Name: 하이드로겔 기반 3D 문화 모델을 자동화및 표준화방식으로 제조하는 오픈 소스 기술 플랫폼 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: 학습하세요 조직공학 연구를 위한 하이드로겔 자동 제조 프로토콜을 개방형 소스 플랫폼을 활용하여 점성 물질 혼합의 재현성을 높이고 인간 오류를 최소화하는 방법을.

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저자는 QUT에서 재생 의학 센터의 구성원을 인정, 특히, 안토니아 호스트와 파벨 Mieszczanek 그들의 유용한 제안및 피드백에 대 한. 이 작품은 QUT의 SE 대학원 연구 상과 보조금 계약 IC160100026 (적재 바이오 제조의 ARC 산업 변환 교육 센터)에 따라 호주 연구 위원회 (ARC)에 의해 지원되었습니다. NB는 국립 건강 및 의학 연구 위원회 (NHMRC) 피터 도허티 초기 경력 연구 펠로우십 (APP1091734)에 의해 지원되었다.

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CM과 DWH는 Gelomics Pty Ltd.의 창립자이자 주주이기도 합니다. 저자는 이 문서의 주제와 관련된 이해 상충을 선언합니다. 저자는 공개된 것과는 별도로 기사에서 논의된 주제 나 자료와 재정적 이해관계 또는 재정적 이해관계가 있는 조직 이나 단체와의 다른 관련 소속이나 재정적 관여가 없습니다.

점성 물질의 파이프팅, 특히 생체 의학 응용 을위한 하이드로겔19,20,21,33,47, 다양한 농도의 사용자 정의 농도 또는 희석 시리즈를 준비하는 많은 연구 실험실에서 일상적인 작업입니다. 반복적이고 실행이 다소 간단하지만 주로 낮은 샘플 처리량18로 수동으로 수행됩니다. 이 자습서에서는 점성 물질을 위해 특별히 설계된 오픈 소스 워크스테이션의 작동을 도입하여 원하는 농도의 재현 가능한 생성을 위해 점성 재료의 자동 혼합을 가능하게 합니다. 이 워크스테이션은 하이드로겔의 파이펫팅에 최적화되어 열반응 재료에 대한 온도 도크의 통합, 점성 재료의 양수 변위 파이펫 및 팁에서 과도한 재료를 제거하는 옵션 팁 터치 도크를 통합하여 자동화되고 신뢰성이 높은 취급을 가능하게 합니다. 파이펫팅 모듈은 표준화되고 자동화된 방식으로 점성 물질의 처리를 가능하게 하기 위해 특별히 최적화되었습니다. 에어 쿠션 파이펫(도 5a)과 비교하여, 양수 변위 파이펫(그림 5b)은 잔류 물질을 팁에 남기지 않고 점성 물질을 분배하여 정확한 흡입 및 분배 부피를 초래합니다. 옵션 팁 터치 도크는 팁(그림 5c,d)에서 과도한 샘플 재료를 제거하며 접착제 재료(예: 4%(w/v) 알기네이트에 유용합니다.
프로토콜 디자이너 응용 프로그램은 하이드로겔을 위해 특별히 프로그래밍되었으며 서로 다른 농도와 최대 2개의 희석제를 가진 최대 4개의 시약을 희석할 수 있습니다. 사용자가 원하는 농도 또는 직렬 희석 단계만 선택하므로 최종 희석 계산에 오류가 발생할 위험이 이 응용 프로그램에서 방지됩니다. 필요한 지망생 및 분배 볼륨은 자동으로 계산되고, 별도의 문서 텍스트 파일에 저장한 다음 프로토콜 스크립트로 채워지게 됩니다. 이 프로토콜 설계 응용 프로그램은 사용자에게 모든 실험 매개 변수(예: 파이펫 팅 속도)를 완전히 제어할 수 있으며 중요한 매개 변수에 대한 내부 문서화를 보장합니다. 프로토콜 설계 앱은 저수지의 충진 수준을 고려하여(예: 음)를 고려하여 점성 재료에 불필요한 침지 방지를 위해 심스피링/디스펜싱 높이를 변화시합니다. 이 통합 기능은 팁의 외부 벽에 재료 축적을 방지하고, 따라서, 프로토콜 전반에 걸쳐 신뢰할 수있는 흡입 및 디스펜싱 작업을 보장합니다. 프로토콜 디자이너 응용 프로그램은 하이드로겔 희석 단계를 위해 개발되었지만 오렌지 G 염료와 같은 비협화분액의 희석에도 사용할 수 있습니다. '/예제/게시-JoVE'에서 리포지토리를 통해 액세스할 수 있는 프로토콜 디자이너 응용 프로그램은 프로토콜 섹션에 설명되어 비디오에서 강조 표시된 버전입니다. 이 버전은 업데이트되지 않습니다. 그러나 프로토콜 디자이너 응용 프로그램의 업데이트된 버전은 기본 리포지토리 페이지를 통해 사용할 수 있습니다. 교정 단말은 처음에 Sanderson48에 의해 개발되었으며 양수 변위 파이펫의 교정에 최적화되었습니다.
프로토콜 섹션 4에 설명된 바와 같이, 파이펫과 컨테이너는 처음에 보정되어야 합니다. 이 교정 프로세스는 이동 증분을 계산하는 데 사용되는 위치를 정의하고 저장하는 데 매우 중요합니다. 따라서 성공적인 프로토콜 실행은 잘못된 교정 지점이 팁이 컨테이너에 충돌할 수 있으므로 잘 정의된 교정 위치에 의존합니다. 파이펫의 플런저 위치를 수동으로 보정해야 하므로 파이펫팅 정확도와 정밀도는 수행된 교정에 크게 의존합니다. 이러한 교정 절차는 파이펫팅 모듈의 사용자 경험에 매우 의존하므로 적절한 교정 절차를 보장하기 위해 숙련 된 직원과의 교육을 처음부터 권장합니다. 파이펫팅 모듈의 수동 교정 외에도 파이펫 자체를 보정하여 정확한 파이펫팅을 보장해야 합니다. ISO 8655에 명시된 대로 수용 기준을 충족하기 위해 적어도 12개월마다 파이펫을 보정하는 것이 좋습니다. 내부적으로 파이펫 교정을 평가하기 위해 Stangegaard et al.16에서 설명한 바와 같이 유효성 검사 및 검증을 사용할 수 있습니다.
신뢰할 수 있는 데이터 집합의 생성을 위해 고품질의 시약으로 시작하는 것이 중요합니다. 이는 일괄 처리 대 일괄 처리 변형이 이 프로토콜 내에서 생성된 결과에 영향을 미칠 수 있기 때문에 하이드로겔 처리 작업에 특히 중요합니다. 일괄 처리 대 배치 변화 외에도 소량 의 준비에 미묘한 변화가 속성 차이에 기여할 수 있습니다. 이를 방지하기 위해 전체 실험에 사용할 수 있는 더 큰 볼륨을 준비하는 것이 좋습니다.
검증 및 검증 절차는 신뢰할 수 있는 혼합물을 식별하기 위해 염료 사용에 의존합니다. 제시된 프로토콜은 Orange G의 적용을 설명하지만 일반 프로토콜 및 분석 워크플로는 형광 dyes49,50에 맞게 조정할 수도 있습니다. Orange G의 사용은 분광계의 기술적 요구 사항을 줄이고 빛에 노출 된 후 형광 염료의 표백을 방지하기 위해 취한 예방 조치를 제거합니다. 염료의 용해 동작 또는 클러스터 형성의 문제점은 실험 중에 제시된 물질로 관찰되지 않았지만 다른 물질과 함께 나타날 수 있다. 잠재적인 클러스터 형성 및, 따라서, 염료와 물질 사이의 상호 작용은 현미경으로 쉽게 검출될 수 있었습니다.
이 자습서에서 제시된 절차와 기술은 점성 재료의 현재 워크플로우에 자동화 기능을 추가하여 최소한의 인력으로 매우 신뢰할 수 있는 작업을 수행합니다. 제공된 문제 해결 테이블(표 2)에는 식별된 문제가 포함되어 있으며 문제를 해결하기 위한 솔루션뿐만 아니라 가능한 이유를 제시합니다. 제시된 워크스테이션은 천연(젤라틴, 겔란 껌, 마트리겔) 및 합성(예를 들어, 폴리(에틸렌 글리콜) [PEG], 플루론 F127, 루트롤 F127) 중합재료에 성공적으로 적용되어 자동화된 파이펫팅 작업을 위한 폴리머 소재이다. 특히, 오픈 소스 워크스테이션과 점성 물질용으로 설계된 오픈 소스 프로토콜 설계 응용 프로그램의 조합은 생물 의학 공학, 재료 과학 및 미생물학 분야에서 일하는 연구자에 매우 유용할 것입니다.

