated isothermal amplification assay in animal food.</a> International Journal of Food Microbiology. 264, 63-76 (2018).</li>
<li>Andrews, W. H., Jacobson, A., Hammack, T. S. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5: Salmonella. , Available from: 
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</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다. 이 원고에 표현 된 견해는 저자의 견해이며 반드시 보건 복지부, 미국 식품 의약국 또는 미국 정부의 공식 정책을 반영하지 는 않습니다. 식품의약품안전청의 승인, 보증 또는 권고에 따라 상업적 재료, 장비 또는 공정에 대한 언급은 어떠한 방식으로도 구성되지 않습니다.

동물성 음식과 순수한 문화에서 살모넬라를 선별하고 확인하는 간단하고 신속하고 구체적이며 민감한 LAMP 방법을 소개했습니다. 4개의 키 시약이 포함된 이더스말 마스터 믹스의 편리함과 함께, 기성용, 사내 준비된 프라이머 믹스, LAMP 반응을 조립하려면 몇 개의 파이펫팅단계(도 1)만필요하다. 증폭 및 음막 단계를 포함한 총 실행 시간은 38분 미만입니다(그림2A, B 및 도 3A, B). 양수 결과는 실시간 형광(도2C 및 도 3C,D)을통해 모니터링되며 5분26분으로조기에 검출될 수 있다. 멸음 단계는 정확한 Tm(약 90°C)을 가진 샘플만 양성(도2D, E 및 도 3E−G)으로보고되기 때문에 LAMP 특이성의 추가 확인 역할을 한다. 순수한 배양에서 살모넬라 세포 1개 및 동물사료의 CFU/25 g1의 민감성은 이전에26개에보고되었다.
LAMP는 매우 효과적이며 다량의 DNA1을생성하기 때문에, 최고의 실험실 관행은 가로등 마스터 믹스를 준비하고 DNA 템플릿을 추가하기 위한 영역을 물리적으로 분리하고, 에어로졸 생성을 피하고, 필터 파이펫 팁을 사용하고, 장갑을 자주 변경하고, 증폭 후 LAMP 반응 튜브를 열지 않도록 하는 것을 포함하는 교차 오염을 방지하는 데 가장 좋은 실험실 관행을 사용하는 것이 중요합니다.
본 살모넬라 LAMP 방법의 특이성은 이전에 300개의 세균균종(185개의 세로바르의 살모넬라 247개 및 53개의비살모넬라)을사용하여 시험하고 100% 특이적26인것으로 나타났다. 특히, T맥스의 현저한 차이는 두 살모넬라종, S. 엔테리카와 살모넬라 봉고리,그리고 S. 엔테리카 아종, 특히 아취종(IIIa)26종사이에서 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 이들은 여전히 LAMP 결과를 해석하기위한 규칙에 따라 유효한 긍정적 인 결과였다. 14명의분석가19명이참여한 건식 개 사료에 대한 다연구소 협력 연구에서 중복 램프 런에서 일관되지 않은 결과를 갖는 샘플이 때때로 관찰되었습니다. 이들은 일반적으로 지연된 양성 결과를 가진 견본을 관련시켰습니다(Tmax > 15 분). 두 실행 모두 독립적으로 반복하여 일반적으로 문제를 해결했습니다. 더 드물게 정확한Tm을 가진 샘플을 관찰했지만 불규칙한 T최대 값(&lt; 5분)이 없습니다. 이것은 일반적으로 반응 관에 있는 기포에 기인했습니다.
LAMP 방법의 수명주기 전반에 걸쳐 다양한 동물성 식품 또는 식품 매트릭스 및 배양 매체4,19,22,23,24에서램프의 억제제에 대한 높은 관용을 관찰하여, 방법의 견고성을 강조하고 글로벌 스케일8에대한 수많은 다른 연구를 협력하였다. 이는 일반적으로 부정적인 결과가 매트릭스억제(28)로인한 것이 아님을 보장하기 위해 내부 증폭 제어가 필요한 PCR 또는 실시간 PCR에 비해 우수하다. 또한, LAMP는 대부분의 연구에서 PCR 또는 실시간 PCR에 비해 유사한(또는 우수한) 특이성 및민감도를 입증하였다 8. LAMP 시약의 비용은 반응 당 약 $1입니다. 이 프로토콜에 사용되는 LAMP 계측기는 작고 유지 보수가 적으며 휴대용입니다. 그들은 형광 측정, LAMP 포함에 의해 표적 검출을 사용하는 모든 이체 증폭 방법을 처리 할 수 있습니다. LAMP 소프트웨어를 사용하면 포괄적인 보고서를 여러 형식(pdf, 텍스트 및 이미지)으로 생성할 수 있습니다.
메서드 유효성 검사는 일상적인 사용을 위해 새 메서드를 채택하기 전에 중요한 단계입니다. 여기에 보고된 LAMP 프로토콜이 다중 실험실 유효성검사(19)를성공적으로 완료했다는 점은 주목할 만하다. 최근 미국 FDA의 BAM 챕터 5 살모넬라27에이 LAMP 프로토콜이 통합됨에 따라 동물사료의 신속한 선별 방법과 모든 식품 범주에서 분리된 추정 살모넬라 분리를 위한 신뢰할 수 있는 확인 방법으로 훨씬 더 폭넓게 사용될 것으로 기대된다.

