생체 내 심근 수리를 위한 인간 iPS 세포에서 파생된 메쉬 모양의 조작된 심장 조직의 준비
2020년 6월 9일
본 프로토콜은 인간 유도만능 줄기 세포에서 유래한 심혈관 세포를 포함하는 메쉬 모양의 엔지니어링 된 심장 조직을 생성하여 심장 질환에 대한 세포 이식 요법의 조사를 허용합니다.
이 프로토콜은 인간 유도 된 신체 부위및 STEM 세포 유래 심장 세포에서 파생 된 메쉬 모양의 엔지니어링 심장 조직을 만드는 고귀하고 쉬운 방법을 설명합니다. 조직 기하학의 유연성과 보존 된 조직 기능의 확장성은이 기술의 주요 장점입니다. 이식된 메쉬 형상 ECT는 쥐 심근 경색 모델에서 심장 구조와 기능을 복원할 수 있습니다.
심장 재생 치료에 사용하기위한 타당성을 확인. 이러한 기술은 일관된 결과를 위해 재현 가능한 인간 STEM 세포 처리 및 조직 배양 기술을 요구합니다. 경화 PDMS 시트를 적절한 크기로 절단하여 시트를 실리콘 접착제로 결합하여 21 by 20.5mm 직사각형 트레이를 7밀리미터 너비의 20.5mm 직사각형 트레이와 비틀거리는 위치에서 2.5밀리미터 높이의 직사각형 기둥을 제작할 수 있도록 합니다.
두 줄의 게시물 사이의 수평 간격은 2.5 밀리미터여야 합니다. 1시간 동안 PBS에서 1%폴로사머 407로 금형을 코팅하기 전에 20분 동안 트레이를 섭씨 120도에서 자동 클럭입니다. 그런 다음 PBS로 금형을 철저히 헹구고 금형을 6웰 플레이트의 한 웰에 넣습니다.
계보 분석을 위해 심근세포와 내피 및 혈관 벽화 세포 프로토콜의 세포를 결합합니다. 벽화 세포의 최종 농도가 10~20%로 총 세포수에서 6배 10~6개의 세포가 구성될 수 있도록 한다. 133 마이크로리터의 산 수용성 쥐 꼬리 콜라겐 타입 1용액과 알칼리 버퍼 17마이크로리터를 얼음 위에 10배 최소 필수 매체17마이크로리터에 혼합합니다.
그런 다음 콜라겐 용액에 지하 멤브레인 매트릭스 67 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로, 세포를 원심분리하고 태아 소 혈청과 항생제로 보충된 고혈당 덜벡코의 최소 필수 매체의 167마이크로리터에서 펠릿을 재중단합니다. 매트릭스 용액의 셀을 얼음에 섞습니다.
그런 다음 400 마이크로리터의 셀 매트릭스 서스펜션을 폴로사머 407 코팅 PDMS 조직 금형에 조심스럽게 부어 줍니다. 표준 세포 배양 인큐베이터에서 세포 매트릭스 혼합물을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%를 60분 동안 배양한다. 조직이 형성되면, ECT 배양 배지의 4 밀리리터로 금형을 조심스럽게 흡수하고 14 일 동안 세포 배양 배양 배양소로 플레이트를 반환합니다.
ECT 이식 전에 미세 포셉을 살균하여 로딩 게시물에서 ECT를 조심스럽게 제거합니다. 조직 금형은 다양한 패턴, 포스트 길이 및 포스트 간격으로 제작되어 서로 다른 최종 ECT 형상을 생성할 수 있습니다. 이 분석을 위해 폭 이 2.5mm의 7밀리미터 길이의 금형이 사용되었습니다.
Poloxamer 407은 금형에 대한 세포의 접착을 방지하고 14 일 만에 빠른 겔 다짐에 따라 특성 메쉬 구조의 형성을 가능하게합니다. 구조는 ECT가 금형에서 방출된 후에도 유지됩니다. 제조 된 조직 구조는 약 1.5 센티미터 폭과 0.5 밀리미터 두께입니다.
그리고 메쉬의 각 번들의 폭은 평균 약 0.5 밀리미터입니다. 동일한 비틀거림 포스트 설계를 가진 4배 더 큰 금형으로부터 2,400만 개의 셀을 함유한 3센티미터 최종 폭 메쉬 ECT를 생성할 수 있다. 이 더 큰 메쉬 ECT는 금형에서 쉽게 제거할 수 있으며 더 작은 메시 ECT에 해당하는 로컬 힘 행위를 생성합니다.
최종 겔의 결함감을 방지하기 위해 기포를 생성하지 않고 조직 몰드에 세포 매트릭스 혼합물을 고르게 붓는 것이 중요하다. 계약자의 기능적 특성화. 내장 된 시스템을 사용하여 네 번째 주파수 관계를 수행 할 수 있습니다.
우리의 궁극적인 목표는 대규모 동물 전임상 연구를 활용하는 임상 치료법으로 ECT 패러다임을 번역하는 것입니다.
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개요
본 프로토콜은 인간 유도만능줄기세포 유래의 그물망 형태 공학적 심장 조직을 제작하는 새롭고 간편한 방법을 설명합니다. 이 기술을 통해 심장 질환에 대한 세포 이식 치료, 특히 쥐의 심근경색 모델에서의 치료법을 연구할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 심장 조직 공학
- 줄기세포 치료
- 재생 의학
배경
- 공학적으로 설계된 심장 조직은 심장의 구조와 기능을 회복시킬 수 있습니다.
- 인간 유도만능줄기세포는 심장 세포 분화 및 유도를 위한 가치 있는 자원입니다.
