Name: 뉴런의 세포 인신 매매 연구를 위한 튜브에서 정제하고 직접 모노 바이오티니레이트 BDNF를 정화하는 향상된 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: 학습하세요 HEK293 세포에서 BDNF를 생산하고 정제하여 단일 바이오틴화하는 비용 효율적인 프로토콜을. 이 방법은 신경 세포 신호 연구와 형광 현미경 분석에 활용할 수 있습니다.

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저자는 폰데시트 (1171137) (FCB), 과학 기술 우수 센터 (AFB 170005) (FCB), 밀레니엄 핵 (P07/011-F) (FCB), 웰컴 트러스트 수석 조사상 (107116/ Z/Z/ 15) 영국 연구소(107116/Z/Z)의 재정 지원을 감사하게 인정합니다. 이 작품은 Unidad 드 마이크로스코피아 아반자다 UC (UMA UC)에 의해 지원되었다.

모든 실험은 CONICYT (칠레 과학 기술 연구위원회)의 승인 된 지침에 따라 수행되었습니다. 이 연구에서 사용된 프로토콜은 폰티피시아 대학 카톨리카 데 칠레의 생물 보안 및 생물 윤리 및 동물 복지 위원회에 의해 승인되었습니다. 척추 동물과 관련된 실험은 폰티피시아 대학 카톨리카 데 칠레의 생물 윤리 및 동물 복지위원회에 의해 승인되었습니다.
참고: 다음 프로토콜은 HEK293 세포에서 생산된 조건부 배지의 총 부피 500mL로부터 BDNFAvi를 정화하도록 설계되었습니다. BDNFAvi를 정화하기 위해 생산 및 처리되는 조건부 매체의 양은 필요에 따라 위 또는 축소될 수 있습니다. 그러나 이러한 상황에서는 추가 최적화가 필요할 수 있습니다. 프로토콜 전체에 사용되는 배양 매체 및 버퍼의 구성은 보충 재료에서 찾을 수 있습니다.
1. HEK293 컨디셔닝 된 미디어에서 BDNFAvi의 생산 및 정화
<ol><li>HEK293 세포의 트랜스페트<ol>
<li>HEK293 세포를 37 ºC에서 15cm 배양 요리로 보충DMEM 배지(소 태아 혈청 10%, 글루타민1배보충제, 항생제/항마이코틱)에서 70%로 성장시다.</li>
		<li>매체를 트랜스페션 버퍼로 변경합니다.</li>
		<li>FEI-DNA 혼합물을 대입용준비한다. DNA와 PEI 25 K를 희석하기 위해 각각 2개의 다른 15 mL 원추형 관을 사용합니다. 플라스미드 DNA 20μg을 한 튜브에 500 μL의 최종 부피로 희석시. 다른 튜브의 500 μL의 최종 부피에서 선형 PEI 25K의 60 μg를 희석시십시오. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>DNA 용액을 PEI 튜브에 조심스럽게 피펫하여 업다운 모션으로 한 번 혼합합니다. 실온에서 25분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>각 15cm 접시에 걸쳐 PEI DNA 혼합물의 1mL를 드립. 37 ºC에서 3 시간 동안 PEI DNA 혼합물로 세포를 배양합니다.</li>
		<li>매체를 신선한 인큐베이션 버퍼로 변경합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미디어 수집 및 저장<ol>
<li>HEK293 세포의 트랜스퍼전 후 48h의 모든 요리에서 배지를 수집한다. 보충 파일 1의 "상수 수정 버퍼"섹션에 설명 된 솔루션의 집중 된 주식을 준비하고 나열된 최종 농도를 달성하기 위해 HEK293 상체에 추가합니다. 참고: 추가 분석을 위해 셀을 폐기하거나 복구할 수 있습니다.</li>
		<li>15 분 동안 얼음에 매체를 배양.</li>
		<li>배지를 원심분리기 튜브로 알리쿼트합니다.</li>
		<li>심정분리기는 4°C 원심분리기에서 45분 동안 10,000 x g에서 배지를 분리합니다. 이 단계는 미디어에 매달린 세포 파편과 죽은 세포의 제거를 허용합니다.</li>
		<li>슈퍼네이트수집, 최종 농도0.1%로 BSA를 추가한다. 그런 다음 -20 °C에 보관하십시오. 정화 단계에서 더 빠른 해빙을 위해 동결하기 전에 미디어를 알리인용할 수 있습니다. 참고: 최대 2개월의 고정 된 조건 된 미디어의 저장 시간은 긍정적 인 결과를 산출했으며 저장 시간이 길어지지 않았습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>미디어 농도 및 정화<ol>
<li>37°C 열조절식에서 미디어를 해동한다.</li>
		<li>미디어를 원심분리기 튜브로 알리쿼트합니다.</li>