루프 매개 이더스말 증폭(LAMP)은 일본 과학자1의그룹에 의해 2000년에 발명된 새로운 이더실 핵산 증폭 시험(iNAAT)이다. 초기 단계에서 표적 특이적 줄기 루프 DNA 구조의 형성을 통해 LAMP는 가닥 변위 DNA 폴리머라아제를 사용하여 이 시작 물질준기하수수체를 효율적으로 증폭시켜 1h1미만의 표적109카피를 생성한다. 널리 사용되는 NAAT인 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 비교하여 LAMP는 몇 가지 장점을 가지고 있습니다. 첫째, 램프 반응은 이소성 조건하에서 수행됩니다. 이것은 정교한 열 사이클링 장비의 필요성을 없애. 둘째, LAMP는 임상 및 식품 응용 분야3,4모두에 대해 입증된 견고성을 갖춘 배양 매체 및 생물학적 물질2에 매우관대하다. 이렇게 하면 샘플 준비를 단순화하고 잘못된 음수 결과5를최소화합니다. 셋째, LAMP는 탁도, 색도, 생물발광, 형광, 및미세유체6와같은 다중 검출 플랫폼에 순종한다. 넷째, LAMP는 특별히 설계된 프라이머 4~6개에 사용하여 6~8개의 특정 영역1,7을대상으로 하기 때문에 매우 특이적이다. 다섯째, LAMP는 매우 민감하며 수많은 연구에서 PCR 또는 실시간 PCR8에대한 우수한 민감성을 보고했습니다. 마지막으로, LAMP는 PCR 형 분석이 일반적으로 1-2 h8을취하는 동안 30 분 표준 런타임을 채택하는 많은 분석으로 빠릅니다.
이러한 매력적인 특징은 체외 진단9,동물질환 진단10,식품 및 환경 검사11을포함한 광범위한 병원체 검출 영역에서 LAMP의 적용을 촉진시켰다. 특히, 결핵결핵을 위한결핵(LAMP)은 WHO가 말초 설정에서 폐결핵 진단을 위한 가래-얼룩 현미경검사에 대한 유효한 대체 시험으로서 추천되었다(12) LAMP 응용 프로그램은 또한 알러지 유발 물질, 동물 종, 약물 내성, 유전자 변형 유기체 및 살충제13의검출을 포함하도록 미생물 식별을 넘어 확장됩니다.
nontyphoidal 살모넬라는 전 세계적으로14의실질적인 식품 안전 및 공중 보건 문제의 동물성 병원체입니다. 또한 동물(즉, 동물성 식품)15,16을위한 식품의 중요한 미생물 위험으로 확인되었다. 살모넬라 병/발병이 오염된 인간 음식과 동물 사료로부터 발생하지 않도록 하기 위해 다양한 행렬에서 살모넬라를 테스트하기 위한 신속하고 신뢰할 수 있으며 강력한 방법을 갖는 것이 필수적입니다. 지난 10 년 동안, 최근 광범위한 검토8에요약된 바와 같이, 다양한 식품 행렬에서 살모넬라 LAMP 에세이의 개발 및 적용에 국제적으로 상당한 노력이 이루어졌습니다. 여기에 제시된 것을 포함하여 몇몇 살모넬라 LAMP 소는,잘 확립된 국제 지침17,18,19,20에따라 다중 실험실 검증을 성공적으로 완료했습니다.
당사의 살모넬라 램프 분석은 특별히 살모넬라 침공 유전자 invA(GenBank 가입 번호 M90846)21을 대상으로 하며, 여러 식품 행렬4,22,23,24,25,26에서빠르고 신뢰할 수 있고 견고하다. 이 방법은 사전 협업 연구26및 다연구소 협력 연구에서 건식 개사료(19)에서6개의 동물사료 행렬에서 검증되었다. 그 결과, 여기에 제시된 살모넬라 램프 방법은 최근 미국 식품의약국(FDA)의 세균성 분석 매뉴얼(BAM) 제5장 살모넬라(27)에 통합되어 동물식품에 살모넬라의 존재에 대한 신속한 검진 방법으로, 2개는 모든 식품에서 분리된 살모넬라를 위한 신뢰할 수 있는 확인 방법으로 사용된다.