재현성과 복제성은 과학적 작업1,2,3,4에서 가장 중요합니다. 그러나, 최근 기록은 기초 과학에 있는 고충격 생물 의학 연구 뿐만 아니라 번역 연구에 있는 중요한 도전을 강조했습니다4,5,6,7. 불쌍하거나 편향된 연구 설계6,8, 불충분한 통계 적 힘3,9, 보고 표준 준수 누락, 게시 압력 6 또는 사용 불가능한 방법 또는 소프트웨어 code6,9과 같이 돌이킬 수없는 결과에 기여하는 요인은 복잡하고 다양합니다. . 그 중에서도 실험 실행시 프로토콜과 인간의 실수에 대한 미묘한 변화는 불변성을 차지하는 추가 요소로 확인되었습니다4. 예를 들어 수동 파이펫 팅 작업은 개별 내 및 개별 간 부정확성을 도입하고 사람의 오류 14의 확률을 증가시면 됩니다. 상업용 액체 취급 로봇은 이러한 단점을 극복할 수 있으며 액체 15,16,17에 대한 신뢰성을 높일 수 있지만 점성이 중요한 특성을 가진 재료의 자동 취급은 여전히 어렵습니다.
상업용 액체 처리 로봇은 일반적으로 에어 피스톤 또는 공기 변위 파이펫이라고도 하는 공기 쿠션 파이펫을 사용합니다. 시약과 피스톤은 디스펜싱 단계에서 수축하고 경각선 단계에서 확장되는 에어 쿠션으로 구분됩니다. 공기 쿠션 파이펫을 사용하여 점성 재료 '흐름'은 팁 안팎에서 천천히 유입되며, 저수지에서 파이펫을 조기에 철수하면 기포의 포부를 초래할 수 있습니다. 디스펜싱 작업 중에 점성 재료는 공기에 의해 강제 될 때 천천히 또는 전혀 '흐르다'내부 팁 벽에 필름을 둡니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 양성 변위 파이펫은 고체 피스톤을 사용하여 팁에서 점성 물질을 적극적으로 내다추기 위해 상업적으로 도입되었다. 이러한 양수 변위 파이펫은 점성 재료의 정확하고 신뢰할 수 있는 처리를 가능하게 하지만, 양수 변위 파이펫을 갖춘 자동화된 솔루션은 여전히 학술 실험실 설정에 너무 비싸므로 점성 재료가 있는 대부분의 워크플로우는 수동 파이펫팅 작업에만 의존합니다18.
일반적으로 점도는 유체의 흐름 저항으로 정의되며 점도 재료는 물의 점도가 큰 재료로 더욱 정의되고 있다(0.89 mPa·s 25°C). 생물 의학 응용 분야에서, 실험 설정은 종종 물보다 더 큰 점도와 여러 물질을 포함, 디메틸 설프산화물(DMSO; 1.99mPa/s 25°C), 글리세롤(208.1mPa·s 25°C~90% 글리세롤[v/v]), 트리톤 X-100(25°C),수분부폴리머, 하이드로겔, 수성포겔, 수성포겔 등 20. 하이드로겔은 세포 캡슐화, 약물 전달 및 소프트 액추에이터 19,20,21,22를 포함하여 다양한 용도에 사용되는 물리적 또는/화학 적 모드로 배열된 친성 폴리머 네트워크입니다. 하이드로겔의 점도는 폴리머 농도 및 분자량19에 따라 달라집니다. 생체 의학 응용 분야에 일상적으로 사용되는 하이드로겔은 1에서 1000 mPa 사이의 점도 값을 나타내며, 특정 하이드로겔 시스템은 최대 6 x 107 mPa·s19,23,24의 값으로 보고되었습니다. 그러나 하이드로겔의 점도 측정은 측정 프로토콜 및 샘플 준비 측면에서 표준화되지 않으므로 다른 연구 간의 점도 값을 비교하기가 어렵습니다.
하이드로겔용으로 특별히 설계된 상용 자동화 솔루션은 누락되거나 비용이 많이 들기 때문에 하이드로겔의 현재 워크플로우는 수동 취급에 따라 달라집니다18. 하이드로겔의 파이펫팅을 위한 현재 수동 기반 워크플로우의 한계를 이해하려면 필수 처리 작업을 이해하는 것이 중요합니다18. 예를 들어, 새로운 하이드로겔 소재가 합성되면, 다양한 농도를 가진 원하는 농도 또는 희석 계열이 생성되어 신뢰할 수 있는 합성 프로토콜및 기계적 특성의 후속 분석과 교차 연결 특성을 식별합니다25,26,27,28 . 일반적으로, 주식 용액은 제조 또는 구입, 그리고 혼합물을 얻기 위해 희석 및 / 또는 다른 시약과 혼합. 혼합 작업은 대부분 웰 플레이트(또는 임의의 출력 형식)에서 직접 수행되지 않으며 일반적으로 마스터 믹스라고 하는 별도의 반응 튜브에서 수행됩니다. 이러한 준비 작업 동안, 점성 물질을 전송하고, 시약을 혼합하고, 혼합물을 출력 형식으로 전송하기 위해 다양한 심스피링 및 분배 단계가 필요합니다(예를 들어, 96 웰 플레이트). 이러한 작업은 많은 양의 인간 labor18, 긴 실험 시간을 필요로 하며 잠재적으로 부정확한 결과로 나타날 수 있는 인간의 실수의 확률을 증가시다. 또한 수동 처리는 상세한 특성화를 위해 다양한 파라미터 조합을 선별하기 위해 높은 샘플 번호를 효율적으로 준비하지 못하게 합니다. 수동 처리는 또한 약물 개발 중 유망한 화합물의 식별과 같은 고처리량 스크리닝 응용 프로그램에 대한 하이드로겔의 사용을 방해합니다. 현재 수동 기반 준비 단계는 수천 개의 약물로 구성된 약물 라이브러리를 검사하는 것이 불가능합니다. 이러한 이유로, 자동화된 솔루션은 효율적인 개발 프로세스를 제공하고 약물 선별 응용 프로그램을 위한 하이드로겔의 성공적인 번역을 가능하게 하는 데 필요합니다.
수동 기반 워크플로우에서 자동화된 프로세스로 이동하기 위해 열반응 재료에 대한 온도 도크의 통합, 모세관 피스톤 팁을 사용하는 기성품 양성 변위 파이펫 사용, 파이펫 팁 세척을 위한 옵션 팁 터치 도크 를 통해 점성 물질을 취급하기 위한 상용 오픈 소스 파이펫팅 로봇을 최적화했습니다. 이 파이펫팅 로봇은 새로 개발된 오픈 소스 워크스테이션에 파이펫팅 모듈로 더욱 통합되었으며, 이 로봇은 즉시 설치할 수 있는 모듈18,29로 구성되어 있습니다. 하드웨어 및 소프트웨어 파일을 포함한 개발된 워크스테이션에 대한 자세한 어셈블리 지침은 GitHub(https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation) 및 제노도 리포지토리(https://doi.org/10.5281/zenodo.3612757)에서 자유롭게 액세스할 수 있습니다. 하드웨어 개발 외에도 오픈 소스 프로토콜 설계 응용 프로그램이 프로그래밍되어 릴리스되어 매개 변수 선택 프로세스를 통해 사용자를 안내하고 즉시 사용할 수 있는 프로토콜 코드(https://github.com/SebastianEggert/ProtocolDesignApp)를 생성합니다. 이 코드는 상용 오픈 소스 파이펫팅 로봇뿐만 아니라 개발 된 오픈 소스 워크 스테이션에서 실행됩니다.
본 명세서에서 점성 물질에 대한 혼합 작업을 자동화하기 위해 오픈 소스 워크스테이션의 작동에 대한 포괄적인 튜토리얼이 제공됩니다(그림 1). 튜토리얼별 프로토콜 단계는 개발된 오픈 소스 워크스테이션뿐만 아니라 상업용 오픈 소스 파이펫팅 로봇을 통해 수행할 수 있다. 자체 개발한 오픈 소스 프로토콜 설계 애플리케이션, 글리세롤, 젤라틴 메타크릴로일(GelMA) 및 알기네이트에 필요한 농도의 자동화된 혼합 및 준비에 의해 지원된다. 글리세롤은 잘 특성화되어 있기 때문에이 튜토리얼에서 선택되었습니다30,31, 그것은 저렴하고 쉽게 사용할 수 있으며, 따라서, 일반적으로 자동화 된 파이펫 작업에 대한 점성 참조 재료로 사용된다. 생물 의학 응용 분야에 사용되는 하이드로겔의 예로, GelMA 및 알지네이트 하이드로겔 전구체 솔루션은 자동화된 혼합 실험에 적용되었습니다. GelMA는 세포 캡슐화 연구에 가장 일반적으로 사용되는 하이드로겔 중 하나를 제시32,33, alginate는 이중 네트워크 하이드로겔을 제조 하는 능력을 입증 하기 위해이 연구에서 선택 되었다34,35. 오렌지 G를 염료로 사용하여 분광계계16을 사용하여 혼합 결과를 검증하고 검증하기 위해 빠르고 저렴한 절차가 구현되었습니다.
상용 오픈 소스 파이펫팅 로봇은 개발된 오픈 소스 워크스테이션(그림 2a)에 파이펫팅 모듈로 통합되어 있으며, 따라서 '파이펫팅 모듈'이라는 이름은 파이펫팅 로봇을 설명하기 위해 더 많이 사용된다. 설치된 하드웨어에 대한 자세한 설명은 이 프로토콜의 범위를 벗어나무로 하며 오픈 소스 플랫폼의 일반 어셈블리에 대한 단계별 지침도 포함하는 제공된 리포지토리를 통해 사용할 수 있습니다. 파이펫팅 모듈에는 축 A(오른쪽)와 축 B(왼쪽)에 설치된 두 개의 파이펫(단일 또는 8채널 파이펫)이 장착될 수 있습니다(그림 2b). 파이펫팅 모듈은 미국 국립 표준 연구소/실험실 자동화 및 스크리닝 협회(ANSI/SLAS) 표준에 따라 10데크 용량을 제공하며, 다음과 같은 위치 위치는 갑판에 정의됩니다: A1, A2, B1, B2, C1, C2, D1, D2, E1, E2(그림 2c). 하이드로겔 용액의 사진 유도 중합화를 시작하려면 별도의 크로스링커 모듈이 필요하며 워크스테이션에 추가되었습니다. 크로스링커 모듈에는 파장이 400nm인 LED가 장착되어 있으므로 가시광선 파장에서 흥분하는 물질은 리튬 페닐-2,4,6 트라이메틸벤조일포스파이네이트(LAP)36,37과 같은 전류 시스템과 함께 사용될 수 있다. LED의 강도(mW/cm2)는 프로토콜 설계 응용 프로그램에서 사용자가 상호 연결 동작38을 연구할 수 있습니다. 워크스테이션에는 처리량 증가를 위한 스토리지 모듈도 포함됩니다. 그러나 이 모듈은 이 스터디 내에서 사용되지 않으므로 더 이상 설명되지 않습니다. 일반적으로, 샘플 오염을 피하기 위해 생물학적 안전 캐비닛에서 파이펫팅 모듈을 작동하는 것이 좋습니다. 파이펫팅 모듈을 작동하는 주요 전력 회로는 대부분의 국가에서 저전압 응용 프로그램으로 간주되는 12 V 회로입니다. 모든 전기 부품은 전용 제어 상자에 기반을 두고 있어 사용자가 전기 위험의 근원과 접촉하지 못하게 합니다.
이러한 표준화된 혼합 프로토콜을 준수함으로써 연구자들은 점성뿐만 아니라 점성이 없는 재료에 대한 신뢰할 수 있는 혼합물을 자동화된 방식으로 달성할 수 있습니다. 오픈 소스 접근 방식을 통해 사용자는 혼합 시퀀스를 최적화하고 새로 개발된 프로토콜을 커뮤니티와 공유할 수 있습니다. 궁극적으로, 이러한 접근법은 여러 요인 간의 상호 의존성을 조사하기 위해 다중 파라미터 조합의 스크리닝을 용이하게 하고, 따라서, 생체 의학 응용을 위한 점성 물질의 신뢰할 수 있는 적용 및 개발을 가속화할 것이다.