- 효과적인 이식을 위해서는 조직 기하학적 구조의 유연성이 매우 중요합니다.
- 일관된 결과를 얻기 위해서는 줄기세포 처리 과정의 재현성이 필수적입니다.
연구 목적
- 그물망 형태의 공학적 심장 조직을 제작하는 방법을 개발합니다.
- 심장 재생 치료에서 이러한 조직의 적용 가능성을 평가합니다.
- 이식 후 심장 기능의 회복 여부를 조사합니다.
사용된 방법
- PDMS와 실리콘 접착제를 이용한 직사각형 트레이 제작.
- 공학적으로 제작된 조직을 지지하기 위한 포스트 생성.
- 쥐 모델 내에 공학적 심장 조직 이식.
- 심장 구조 및 기능 회복 정도 평가.
주요 결과
- 그물 형태의 공학적 심장 조직이 심장 기능을 성공적으로 회복시켰습니다.
- 해당 방법은 조직 기하학적 구조의 확장성과 유연성을 입증하였습니다.
- 재현 가능한 줄기세포 공정을 통해 일관된 결과가 도출되었습니다.
- 이 기술은 심장 재생 치료에 활용 가능한 수준입니다.
결론
- 본 프로토콜은 공학적으로 설계된 심장 조직을 제작하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 그물망 형태의 조직은 심근경색 모델에서 심장 기능을 효과적으로 회복시킬 수 있습니다.
- 이 접근 방식은 향후 심장 재생 치료의 가능성을 제시합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
본 프로토콜은 인간 iPSC 유래 심혈관 세포로부터 메쉬 형태의 공학적 심장 조직을 확장 가능하게 생산할 수 있게 하여, 심근 재생 전략을 위한 재현 가능한 플랫폼을 제공합니다. 이 접근 방식은 허혈성 손상 모델에서 조직 통합 및 기능 회복에 대한 전임상 평가를 지원함으로써 재생 심장학의 중요한 공백을 메워줍니다. 기하학적 조절이 가능하고 확장이 용이한 구조물을 제공함으로써, 심부전 치료를 위한 줄기세포 기반 요법의 중개 연구 위험을 낮추는 데 기여합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: hiPSC 유래 심장 세포의 생체 내 구조적 및 기능적 통합을 평가함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운영적 가치: 연구 전반에 걸쳐 일관된 전임상 결과 도출을 위해 표준화되고 재현 가능한 조직 형태를 제공합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 기능적 분석법 개발을 위해 정량화 가능한 구조적 지표(예: 근섬유 다발 정렬, 동기화된 수축)를 생성합니다.
- 운용적 가치: 더 큰 구조체(최대 3.0 cm)까지 확장 가능하여 용량-반응 및 배치 일관성 테스트를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 쥐 심근경색 모델에서 심장 구조 및 기능 회복의 가능성을 입증하여, 기전적 리스크 감소를 뒷받침합니다.
- 운영적 가치: 표준화된 이식 및 기능 평가 워크플로우를 통해 발견 단계에서 전임상 검증 단계로의 연결을 제공합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 방법은 망상형 ECT를 발견부터 전임상 단계까지 잇는 가교로 배치하여, 확장 가능하고 재현 가능한 조직 생산을 통해 초기 발견 단계의 가설 검증과 전임상 단계의 기능적 검증을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): hiPSC 유래 심장 세포의 통합 및 전기기계적 기능에 대한 제어된 평가를 가능하게 함으로써 경로 규명과 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 화합물 또는 조건 비교를 위해 정량화 가능한 결과물(박동 동기화, 정렬)을 갖춘 분석 준비 완료된 표준화 조직을 제공합니다.
- 분석(Analytics): 실험군 간의 비교 분석이 가능하도록 구조적 및 기능적 판독 값(구조체 크기, 근섬유 직경, 수축 동기화)을 제공합니다.
- 중개 연구(Translational Research): in vitro 성숙부터 in vivo 기능 복구까지의 연속성을 보장하여, 리스크가 조정된 추진 결정 과정을 지원합니다.
- 기업 내 재사용(Enterprise Reuse): 다양한 기하학적 구조와 규모에 적용 가능한 플랫폼 기술을 구축하여, 프로젝트 간 재현성과 자원 효율성을 증진합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 줄기세포의 생착 및 심장 재생에 대한 기능적 기여 과정에서의 기전적 모호성을 줄여 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 정의된 세포 비율, 매트릭스 조성 및 몰드 기하학적 구조를 통해 표준화와 확장성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 재현 가능한 전임상 효능 데이터를 제공함으로써 go/no-go 결정을 개선하고 후기 단계의 생물학적 리스크를 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: 검증된 조직 성능과 확장성을 바탕으로 심장 재생 후보 물질의 리스크 조정 우선순위 지정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 인간 iPSC 분화, 심혈관 계통 지정 및 3D 조직 배양 기술에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- PDMS 몰딩 장비, 멸균 가능 여부 및 매트릭스-세포 혼합을 위한 정밀 유체 핸들링 접근 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 배치 간 일관성을 보장하기 위해 세포 소싱, 매트릭스 준비 및 배양 프로토콜의 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 더 큰 구조물이나 대체 기하학적 구조로 확장할 때, 특히 영양분 확산 및 전기적 결합과 관련된 적응 고려 사항이 포함됩니다.
- 기능적 검증을 위해 현재 설치류 모델에 의존하고 있다는 점이 한계이며, 임상 적용을 위해 더 큰 규모의 전임상 시스템이 필요합니다.