<table><tbody><tr><td>뇌 심장 주입 (BHI) 국물</td><td>BD 진단 시스템, Sparks, MD</td><td>299070</td><td>살모넬라 균 재배에 사용되는 액체 성장 배지.</td></tr><tr><td>완충 펩톤 물(BPW)</td><td>BD 진단 시스템, Sparks, MD</td><td>218105</td><td>동물 식품 샘플에서 살모넬라균을 회수하기 위한 사전 농축 배지.</td></tr><tr><td>DNA AWAY</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>7010</td>은 <td>후속 DNA 시료에 영향을 주지 않고 실험실 벤치, 유리 제품 및 플라스틱 제품에서 원치 않는 DNA 및 DNase를 제거합니다.</td></tr><tr><td>Genie Explorer 소프트웨어</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td><td>버전 2.0.6.3</td><td>LAMP 실행 및 데이터 분석을 포함한 Genie 기기의 원격 작동을 지원합니다.</td></tr><tr><td>Genie II 또는 Genie III (LAMP 기기)</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td><td>GEN2-02 또는 GEN3-02</td><td>최대 100°C까지 온도를 제어할 수 있는 소형 기기; C를 &plusmn으로; 0.1 > C 정확도 및 FAM 채널을 통한 동시 형광 검출. Genie II에는 각 블록에 8개의 샘플이 있는 2개의 블록(A 및 B)이 있습니다. Genie III에는 8개의 샘플을 수용할 수 있는 단일 블록이 있습니다.</td></tr><tr><td>지니 스트립</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, 영국</td><td>OP-0008</td><td>일체형 잠금 캡과 10-150μm의 작업 볼륨이 있는 8웰 마이크로튜브 스트립.</td></tr><tr><td>지니 스트립 홀더</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td><td>GBLOCK</td><td>LAMP 반응을 설정할 때 Genie 스트립을 고정하는 데 사용되는 알루미늄 홀더는 냉각 블록으로도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>염산(HCl) 용액, 1 N</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SA48-500</td><td>BPW를 첨가한 후 하룻밤 동안 농축하기 전에 동물 사료 샘플의 pH를 조정합니다.</td></tr><tr><td>열 블록</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>88-860-022</td><td>DNA 추출을 위해 100 & 1 oC에서 샘플을 가열합니다.</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>3960</td><td>표준 실험실 인큐베이터.</td></tr><tr><td>ISO-001 등온 마스터 믹스</td><td>OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom</td><td>ISO-001</td><td>Geobacillus spp.의 가닥 치환 GspSSD DNA 중합효소 대형 단편, 내열성 무기 피로포스파타아제, 반응 완충액, MgSO4, dNTP 및 이중 가닥 DNA 결합 염료(FAM 검출 채널)를 포함하는 LAMP 반응의 조립을 단순화하기 위해 최적화된 마스터 믹스입니다.</td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>A416</td><td>작업 표면을 소독합니다.</td></tr><tr><td>LAMP 프라이머</td><td>Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA</td><td>표</td><td>1에 대한 자세한 정보가 포함된 맞춤형 LAMP 프라이머.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf North America, Hauppauge, NY</td><td>22620207</td><td>MiniSpin plus 개인용 마이크로 원심분리기.</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>05-408-129</td><td>표준 마이크로 원심분리기 튜브.</td></tr><tr><td>분자 등급 물</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>AM9938</td><td>프라이머 스톡, 프라이머 믹스 및 LAMP 반응 믹스 제조에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>수산화나트륨(NaOH) 용액, 1 N</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>SS266-1</td><td>BPW를 첨가한 후 하룻밤 동안 농축하기 전에 동물 사료 샘플의 pH를 조정합니다.</td></tr><tr><td>비선택적 한천(예: 혈액 한천, 영양 한천 및 트립티아제 대두 한천)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>R01202</td><td>살모넬라균 재배에 사용되는 고체 성장 배지.</td></tr><tr><td>펩톤수</td><td>BD 진단 시스템, Sparks, MD</td><td>218071</td><td>하룻밤 사이에 살모넬라 배양을 희석하여 양성 대조군 DNA를 만듭니다.</td></tr><tr><td>피펫 및 팁</td>: <td>Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland, CA</td>, <td>Pipet Lite LTS 시리즈</td><td>, 표준 실험실용 피펫 및 팁.</td></tr><tr><td>PrepMan Ultra 시료 전처리 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>4318930</td><td>LAMP 반응에 사용하기 위한 DNA 템플릿의 신속한 준비에 사용되는 간단한 키트입니다.</td></tr><tr><td>살모넬라 참조 균주 LT2</td><td>ATCC, Manassas, VA</td><td>700720</td><td>양성 대조군으로 사용되는 살모넬라 참조 균주.</td></tr><tr><td>Trypticase soy broth (TSB)</td> <td>BD 진단 시스템, 스파크, MD</td><td>211768</td><td>살모넬라 균 재배에 사용되는 액체 성장 배지.</td></tr><tr><td>와류 믹서</td><td>Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY</td><td>SI-0236</td><td>표준 실험실 와류 믹서.</td></tr><tr><td>Whirl-pak 필터 백</td><td>Nasco 샘플링 브랜드, Fort Atkinson, WI</td><td>B01318</td><td>사전 농축을 위해 동물 식품 샘플을 보관하는 필터 백.</td></tr></tbody></table>