<table><tbody><tr><td>15 반응 튜브</td><td>Fisher Scientific, Inc. (미국)</td> <td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 튜브</td><td>Pacific Laboratory Products Australia Pty. Ltd. (호주)</td> <td>SCT-5ML</td><td>크기는 실험 프로토콜에 따라 다릅니다. Eppies (0.5, 1, 1.5 mL) 또는 Falcon 튜브 (15, 50mL)도 사용할 수 있습니다. 제품은 Axygen, Inc.에서 제조합니다. https://www.pacificlab.com.au/shop/tubes-plastic/sct-5ml-tubewith-screwcap-blue-unassembled-5ml-self-standing/1/name</td></tr><tr><td>50 mL 반응 튜브</td><td>Fisher Scientific, Inc. (미국)</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70% w/w 에탄올</td><td>LabChem, Inc. (미국)</td><td>aja726-5Lpl</td><td></td></tr><tr><td>96-well plate</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc. (미국)</td><td></td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/168055</td></tr><tr><td>알긴산</td><td>노바매트릭스</td><td></td><td>4200001 https://www.novamatrix.biz/store/pronova-up-lvg/</td></tr> <tr><td>탈염 또는 초순수(MilliQ) 물</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>젤라틴 메타크릴레이일(GelMA)</td>합성 <td>사내</td><td></td><td>상세 프로토콜(재료 및 참고 자료 포함)은 Loessner et al. (2016), Nature Protocols에서 확인할 수 있습니다. https://www.nature.com/articles/nprot.2016.037</td></tr><tr><td>리튬 페닐 -2,4,6- 트리메틸 벤조일 포스 피네이트 (LAP)</td> <td>Sigma-Aldrich, Inc. (미국</td><td>) 900889</td><td></td></tr><tr><td>M4 및 M5 Allen key</td><td>OpenBuilds, inc. (미국)</td> <td>179, 190</td><td>모든 철물점에서도 구입할 수 있습니다.https://openbuildspartstore.com/allen-wrench/</td></tr> <tr><td>OrangeG</td><td>Fisher Scientific (미국)</td> <td>O267-25</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/orange-g-certified-biological-stain-fisher-chemical/O26725</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.(미국)</td><td>14190-144</td><td>교대: PBS 정제: 18912014(Thermo Fisher Scientific)</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 블록 온도 도크용</td><td>Ratek Instruments Pty. Ltd.(호주)</td> 다양한 튜브 크기에 대한 <td>SB16</td><td>블록을 사용할 수 있습니다. http://www.ratek.com.au/products/SB16-Block-with-12x16mm-holes.html</td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Sartorius AG (독일)</td><td>ED224S</td><td></td></tr><tr><td>오픈 소스 액체 핸들링 로봇 : 상용 제품</td><td>Opentrons Laboratories, Inc. (미국)</td> <td>OT-One S Pro</td><td>https://shop.opentrons.com/products/ot-one-pro</td></tr><tr><td>오픈 소스 액체 핸들링 로봇 : 오픈 소스 하드웨어</td><td>오픈 소스 접근 방식에</td><td></td> 따라 사내에서 조립된 <td>하드웨어 및 소프트웨어 파일은 GitHub 및 Zenodo(링크 제공)에서 자유롭게 액세스할 수 있으며 조립 지침이 제공됩니다. https://github.com/SebastianEggert/OpenWorkstation. https://zenodo.org/record/3612757#.XipEjBV7F24</td></tr><tr><td>용적식 파이펫: MicromanE</td><td>Gilson, Inc.(미국)</td><td>FD10006</td><td>필요한 크기에 따라 다릅니다. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipettes/positive-displacement.html</td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>BMG LABTECH GmbH (독일)</td><td>CLARIOstar</td><td></td></tr><tr><td>팁 : 모세관 피스톤</td><td>Gilson, Inc. (미국)</td><td>F148180</td><td>필요한 크기에 따라 다릅니다. https://www.gilson.com/default/shop-products/pipette-tips.html?technique_en_ww_lk=191</td></tr></tbody></table>

