카노르하비티스 예르간에서 단백질 추출물 제제 및 공동 면역 침전

이 프로토콜은 성공적인 단백질 풀다운(pull-down)을 확인하고 관심 있는 공동 면역침전된 단백질을 검출하기 위해 샘플 채취, 추출물 준비 및 면역침전을 위한 단계별 절차를 제공합니다. 단백질 추출물 준비는 최대 24개의 샘플에 대해 수행할 수 있으며 면역침전 및 RNA 풀다운 실험을 포함한 여러 다운스트림 응용 분야와 호환됩니다. 이 방법은 다양한 유전적 배경에서 두 개 이상의 내인성, 내인성으로 표지되거나 과발현된 예쁜꼬마선충 단백질 간의 상호 작용 테스트를 용이하게 하기 위해 조정할 수 있습니다.

이 프로토콜의 시각적 시연은 연구자들이 단백질 추출물 준비 및 면역침전에 익숙해지도록 하기 위한 것이며, 이 기술을 처음 접하는 사람들이 연구에 이를 사용하도록 장려할 수 있기를 바랍니다. 지렁이 샘플을 수집하려면 필요한 온도에서 고체 선충 성장 배지 플레이트에서 첫 번째 종자 혼합 단계 또는 동기화된 기생충을 만들고 기생충이 원하는 단계까지 성장할 수 있도록 합니다. 배양이 끝나면 M9 버퍼를 사용하여 웜을 15ml 원뿔형 튜브로 세척하고 원심분리로 웜을 펠릿화합니다.

원심분리가 끝나면 상층액을 제거하고 세척당 신선한 M9 완충액으로 웜을 추가로 3-5회 세척합니다. 상층액이 더 이상 흐리지 않으면 이중 증류수로 최종 세척을 한 번 수행하고 느슨한 벌레 펠릿을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 추가 원심분리로 벌레를 펠릿화하고 남은 상등액을 버리면 포장된 벌레 펠릿을 얻을 수 있습니다.

수집된 웜 펠릿에서 추출물을 준비하려면 권장되는 300마이크로리터 부피의 펠릿에 동일한 부피의 얼음처럼 차가운 2X 용해 완충액을 추가하고 생성된 현탁액을 격렬하게 혼합합니다. 샘플을 스핀다운하여 튜브 바닥에서 혼합물을 수집하고 튜브 내용물을 금속 비드가 들어 있는 1.5ml RNAse-free 튜브로 옮깁니다. 튜브를 단단히 캡을 씌운 후 샘플을 섭씨 4도의 비드 밀 균질기에 넣고 샘플이 균질화기 내부에서 균형을 이루도록 주의하십시오.

비드가 없는 새로운 1.5ml 마이크로 원심분리 튜브로 샘플을 옮기기 전에 4분 동안 최고 속도로 샘플을 균질화합니다. 단백질 추출물을 정화하기 위해 샘플을 스핀다운하고 샘플 상단의 흰색 탁한 침전물을 옮기지 않고 상층액을 얼음 위의 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 표준 프로토콜에 따라 총 단백질 농도를 측정하기 위해 정제된 추출물 10마이크로리터를 따로 보관하고 즉시 샘플을 얼음 위의 차가운 1X 용해 완충액 1밀리리터당 5 또는 10밀리그램의 단백질로 희석합니다.

관심 단백질의 면역침전을 위해 먼저 반전을 통해 마그네틱 비드를 재현탁하고 150X 비드 현탁액 150마이크로리터를 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 얼음 위의 구슬을 마그네틱 스탠드에 약 1분 동안 자화합니다. 용액이 투명해지면 상등액을 버리십시오.

마그네틱 스탠드에서 튜브를 제거하고 300마이크로리터 용량의 1X 용해 완충액 3개로 비드를 세척합니다. 마지막 세척 후 150마이크로리터의 얼음 저온 용해 완충액에 비드를 재현탁시키고 75마이크로리터의 비드 슬러리를 단백질 추출물 샘플 2mg으로 옮깁니다. 섭씨 4도에서 1시간 동안 부드럽게 저어 배양한 후 샘플 튜브를 얼음 위의 자석에 약 1분 동안 놓습니다.

비드가 완전히 자화되고 샘플이 투명해지면 비드를 방해하지 않고 상등액을 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 샘플의 10%를 따로 보관하고 사전 세척된 용해물에 친화성 정제 항체 20마이크로그램을 첨가하여 섭씨 4도에서 부드러운 교반으로 1시간 배양합니다. 배양이 끝나면 남은 75마이크로리터의 사전 세척된 비드 현탁액을 항체 용해물 혼합물에 첨가하여 섭씨 4도에서 부드러운 교반으로 1시간 더 배양합니다.

배양이 끝나면 샘플을 약 1분 동안 자석에 다시 놓습니다. 비드가 완전히 자화되고 샘플이 투명해지면 면역침전물이 포함된 비드를 얼음 위의 450마이크로리터 세척 버퍼에서 세 번 세척합니다. 마지막 세척 후 비드 펠릿을 20마이크로리터의 2X SDS 베타-메르캅토에탄올 단백질 겔 로딩 버퍼에 재현탁하고 샘플을 섭씨 95도에서 5분 동안 끓입니다.

웨스턴 블롯 분석을 통한 면역침전된 단백질을 검출하려면 비드를 옮기지 않고 변성된 단백질 샘플을 SDS-PAGE 겔에 로드하고 관심 단백질에 적합한 항체를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 웨스턴 블롯 분석을 수행한 다음 양고추냉이 과산화효소 기반 화학발광을 사용하여 밴드를 검출합니다. 입증된 bead mill homogenizer 프로토콜은 총 단백질 추출에서 핵 및 세포질 단백질의 효율적인 추출을 위한 dounce 기반 방법과 유사합니다. 이 분석에서 Argonaute 단백질은 표적 메신저 RNA에 결합하고 발현을 억제하는 microRNA 유도 침묵 복합체를 형성하는 GW182 단백질 계열의 구성원과 상호 작용하는 것으로 확인되었습니다.

입증된 추출물 및 면역침전 프로토콜은 ALG-1 및 HRPK-1 특이적 공동 면역침전물을 성공적으로 회수하는 데에도 사용할 수 있습니다. 또한 다양한 유전적 배경에서 ALG-1:AIN-1 상호 작용을 테스트한 결과 HRPK-1은 ALG-1:AIN-1 microRNA 유도 침묵 복합 어셈블리에 필요하지 않음이 밝혀졌습니다. 단백질 추출 및 면역 침전은 샘플의 안정성을 유지하기 위해 섭씨 4도 또는 얼음 위에서 수행되는지 확인하는 것이 중요합니다.

이 total protein extract 준비는 microRNA 상보 올리고뉴클레오티드를 사용하는 단백질 면역침전 및 microRNA 풀다운 실험과 호환되며 단백질 및 RNA 구성 요소의 다운스트림 수집을 용이하게 합니다.