동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 살모넬라를 확인하기 위한 루프 중재 이더말 증폭

Loop-Mediated Isothermal Amplification for Screening Salmonella in Animal Food and Confirming Salmonella from Culture Isolation

루프 매개 이더스말 증폭(LAMP)은 수많은 세균성, 곰팡이, 기생및 바이러스 성 제제의 신속한 검출을 위한 강력한 핵산 증폭 시험으로 부상하고 있다. 살모넬라는 동물을 위한 음식을 포함하여 세계적인 음식 안전 관심사의 세균성 병원체입니다. 여기에 제시된 다중 실험실 검증 살모넬라 LAMP 프로토콜은 살모넬라 오염의 존재를 위해 동물 사료를 신속하게 선별하는 데 사용될 수 있으며 모든 식품 범주에서 회수된 추정 살모넬라 분리를 확인하는 데 사용할 수 있습니다. LAMP 분석은 특히 살모넬라 침략유전자(invA)를대상으로 하며 신속하고 민감하며 매우 특이적입니다. 템플릿 DNA는 동물 사료의 농축 국물 또는 추정 살모넬라 분리의 순수한 문화에서 제조됩니다. LAMP 시약 혼합물은 이더스 말 마스터 믹스, 프라이머, DNA 템플릿 및 물을 결합하여 제조됩니다. LAMP 분석은 30 분 동안 65 °C의 일정한 온도에서 실행됩니다. 긍정적인 결과는 실시간 형광을 통해 감시되고 5 분 일찍 검출될 수 있습니다. LAMP 분석법은 동물성 식품 또는 배양 배지의 억제제에 대한 높은 내성을 나타내며, 살모넬라를선별하고 확인하기 위한 신속하고 신뢰할 수 있고 견고하며 비용 효율적이며 사용자 친화적인 방법으로 사용된다. LAMP 방법은 최근 미국 식품의약국의 세균분석 매뉴얼(BAM) 제5장에 통합되었습니다.