하이드로겔 기반 3d 문화 모델을 자동화및 표준화방식으로 제조하는 오픈 소스 기술 플랫폼

An Open Source Technology Platform to Manufacture Hydrogel-Based 3D Culture Models in an Automated and Standardized Fashion

점성 재료의 현재 혼합 단계는 주로 낮은 처리량 모드에서 수동으로 수행되는 반복적이고 시간이 많이 소요되는 작업에 의존합니다. 이러한 문제는 궁극적으로 연구 결과의 불복시 발생할 수 있는 워크플로우의 단점을 나타냅니다. 수동 기반 워크플로우는 생물 의학 응용 분야에 사용되는 하이드로겔과 같은 점성 물질의 발전과 광범위한 채택을 더욱 제한하고 있습니다. 이러한 과제는 표준화된 혼합 프로세스와 자동화된 워크플로우를 사용하여 재현성을 높여 이를 극복할 수 있습니다. 이 연구에서는 오픈 소스 프로토콜 디자이너를 사용하고, 오픈 소스 워크스테이션을 운영하고, 재현 가능한 혼합물을 식별하는 단계별 지침을 제시합니다. 특히 오픈 소스 프로토콜 디자이너는 실험 적인 매개 변수 선택을 통해 사용자를 안내하고 워크스테이션을 작동하도록 즉시 사용할 수 있는 프로토콜 코드를 생성합니다. 이 워크스테이션은 점성 재료의 파이펫팅에 최적화되어 열반응 재료에 대한 온도 도크의 통합, 점성 재료에 대한 양수 변위 파이펫 및 피펫 팁 끝에서 과도한 재료를 제거하는 옵션 팁 터치 도크를 통합하여 자동화되고 신뢰성이 높은 취급을 가능하게 합니다. 혼합물의 검증 및 검증은 오렌지 G의 빠르고 저렴한 흡광도 측정에 의해 수행됩니다. 이 프로토콜은 80% (v/v) 글리세롤 혼합물, 젤라틴 메타크릴로일(GelMA)에 대한 희석 계열, 5%(w/v) GelMA 및 2% (w/v) 알기네이트의 이중 네트워크 하이드로겔을 획득하는 결과를 제시한다. 프로토콜 채택을 지원하는 문제 해결 가이드가 포함되어 있습니다. 설명된 워크플로우는 여러 점성 재료에 광범위하게 적용되어 자동화된 방식으로 사용자 정의 농도를 생성할 수 있습니다.

이 자습서에서는 글리세롤(그림 3)과 LAP 및 알기네이트를 곁들인 GelMA(그림 4)를 가진 실험에 대한 결과를 제공합니다.
80%(v/v) 글리세롤 용액의 생성은 온도 조절(실온, 22°C) 및 팁 터치 없이(설정 1로 정의), 온도 제어(40°C) 및 팁 터치(40°C) 없이 또는 온도 제어(40°C) 및 팁 터치(3)를 가진 것으로 조사하였다. 이들 두 가지 온도 설정은 글리세롤의 점도가 22°C(139.5mPa·s)에서 40°C(46.6mPa·s)30으로 가열될 때 거의 3배씩 감소하기 때문에 처리 차이를 평가하기 위해 선택되었다. 글리세롤의 85% (v/v) 스톡 용액은 최종 농도인 80%로 희석되고 96웰 플레이트(설정당 96개)로 균일하게 분포하였다. 각 물질의 분배를 혼합 튜브로 분배하는 것을 포함하는 실험 시간은, 각각의 혼합 작업 및 샘플 분포를 96 웰 플레이트로, 30분 42s였다. 희석 혼합물 간의 차이를 식별하기 위해, 초순수 수-글리세롤희석제로서-1 mg/mL 오렌지 G로 제조하였다. 흡광도 판독값은 온도 조절과 팁 터치의 통합이 혼합물(p &lt; 0.0001)에 크게 영향을 미친다는 점을 강조합니다. 수행된 차이(ANOVA)의 수행된 양방향 분석 외에도 CV 값을 계산하여 상대표준 편차를 평가했습니다. 변형 계수는 평균과 관련하여 편차 정도를 식별하는 표준화된 지표를 설명하고 백분율로 표현됩니다. 샘플 수단이 특히 관심 지점이 아니라 측정 내의 가변성인 경우 변형 계수는 재현 가능한 혼합물46을 식별하는 추가 통찰력을 제공합니다. 세 가지 설정을 이용한 이 실험에서 흡광도 값은 CV 값이 5.6%, 4.2%, 설정 1, 셋업 2 및 셋업 3의 CV 값이 각각 2.0%로 감소하여 온도 도크의 상당한 영향을 나타내고 팁 터치 기능이 신뢰할 수 있는 결과를 생성하는 것으로 나타났습니다(그림 3a-ii). 설정 3(표본 번호 #1 ~ 96웰 플레이트)에 대한 샘플 흡광도 값을 플로팅하면 실험 전반에 걸쳐 값이 증가하거나 감소하지 않으므로 흡광도 값에 대한 샘플 위치의 영향을 나타내지 않습니다(그림 3a-iii). 히트 맵을 사용하여 측정된 각 웰 플레이트의 데이터를 시각화하면 특정 행 또는 열또는 분배 작업 전반에 걸쳐 다양한 흡광도 값에 대한 이질성을 식별할 수 있는 추가 통찰력을 얻을 수 있습니다. 세 개의 설정에 대한 시각화된 히트맵은 셋업 1에서 셋업 3(그림 3b)까지 전체 웰 플레이트에 걸쳐 이질성이 감소합니다. 마지막으로, 실시된 혼합의 복제성은 8개의 독립 실행(그림 3c-i,ii) 내에서 평가되었으며, 각 실행은 6분 57초였습니다. 단일 혼합 실행은 1.1%에서 2.6%의 낮은 CV 값을 보였으며 이는 개별 런에 대해 매우 신뢰할 수 있는 혼합 및 디스펜싱 작업을 나타냅니다. 8개의 런 모두의 흡광도 값은 CV 값을 3.3%로 산출하고 확립된 혼합 프로토콜의 재현성을 입증했습니다.
GelMA 희석 시리즈는 PBS를 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 및 0%(w/v)로 PBS로 20%(w/v) 스톡 솔루션을 희석하고 LAP를 0.15%(w/v)(그림 4a-i)의 일정한 농도로 추가하여 총 55분 12분으로 조정하였다. 실험 프로토콜 스크립트에 명시된 바와 같이, 하이드로겔은 400 nm에서 2.0 mW/cm2의 강도로 30s를 교차했다. 혼합물 간의 차이를 평가하기 위해, PBS-는 GelMA 및 alginate에 대한 희석제로서 -1 mg/mL 오렌지 G.로 제조되었기 때문에, 한 혼합물 내의 샘플 과 직렬 희석 사이의 흡수도 차이는 분광광계로 확인되었다. 각 농도 단계의 측정 된 흡광도 값은 현저하게 상이하며 (p &lt; 0.0001) 농도 단계 (n = 12 농도 단계 당)에 걸쳐 1.2 %와 3.4 % 사이의 매우 낮은 CV 값을 갖는다. 선형 회귀는 R² 값 0.9869(도 4a-ii)와 히트맵으로 높은 적합성을 입증하여 각 농도에 대한 균질 분포와 농도 간의 차이를 확인하였다(도 4a-iii). 4개의 시약의 자동 혼합은 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) alginate, 0.15% (w/v) LAP, 및 PBS를 희석제(setup 2) 및 (설정 3) 터치 팁(각 설정에 대해 96)과 동일한 교차 연결 파라미터(30, 2.02)를 실시하였다. 4개의 재료를 분배하고, 혼합하고, 96웰 플레이트로 분배하는 데 32분 22초가 걸렸습니다. GelMA 및 alginate를 가진 모든 실험은 GelMA의 파이펫팅을 방지하는 열 겔화를 방지하기 위하여 37°C에서 실시되었습니다. 팁 터치 옵션을 사용하면 CV 값이 5.2%에서 3.4%로 감소했으며, 특히 팁에서 초과 재료를 제거하여 하부 지역의 이상값을 방지하였다(그림 4b-i). 설정 2 및 설정 3의 평균 값은 1.927 및 1.944이지만 변형 계수는 평균과 관련하여 감소하는 편차를 강조합니다. 96 웰 플레이트의 단일 행은 열 매핑 시각화를 사용하여 행 및/또는 열 차이를 감지할 수 있습니다(그림 4b-ii).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig1.jpg"> 그림 1: 개별 작업을 갖춘 프로토콜 워크플로우입니다. 설명된 워크플로는 설정, 준비, 실행 및 분석으로 구분되는 7개의 작업으로 나뉩니다. 처음에는 소프트웨어(작업 1)와 하드웨어(작업 2)를 설정해야 합니다. 재질(task 3)과 프로토콜 스크립트(task 4)의 생성을 준비한 후, 파이펫팅 모듈은 파이펫 및 컨테이너 위치(task 5)를 정의하여 보정된다. 다음으로, 프로토콜 스크립트는 워크스테이션(task 6)에서 실행되고 혼합물의 유효성 검사 및 검증(작업 7)이 수행되어 혼합물을 평가한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig2.jpg"> 그림 2: 파이프 모듈의 오픈 소스 워크스테이션 및 데크 설정입니다. (a) 개발된 워크스테이션은 샘플이 서로 다른 모듈을 통해 전송되는 조립 라인 접근 방식에서 영감을 받았으며, 파이펫팅, 크로스링커, 스토리지, 전송 및 계산 모듈과 같은 모듈로 구성됩니다. (b) 파이펫팅 모듈의 데크는 실험 레이아웃(예: 음판 유형, 튜브 부피 등)에 따라 설정됩니다. 표시된 데크 설정은 제시된 실험에 사용되었으며 10-100 μL(M100E) 및 100-1,000 μL(M1000E), 모세관 피스톤(CP)이 있는 팁 랙(CP10000) 및 100μL(CP10000) 및 CPL(100,000)의 범위의 양양성 배피페로 구성됩니다. 입력 시약용 믹싱 트레이 및 입력 트레이. (c) 사용 가능한 데크 위치는 표시된 숫자로 정의됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig3.jpg"> 그림 3: 글리세롤 혼합물의 자동 파이펫팅 에 대한 결과. (a) 유연한 워크스테이션 설계를 통해 세 가지 설정(i)을 평가하여 재현 가능한 결과를 위한 최적의 매개 변수를 식별할 수 있습니다. (ii) 재료의 팁 터치 및 가열의 첨가는 분산(CV) 값의 계수를 감소시키고 셋업 3에 대한 매우 재현 가능한 혼합물을 초래하였다. 각 실험은 96개의 샘플로 수행되었다. (iii) 단일 샘플 값의 플로팅은 파이펫팅 시퀀스에 영향을 미치지 않았다. (b) 각 설정의 실험 결과는 원시/열 차이, 모서리 또는 마스터 혼합물에 미치는 영향을 식별하기 위해 열 맵으로 시각화되었습니다. (c) 셋업 3의 재현성은 (i) 중앙값, 표준 편차, CV 값 및 (ii) 히트맵을 사용하여 8개의 독립 실행 내에서 분석되었다. 패널 a-ii (n = 96) 및 b-i (n = 12)의 데이터는 수단및 단일 데이터 포인트로 제시된다. 통계적 유의성은 분산(ANOVA)의 양방향 분석을 사용하여 0.0001&lt; 0.0001로 정의되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig4.jpg"> 그림 4: 하이드로겔과 작업을 혼합한 결과. (a) 젤라틴 메타크릴(GelMA) 20% (w/v) 스톡 용액에서, 14, 12, 10, 8, 6, 4, 2 및 0%(w/v)의 연속 희석은 96웰 플레이트(n=12)를 사용하여 하나의 실험 실행 내에서 생성되었다. (i) 분산(CV) 값의 계수는 준비된 농도 전반에 걸쳐 1.2%와 3.4% 사이였으며, (ii) 선형 회귀는 R² 값0.9869로 높은 적합을 보였다. (iii) 균질 희석제는 생성된 히트맵을 통해 시각적으로 확인되었다. (b) 더블 네트워크 하이드로겔은 5% (w/v) GelMA, 2% (w/v) 알기네이트, 팁 터치 없이 0.15% (w/v) LAP(i)로 생성되었으며, 400nmm2에서 2.0mW/cm2 의 강도로 30s를 교차 연결하였다. 팁 터치의 통합으로 CV 값이 5.2%에서 3.4%로 감소했습니다. (ii,iii) 히트맵은 팁 터치를 사용하여 팁에서 과도한 재료를 제거할 때 편차를 줄입니다. 패널 a-i 및 b-i 의 데이터는 수단과 단일 데이터 요소가 표시됩니다. 통계적 유의성은 0.05&lt; 0.05, *p &lt; 0.001, +p &lt; 0.0001로 정의하였다 분산(ANOVA)의 단방향 분석을 이용하여. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61261/61261fig5.jpg"> 그림 5: 점성 생체 재료에 대한 파이펫 유형 차이 및 문제의 요약. (a) 시약과 피스톤은 디스펜싱 단계 동안 수축하고 경각 단계에서 확장되는 에어 쿠션으로 분리됩니다. 점성 물질을 흡입하고 분배할 때, 느린 '흐름'은 기포및 불규칙한 파이펫팅 동작과 같은 문제를 소개합니다. (b) 양극기 피펫은 팁 내부의 피스톤을 사용하여 점성 물질을 안정적으로 흡입하고 분배할 수 있게 합니다. (c) 고점성 물질의 파이프팅(예를 들어, 4% (w/v) 알기네이트)는 팁에 과잉 물질이 축적되어 실험 전반에 걸쳐 부정확성을 유발할 수 있다. (d) 간단한 팁 터치 트레이의 구현은 팁에 초과 된 재료를 제거하고 정확한 흡입 및 분배 볼륨을 초래한다. 팁 랙 용기에 놓인 웰 플레이트 뚜껑의 내부면을 이용하여 실현된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/61261fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:font-size="9px" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>소재 #1 (재고 농도)</td>