그림 2 및 그림 3은 두 플랫폼에 표시된 대표 램프 그래프/테이블을 표시합니다. 이 LAMP 실행에서, 샘플 S1 에서 S6은 반응당 1.1 x 106 CFU에서 11 CFU에 이르기까지 S. enterica 세로바 인판티스 ATCC 51741의 10 배 직렬 희석이다. 양성 대조군은 반응당 1.7 x 104 CFU에서 S. 엔테리카 세로바 티피무륨 ATCC 19585(LT2)이며 NTC는 분자등급 수이다.
도 2E 및 도 3G에도시된 바와 같이 NTC 및 PC 웰은 모두 유효한 컨트롤입니다. NTC 우물은 빈 T맥스를 가지고 있으며,Tm은 LAMP 계기판에 83°C이고 LAMP 소프트웨어의 공백은 부정적인 결과를 시사합니다. PC우물은 두 플랫폼에서 7분 45초, Tm의 Tm을 모두 플랫폼에 90°C로 가지고 있어 긍정적인 결과를 시사한다. 샘플 S1 에서 S6까지의 T최대값은 6분 30초에서 12분 15초 사이이며, 모두 살모넬라양성입니다.
동일한 샘플 집합의 중복 된 실행에 따라 이러한 샘플에 대해 최종 LAMP 결과가 보고됩니다. 이 대표적인 LAMP 실행은 LAMP가 샘플에서 광범위한 농도로 살모넬라를 성공적으로 감지한다는 것을 보여줍니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2.jpg"> 그림 2: LAMP 계기판에 표시된 대표적인 램프 결과. (A) 프로파일 탭에는 프로그래밍된 온도 프로파일이 표시됩니다. (B) 온도 탭은 램프 반응이 진행됨에 따라 샘플 우물의 실제 온도를 나타낸다. (C) 증폭 탭은 램프 증폭 시 형광 측정값을 나타낸다. (D) 멸막 탭은 멸음 단계 동안 형광(유도체)의 변화를 나타낸다. (E) 결과 탭에는 LAMP 결과의 표 모양이 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2.jpg"> 그림 3: LAMP 소프트웨어에서 볼 수 있는 대표적인 램프 결과. (A) 프로파일 탭에는 프로그래밍된 온도 프로파일이 표시됩니다. (B) 온도 탭은 램프 반응이 진행됨에 따라 샘플 우물의 실제 온도를 나타낸다. (C) 증폭 탭은 램프 증폭 시 형광 측정값을 나타낸다. (D) 증폭 속도 탭은 램프 증폭 시 형광(형광비)의 변화를 나타낸다. (E) 담낭 탭은 막음 단계 동안 형광 측정값을 나타낸다. (F) 절전막 유도체 탭은 막음 단계 동안 형광(유도체)의 변화를 나타낸다. (G) 결과 탭에는 LAMP 결과의 표 모양뷰가 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61239/61239fig3v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

루프 매개 이소성 증폭(LAMP)은 병원체 검출 분야에 대한 폭넓은 관심을 받고 있는 이더스말 핵산 증폭 시험(iNAAT)이다. 여기서, 우리는 동물성 식품에서 살모넬라를 선별하고 문화 격리에서 추정 살모넬라를 확인하는 신속하고 신뢰할 수 있고 강력한 방법으로 다연구소 검증 살모넬라 LAMP 프로토콜을 제시합니다.

Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) has emerged as a powerful nucleic acid amplification test for the rapid detection of numerous bacterial, ...