			<td>재료의 최종 농도 #1</td>
			<td>소재 #2 (재고 농도)</td>
			<td>재료의 최종 농도 #2</td>
			<td>재료 #3 (재고 농도)</td>
			<td>재료의 최종 농도 #3</td>
			<td>딜루엔트 (오렌지 G 작업 솔루션)</td>
			<td>혼합물의 최종 오렌지 G 농도</td>
			<td>그림으로 표시</td>
		</tr>
<tr>
<td>글리세롤 (85% (w/v))</td>
			<td>80% (/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>물 (1 mg / mL 오렌지 G)</td>
			<td>0.059 mg/mL</td>
			<td>그림 3a-c</td>
		</tr>
<tr>
<td>겔마 (20% (w/v)</td>
			<td>0% (w/v)</td>
			<td>랩 (3% (/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL 오렌지 G)</td>
			<td>1 mg/mL</td>
			<td>그림 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>겔마 (20% (w/v)</td>
			<td>2% (w/v)</td>
			<td>랩 (3% (/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL 오렌지 G)</td>
			<td>0.85 mg/mL</td>
			<td>그림 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>겔마 (20% (w/v)</td>
			<td>4% (w/v)</td>
			<td>랩 (3% (/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL 오렌지 G)</td>
			<td>0.75 mg/mL</td>
			<td>그림 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>겔마 (20% (w/v)</td>
			<td>6% (w/v)</td>
			<td>랩 (3% (/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL 오렌지 G)</td>
			<td>0.65 mg/mL</td>
			<td>그림 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>겔마 (20% (w/v)</td>
			<td>8% (w/v)</td>
			<td>랩 (3% (/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL 오렌지 G)</td>
			<td>0.55 mg/mL</td>
			<td>그림 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>겔마 (20% (w/v)</td>
			<td>10% (/v)</td>
			<td>랩 (3% (/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL 오렌지 G)</td>
			<td>0.45 mg/mL</td>
			<td>그림 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>겔마 (20% (w/v)</td>
			<td>12% (w/v)</td>
			<td>랩 (3% (/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL 오렌지 G)</td>
			<td>0.35 mg/mL</td>
			<td>그림 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>겔마 (20% (w/v)</td>
			<td>14% (/v)</td>
			<td>랩 (3% (/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS (1 mg/mL 오렌지 G)</td>
			<td>0.25 mg/mL</td>
			<td>그림 4a</td>
		</tr>
<tr>
<td>겔마 (20% (w/v)</td>
			<td>5% (w/v)</td>
			<td>알기네이트 (4% (w/v)</td>
			<td>2% (w/v)</td>
			<td>랩 (3% (/v))</td>
			<td>0.15% (w/v)</td>
			<td>PBS (1 mg/mL 오렌지 G)</td>
			<td>0.2 mg/mL</td>
			<td>그림 4b</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 수행된 실험에 대한 매개 변수 개요입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>프로토콜 단계</td>
			<td>문제</td>
			<td>가능한 이유</td>
			<td>용액</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1</td>
			<td>소프트웨어를 설치하거나 업데이트할 수 없습니다.</td>
			<td>SD 카드의 디스크 공간이 부족함</td>
			<td>SD 카드의 디스크 공간을 확인합니다. 필요한 경우 불필요한 품목, 빈 빈 빈 을 제거하거나 적절한 크기의 SD 카드를 사용</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.2</td>
			<td>API를 설치할 수 없습니다.</td>
			<td>설치에 대한 사용자 기능이 제한됩니다(루트 사용자 권한 없음)</td>
			<td>지정된 명령 앞에 'sudo' 명령을 사용하여 관리자 권한을 얻습니다. 리눅스에서, 액세스의이 종류를 슈퍼 사용자로 알려져 있다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>3.1</td>
			<td>GelMA의 문제</td>
			<td>기능화, 투석 또는 용우화</td>
			<td>Loessner 외.33에서 사용할 수 있는 문제 해결 목록을 포함한 자세한 단계별 프로토콜.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5.1 및 6.2</td>
			<td>워크스테이션은 명령에 반응하지 않습니다.</td>
			<td>연결 문제</td>
			<td>모든 것을 돌리고 컴퓨터를 종료합니다. 전원 공급 장치를 10s로 끕합니다. 컴퓨터와 워크스테이션을 다시 켜고 전원을 공급할 수 있습니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>5.1 및 6.2</td>
			<td>워크스테이션은 명령에 반응하지 않습니다.</td>
			<td>연결 문제</td>
			<td>컴퓨터가 USB 연결을 인식하고 USB 포트가 올바르게 정의된지 확인합니다. 방화벽이 연결 프로세스를 방해하지 않는지 확인합니다(표 2 아래 링크 참조).</td>
		</tr>
<tr>
<td>5.1 및 6.2</td>
			<td>파일을 열 수 없습니다.</td>
			<td>잘못된 디렉토리</td>
			<td>디렉터(폴더 경로)를 확인하여 올바른 경로가 사용되고 있는지 확인합니다. 파일(예: interface.py)을 찾을 수 없는 경우 잘못된 경로가 사용중일 수 있습니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>팁이 제대로 부착되지 않았거나 이동 중에 떨어지지 않습니다.</td>
			<td>교정 문제</td>
			<td>파이펫에 대한 교정 단계를 반복하고 모세관 피스톤이 파이펫과 제대로 연결되어 있는지 확인합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>팁이 제대로 부착되지 않았거나 이동 중에 떨어지지 않습니다.</td>
			<td>첨부 파일 문제</td>
			<td>파이펫은 파이펫 축에 제대로 연결되지 않고 이동 단계 중에 이동합니다. 나사를 단단히 조이서 이를 방지합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>팁은 재료 위에 땀을 흘리고 있습니다.</td>
			<td>교정 문제</td>
			<td>높이를 제대로 정의하려면 이 트레이 유형의 교정을 반복합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>팁은 재료 위에 땀을 흘리고 있습니다.</td>
			<td>교정 문제</td>
			<td>튜브에서 볼륨을 확인하고 볼륨이 프로토콜 디자이너 응용 프로그램에 정의된 볼륨과 동일한지 확인합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>움직임 중에 재료가 찍어</td>
			<td>팁에 너무 많은 과잉 재료</td>
			<td>팁 터치 도크 옵션을 추가; 선택적으로 팁 터치 시간도 늘릴 수 있습니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>6.6.2</td>
			<td>재질은 파이펫팅에 대해 단단하거나 점성이 너무 큽다.</td>
			<td>물질의 열 반응 행동</td>
			<td>열 반응 성 재료 특성을 확인하고 그에 따라 온도 도크의 가열 / 냉각 온도를 조정합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">https://support.opentrons.com/en/articles/2687601-c-having-trouble-connecting-try-this-basic-troubleshooting</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 확인된 문제, 가능한 이유 및 문제를 해결하는 솔루션이 있는 문제 해결 테이블.
추가 파일. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61261/supplementary_template-analysis.xlsx" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 점성 재료의 표준화되고 재현 가능한 혼합을 위한 포괄적인 자습서역할을 하며, 새로운 오픈 소스 자동화 기술이 있습니다. 새로 개발된 오픈 소스 워크스테이션 의 작동, 오픈 소스 프로토콜 디자이너의 사용, 재현 가능한 혼합물을 식별하기 위한 유효성 검사 및 검증에 대한 자세한 지침이 제공됩니다.