이 Salmonella LAMP 방법은 FDA의 세균 분석 매뉴얼에 동물 식품의 스크리닝 방법 및 추정 Salmonella 분리물에 대한 확인 방법으로 통합되었습니다. 이 방법은 빠르고 안정적이며 강력합니다. PCR과 비교하여 주요 장점으로는 신속한 테스트, 간단한 기기, 낮은 위음성률 및 유연한 작업 흐름이 있습니다.살모넬라균과 같은 병원체에 대한 신속한 스크리닝은 오염 가능성이 있는 제품을 신속하게 검출하는 데 중요한 역할을 하며 인간과 동물의 질병이나 발병을 예방할 수 있습니다. LAMP 분석을 위한 DNA 템플릿을 준비하는 것으로 시작합니다. DNA 템플릿을 만드는 데 사용되는 샘플에는 두 가지 유형이 있습니다.동물성 식품 샘플에서 템플릿을 준비하려면 25g의 식품 샘플을 무균 중량으로 멸균 필터 백에 넣습니다. 225ml의 멸균 완충 펩톤 물을 백에 넣고 섭씨 35도에서 24시간 동안 배양합니다. 배양 후 백의 여과된 면에서 1ml를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.튜브를 900배 G로 1분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 새 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 16, 000 시간 G에 2 분 동안 표본을 원심 분리하십시오.그리고 상등액을 버리기 위해, 시료 준비 시약 100 마이크로 리터에 펠릿을 재현탁시키고 건조 열 블록에서 섭씨 100도에서 10 분 동안 가열한다. 그런 다음 샘플을 실온으로 냉각하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 이 LAMP 분석을 위한 두 번째 유형의 샘플은 추정 살모넬라 배양물에서 직접 가져옵니다.DNA 템플릿을 준비하려면 하룻밤 동안 배양한 살모넬라균 500마이크로리터를 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 섭씨 100도의 열 블록에서 10분 동안 가열합니다. 그런 다음 샘플을 실온으로 냉각하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 교차 오염을 방지하기 위해 LAMP Master Mix를 준비하고 DNA 템플릿을 추가하는 데 사용되는 영역을 물리적으로 분리하십시오.이소프로판올과 DNA 및 DNA의 분해 용액으로 작업 표면을 청소합니다. 그런 다음 피펫과 튜브 스트립 홀더를 청소합니다. 등온 마스터 믹스, 10X 프라이머 믹스, 분자 등급 물, 양성 대조군 DNA 및 DNA 템플릿을 실온에서 해동합니다.LAMP 기기를 켜고 관련 s를 입력하십시오.amp르 정보. 원고의 지시에 따라 LAMP Master Mix를 준비하고, 간단히 와류 및 원심분리를 한 다음, 23마이크로리터의 Master Mix를 튜브 스트립의 각 웰에 분배합니다. 모든 DNA 템플릿을 소용돌이치고 간단히 원심분리합니다.그런 다음 2마이크로리터의 DNA 템플릿을 적절한 웰에 추가하고 웰을 단단히 캡을 씌웁니다. 홀더에서 튜브 스트립을 제거하고 모든 시약이 튜브 바닥에 고였는지 확인하기 위해 두드립니다. 튜브 스트립을 LAMP 기기에 로드하고 LAMP 실행을 시작합니다.LAMP 반응이 진행되는 동안 Temperature, Amplification, and Anneal 탭을 눌러 LAMP 실행 중 다양한 매개변수의 동적 변화를 확인합니다. LAMP 결과는 LAMP 계기판에서 실시간으로 또는 LAMP 소프트웨어를 사용하여 볼 수 있습니다. 계기판에서 결과를 해석하려면 관심 있는 LAMP 실행.각 실행과 연결된 5개의 탭을 관찰합니다. Profile 및 Temperature 탭에는 LAMP 반응이 진행됨에 따라 샘플 웰의 프로그래밍된 온도와 실제 온도가 표시됩니다. Amplification 및 Anneal 탭은 각각 Amplification 및 Anneal 단계 동안의 형광 판독값과 형광 변화를 보여줍니다.Results 탭에는 원고의 방향에 따라 해석할 수 있는 LAMP 결과의 표 보기가 표시됩니다. LAMP 결과를 보는 두 번째 방법은 LAMP 소프트웨어를 사용하는 것입니다. 