하이드로겔 기반 3D 문화 모델을 자동화및 표준화방식으로 제조하는 오픈 소스 기술 플랫폼

Current mixing steps of viscous materials rely on repetitive and time-consuming tasks which are performed mainly manually in a low throughput mode. These ...

생물 의학 연구는 새로운 연구 사실 인정이 거의 치료 응용 프로그램으로 번역된다는 점에서 재현성 위기에 직면하고 있습니다. 이 프로토콜은 인적 요인을 줄이고 제조에 자동화 및 표준화를 도입합니다. 이 방법은 하이드로겔이 지난 10년 이내에 암 및 기타 질병 조직 모델에서 가장 많이 사용되는 플랫폼이 되었기 때문에 3D 세포 배양 응용 을 위한 사진 교차 링크 가능한 하이드로겔에 특히 초점을 맞추고 있습니다.우리는 오픈 소스 기술 플랫폼의 개발과 함께 현재하드웨어 및 소프트웨어 제한을 성공적으로 해결했습니다. 이 플랫폼은 하이드로겔을 위해 특별히 설계되었으며 조직 엔지니어링 연구를 위한 자동화된 제조 워크플로우를 지원합니다. API를 설치하려면 명령줄 인터페이스를 엽니다.작업 API를 설치하려면 핍 설치 오픈워크스테이션을 입력하고 Enter를 누릅니다. 파이펫팅 바이오 제작 모듈을 작동하려면 명령을 입력하여 opentrons API를 설치합니다. 그런 다음 명령줄을 사용하여 Python 스크립트를 열고 두 API가 성공적으로 설치되었는지 확인합니다.프로토콜 코드를 생성하려면 프로토콜 디자인 응용 프로그램을 열어 플랫폼에서 실행될 사용자 지정된 프로토콜 스크립트를 생성합니다. 인터페이스는 일반적으로 사용되는 모든 인터넷 브라우저에서 실행됩니다. 설정 페이지에서 프로토콜 이름을 입력하고 계속을 클릭합니다.입력 트레이 설정에서 입력 트레이를 정의하기 위해 3~4개의 가열 블록을 선택합니다. 재료 및 재고 농도를 정의하려면 정의 입력 메뉴에서 Gel 1을 선택하고 GelMA를 이름으로 입력합니다. 재고 농도를 20%로 설정하고 샘플 수를 3개로 설정하고 추가를 클릭하여 항목을 저장하고 첫 번째 열을 채웁니다.정의 입력 메뉴에서 젤 2를 선택하고 Alginate를 이름으로 입력합니다. 재고 농도를 4%로 설정하고 샘플 수를 3개로 설정하고 추가를 클릭하여 항목을 저장하고 두 번째 열을 채웁니다. 포토니티에이터 및 희석 매개변수를 시연된 대로 설정한 후 사진 교차 연결을 선택하고 시간을 30초로 설정하고 강도를 2초로 설정하고 확인을 클릭합니다. 다음으로, 웰 플레이트 유형을 96웰 플레이트로 설정하고 그룹 1을 클릭하여 이중 네트워크 하이드로겔을 만들기 위한 매개 변수를 지정할 수 있도록 합니다.그런 다음 필요한 경우 적용 고급 믹싱 프로토콜 상자를 확인하고 샘플 수를 96으로 설정하고 계속을 클릭합니다. 데크 레이아웃을 설정하려면 각 슬롯에 적합한 트레이 유형을 선택합니다. 모든 트레이 유형을 선택한 경우 파이펫 왼쪽 상자를 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 10~100마이크로리터 양수 변위를 선택합니다.멸망 속도를 600으로 설정하고 디스펜싱 속도를 800으로 설정합니다. 그런 다음 피펫 오른쪽 매개 변수를 동일한 방식으로 설정합니다. 그런 다음 프로토콜 생성을 클릭하여 프로토콜 스크립트를 생성하고 저장합니다.프로토콜을 실행하기 전에 소모품을 70%에탄올로 분사하고 사용자 설정에 정의된 설정에 따라 배치합니다. 선택한 설정에 따라 온도 도크에 알루미늄 블록에 재료와 반응 튜브를 배치합니다. 다음으로, 장갑을 70% 에탄올로 스프레이하고 열린 튜브를 만지지 않고 반응 튜브를 조심스럽게 엽니다.물질이 적절한 실험 온도에 도달하면 사용자 인터페이스를 사용하여 생성된 프로토콜을 실행합니다. 워크스테이션은 호밍 프로세스로 시작하여 저장소 모듈에서 빈 웰 플레이트를 얻습니다. 웰 플레이트에서 뚜껑을 제거한 후 플레이트는 다음 모듈로 이송됩니다.프로토콜은 각 스톡 솔루션에서 파이펫되는 볼륨을 지정하고 교차 오염을 방지하기 위해 각 재질 후 팁을 자동으로 변경합니다. 점성 솔루션을 재현 가능한 방식으로 혼합하기 위해 워크스테이션은 점성 하이드로겔에 최적화된 특정 혼합 프로토콜을 실행합니다. 프로토콜 디자인 앱은 저장소의 충전 수준을 고려하고 자동으로 혼합 높이를 조정하여 점성 재료에 불필요한 침지 방지를 가합니다.3D 모델과 웰 플레이트의 자동 생성 후 워크스테이션은 뚜껑으로 웰 플레이트를 다시 닫고 웰 플레이트를 저장소 모듈의 프로그래밍된 위치에 저장합니다. 프로토콜이 완료되면 저장 모듈에서 플레이트를 제거합니다. 수행된 프로토콜의 검증 및 검증을 위해 플레이트를 분광광계에 적재하고 450나노미터에서 흡수도를 두 번 읽습니다.흡광도 값을 저장한 후, 발행물의 보충 재료로 제공되는 분석 스프레드시트 파일을 열고 원시 데이터 시트의 테이블에 흡광도 판독값을 복사합니다. 그런 다음 분석 시트를 클릭하여 평균 값, 표준 편차 및 분산 값계수를 볼 수 있으며, 이는 특정 행및 96 웰 플레이트의 특정 열에 대해 균일한 샘플 분포에 대해 자동으로 계산되고 표시됩니다. 글리세롤 솔루션에 대한 높은 재현성을 보장하는 설정을 찾기 위해 프로토콜은 온도 제어 없이 팁 터치 없이 온도 제어 없이 팁 터치 없이 온도 제어 없이 또는 온도 제어 및 팁 터치로 생성되었습니다.세 번의 설정에 대한 변형 값의 계산된 계수는 온도 도크와 팁 터치 함수의 상당한 영향을 보여 주며, 두 피쳐를 모두 사용할 때 매우 재현 가능한 결과를 생성하는 프로토콜의 기능을 강조합니다. 온도 도크와 팁 터치 기능을 사용하여, 표준 편차는 셋업 3에서 크게 감소되었다. 세 번 설정에 대한 샘플 흡광도 값을 플로팅하는 것은 실험 전반에 걸쳐 값을 증가하거나 감소시키는 데 영향을 미치지 않으므로 흡광도 값에 대한 샘플 위치의 영향을 나타내지 않았다.다음으로, GelMA 희석 시리즈는 20%의 GelMA 주식 솔루션을 희석하고 다른 GelMA 희석제의 차이를 평가하여 제조되었습니다. 각 농도 단계에서 측정된 흡광도 값은 현저하게 상이했으며 선형 회귀는 생성될 뚜렷한 농도 단계의 능력을 확인하는 높은 적합성을 입증했다. 또한, 팁 터치의 영향은 5%의 GelMA, 2%alginate 및 0.15%LAP를 가진 이중 네트워크 하이드로겔에 대해 평가되었으며, 이는 설정으로 자동으로 생성되었다.팁 터치의 통합으로 재현 가능한 데이터 집합생성을 지원하는 표준 편차가 현저한 감소합니다. 흡광도 값과 열맵의 시각화는 팁 터치를 사용하여 팁터치를 사용하여 팁에서 과도한 재료를 제거할 때 편차를 줄이는 것을 확인했습니다. 당사의 기술은 3D 세포 배양 및 조직 공학을 위한 하이드로겔 제조의 자동화를 가능하게 합니다.기술적으로 까다로운 워크플로우의 처리량과 재현성을 높이기 위한 저비용 솔루션입니다. 사용자 정의 오픈 소스 접근 방식을 제공함으로써,이 기술은 조직 공학 연구에서 공정 자동화의 광범위한 적응을위한 길을 열어줍니다.