소프트웨어로 결과를 해석하려면 왼쪽 패널에서 컴퓨터 아이콘을 클릭하고 파일 위치로 이동하여 관심 있는 LAMP 실행을 로드합니다.각 실행과 연결된 7개의 탭을 관찰합니다. Profile 및 Temperature 탭에는 LAMP 반응이 진행됨에 따라 샘플 웰의 프로그래밍된 온도와 실제 온도가 표시됩니다. Amplification 및 Amplification Rate 탭은 증폭 단계 동안의 형광 판독값과 형광 변화를 보여줍니다.Anneal 및 Anneal Derivative 탭은 Anneal 단계 동안 형광 판독값과 형광 변화를 보여줍니다. 결과 탭에는 LAMP 결과의 테이블 형식 보기가 표시됩니다. 그래프 이름(Graph Name), 웰 번호(Well Number), 웰 이름(Well Name) 및 피크 값(Peak Value)이라는 제목의 4개의 열이 있습니다.8개 샘플 모두의 Amp Time 및 Anneal Derivatives가 표시됩니다. 결과는 원고의 지시에 따라 해석될 수 있습니다. LAMP 계기판과 LAMP 소프트웨어를 사용하여 분석 결과를 표시할 수 있습니다.이 LAMP 실행에서 샘플 S1에서 S6은 Salmonella enterica serovar Infantis ATCC 51741의 10배 연속 희석액으로, 반응당 110만 개에서 11개의 집락 형성 단위에 이릅니다. 양성 대조군 또는 PC는 반응당 17, 000 집락 형성 단위의 Salmonella enterica Serovar Typhimurium LT2이며, 무 템플릿 대조군 또는 NTC는 분자 등급의 물입니다. NTC 웰은 LAMP 계기판에서 약 81°C의 빈 Tmax와 Aneal 온도를 가지며 LAMP 소프트웨어에서 blank Tmax와 빈 어닐링 온도를 갖습니다.포지티브 컨트롤 웰은 두 플랫폼 모두에서 Tmax가 7분 45초이고 어닐링 온도가 약 섭씨 90도입니다. 샘플 S1 내지 S6은 Tmax가 6분 및 30초 및 12분 및 15초 사이이고 어닐링 온도가 약 섭씨 90도이며 모두 양성 검출을 나타냅니다. LAMP는 매우 효과적이며 많은 양의 DNA를 생성합니다.따라서 교차 오염을 방지하기 위해 최상의 실험실 관행을 사용하는 것이 중요합니다. 오염된 동물성 식품을 농축하면 살모넬라균 수치가 높아질 수 있으므로 DNA 템플릿을 만들 때도 유사한 방법을 사용하십시오. LAMP로 검사한 동물 사료 검체 검사에서 양성 반응을 보인 경우 FDA의 세균 분석 매뉴얼(Bacteriological Analytical Manual)의 절차에 따라 배양 분리를 통해 확인해야 합니다.음성 샘플은 이와 같이 보고될 수 있습니다. 이 LAMP 분석법이 FDA의 세균 분석 매뉴얼에 통합됨에 따라 식품 안전 검사에서 이 빠르고 강력하며 사용자 친화적인 기술을 광범위하게 적용할 수 있게 되었습니다.

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연구

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생물학

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확인을 위해 Allelotyping PCR 살모넬라 enterica serovars Enteritidis, 해더, 하이 델베르크, 그리고 Typhimurium

출처: 돔슬, K. J. 외. 동물성 식품 내 살모넬라 선별과 배양 분리 확인을 위한 루프 매개 등온 증폭.  J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 일정한 온도에서 DNA를 증폭하여 목표 박테리아 유전자를 검출하는 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 기법을 시연합니다. 반응 혼합물은 등온 마스터 믹스, 표적 유전자에 대한 특정 프라이머, DNA 주형이 포함된 샘플을 첨가하여 준비됩니다. 증폭은 LAMP 기기에서 시작되며, 실시간 형광 모니터링을 통해 표적 유전자의 존재를 확인합니다.

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