an-open-source-technology-platform-to-manufacture-hydrogel-based-3d

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜에서는, 우리는 기술의 기반이되는 수직 전이 게시물의 마이크로 액추에이터 어레이의 제조 방법 및이 기본 기술이 모두 2 차원 입체 문화에 높은 처리량 기계 역동적인 세포 배양을 실시하도록 수정할 수 있습니다을 증명 패러다임.

기계 다이나믹 셀 문화 Microfabricated 플랫폼

간단한 기법은 일반적인 세​​포 배양 기판에 동적 마스크 프로젝션 리소그래피를위한 디지털 micromirror 장치를 사용하여 microfabricated 신경 문화 시스템의 급속한 생산 설명되어 있습니다. 이러한 문화 시스템은 천연 생물 학적 구조가 더 대표 수 있으며, 설명된 기술은 다양한 어플 리케이션에 맞게 수 있습니다.

동적 마스크 프로젝션 석판술를 사용하여 신경 문화 시스템의 Micropatterned Hydrogels의 제작

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

우리는 함께 기능적 가능한 3 차원 조직의 구조체는 시험 관내 스크리닝의 용도 bioprinted 될 수있는 조직 흉내 낸 bioink 하이드로 겔을 제공하는 일련의 프로토콜을 설명한다.

Bioprinting Cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 Bioink를 사용하여 구축

우리 불멸 하 게 종양 및 섬유 세포 bioprintable alginate/젤라틴 bioink에 포함 된 구성 된 이기종 유 방 암 모델 개발. 모델이 비보에 종양 microenvironment tumorigenesis 운전 메커니즘에 대 한 통찰력을 양보 하는 다세포 종양 spheroids의 형성을 촉진 한다.

셀 회전 타원 체 형성을 유발 하는 모델 시스템에 3D 생체 외에서 Bioprintable Alginate/젤라틴 하이드로 겔

이 프로토콜은 환자 유래 제노이식(PDX)의 시험관 내 배양을 확장가능하게 하는 방법을 보여 줍니다. 한 단계는 실행 불가능한 단일 셀을 간단하게 제거하여 3D 하이드로겔에서 다세포 클러스터 배양의 전반적인 생존력을 향상시킵니다. 보조 단계는 PERfused 된 미세 유체 플랫폼에서 PDX 문화에 대한 모범 사례를 보여줍니다.

Perfused 마이크로 유체 플랫폼에서 환자 유래 제노이식의 Ex vivo 3D 하이드로겔 배양에 대한 향상된 생존력

이 논문은mm2당 수백 개의 마이크로컨테이너를 사용하는 새로운 유형의 배양 기질에 대한 제조 프로토콜을 제시하며, 이 배양에서 오가노이드는 고해상도 현미경을 사용하여 배양 및 관찰할 수 있습니다. 세포 파종 및 면역 염색 프로토콜도 자세히 설명되어 있습니다.

오가노이드의 배양 및 3D 이미징을 위한 고처리량 플랫폼

이 프로토콜은 처리량이 많은 스캐폴드 기반 배양 플랫폼인 SPOT의 제작 및 조립을 96웰 및 384웰 형식으로 문서화합니다. 또한 수동 및 상업적으로 이용 가능한 액체 처리기를 사용하여 SPOT의 파종 프로세스에 대해 자세히 설명합니다.

고처리량 스캐폴드 기반 배양 플랫폼으로서의 SPOT의 재현 가능한 제조

이 프로토콜은 메타크릴화 젤라틴(GelMA) 하이드로겔에 박힌 인간 골세포를 이용해 탈세포화된 세포외기질을 보충하여 3D 골 구조물을 제작하는 과정을 설명합니다. 이 방법은 저비용, 확장 가능, 기본 실험실 장비와 호환되어 근골격계 질환 과정을 연구할 수 있는 번역 플랫폼을 제공합니다.

인간 골격계와 탈세포화된 세포외기질을 이용한 근골격계 질환 모델링을 위한 3D 골배양 플랫폼

GENPLAT (GLBRC 효소 플랫폼)는 바이오 매스 열화에 대한 효소 칵테일의 발견과 최적화를위한 자동화 플랫폼입니다. 이것은 여러 feedstocks 및 여러 구성 요소를 포함하는 효소의 혼합물에 적용할 수 있습니다.

GENPLAT : 바이오 매스의 효소 발견과 칵테일 최적화를위한 자동 플랫폼

학습하세요 조직공학 연구를 위한 하이드로겔 자동 제조 프로토콜을 개방형 소스 플랫폼을 활용하여 점성 물질 혼합의 재현성을 높이고 인간 오류를 최소화하는 방법을.

하이드로겔 기반 3D 문화 모델을 자동화및 표준화방식으로 제조하는 오픈 소스 기술 플랫폼

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