		<li>원심분리기는 4°C 냉각 원심분리기에서 3,500 x g에서 1h의 배지를 냉각시켰다. 이 단계를 사용하면 잔류 세포 이물질을 제거하여 크로마토그래피 컬럼을 통한 적절한 흐름을 보장할 수 있습니다.</li>
		<li>10kDa 컷오프로 단백질 농축기를 사용하여 미디어를 500mL에서 100mL로 줄입니다. 최적의 농도를 위해 제조업체에서 권장하는 원심분리 매개 변수를 따르십시오.</li>
		<li>500 μL의 Ni-NTA 아가로즈 구슬을 농축 된 미디어에 추가하고 로커에서 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.</li>
		<li>크로마토그래피 장치를 조립하고 미디어를 붓습니다. 5분 동안 휴식을 취한 다음 2방향 스톱콕을 열어 중간 이면에 흐르게 합니다.</li>
		<li>5mL의 워시 버퍼로 구슬을 5분 동안 세척하십시오. 2방향 스톱콕을 열어 세척 버퍼를 빼내십시오. 3번 반복합니다.</li>
		<li>열에 용출 버퍼 1mL을 추가합니다. 열의 구슬을 다시 일시 중지해야 합니다. 15분 동안 배양한 다음 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에서 용출을 수집합니다. BDNFAvi의 완전한 용출을 위해 이 단계를 3번 반복합니다.</li>
		<li>15% 폴리아크릴아미드 젤에 각 용출액의 5 μL 및 시판 가능한 BDNF(40-160 ng)의 다른 농도를 적재한다. 항-BDNF 항체를 사용하여 서양 블로팅에 의한 정제 된 단백질을 검출한다.</li>
		<li>시판되는 BDNF와 함께 제조된 농도 곡선을 사용하여 각 용출액에서 정제된 BDNFAvi의 농도를 결정한다.</li>
		<li>Aliquot 및 정제 된 BDNFAvi를 -80 °C에 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. BirA 효소를 사용하여 BDNFAvi의 체외 모노 바이오타이니션
<ol><li>
체외 모노 바이오타이니션 반응<ol>
<li>바이오타이니션 완충 시약의 농축 재고 솔루션을 준비합니다. 농축 된 주식의 사용은 재조합 단백질의 희석을 최소화할 것입니다.</li>
		<li>BDNFAvi의 800 ng의 알리쿼트를 취하고 BDNF에 1:1 어금니관계에서 생체자극완완화 시약및 효소 BirA를 추가한다. 예를 들어, 200 μL 최종 반응 부피 추가; BDNFAvi 800 ng, 20 μL Bicine 0.5 M pH 8.3, 20 μl ATP 100 mM, 20 μL MgOAc 100mM, 20 μL d-비오틴 500 μM, 0.8-1 μg ~ 1 μL 을 포함하는 용액의 100 μL은 1 μL 및 1 μL의 1 μL을 완료합니다. 참고: 성공적인 생체자극 반응은 약 30 ng/μL BDNFAvi의 농도를 포함하는 400 μL의 알리쿼트로 수행되어 최종 반응에서 ~20 ng/μL의 최종 농도로 균질적으로 생체화된 BDNFAvi를 초래한다.</li>
		<li>혼합물을 30°C에서 1시간 동안 혼성화 오븐에서 배양합니다.</li>
		<li>2.1.2 단계와 동일한 양의 ATP 및 BirA를 추가하고 2.1.3 단계를 반복합니다.</li>
		<li>향후 분석을 위해 -80°C에 보관하거나 즉시 사용할 수 있도록 얼음을 유지하십시오(예: 생체타이니화 품질 관리).</li>
	</ol>
</li>
	<li>바이오타이니션 분석<ol>
<li>블로킹 버퍼의 1mL에서 BDNF 샘플 당 스트렙타비딘 자기 비드의 30 μL을 차단합니다. 마이크로 센트심분리기 튜브 회전기에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>자기 분리 랙을 사용하여 3~5분 동안 또는 버퍼가 구슬을 완전히 지워버리고 차단 버퍼를 버릴 때까지 자기 구슬을 침전시합니다.</li>
		<li>50 μL의 신선한 블로킹 버퍼와 80 ng의 모노 바이오티니화 BDNFAvi(mbtBDNF) 샘플을 구슬에 추가하여 배피를 통해 완전히 재보습하십시오.</li>
		<li>약 20 RPM에서 회전하는 미세 원심분리기 튜브 회전기에서 4°C에서 1h에 대한 배양.</li>
		<li>자기 분리 랙을 사용하여 3~5분 동안 구슬을 수집하고, 분석을 위해 30μL 알리쿼트를 유지하면서 상퍼를 수집합니다.</li>
		<li>PBS의 500 μL로 구슬을 한 번 씻은 다음 자기 분리 랙을 사용하여 3~5분 동안 수집합니다. 상체를 복구하고 분석을 위해 30 μL 알리쿼트를 유지합니다.</li>
		<li>구슬에 4배 로딩 버퍼의 10 μL을 추가합니다.</li>
		<li>샘플을 7분 동안 97°C로 가열하여 mbtBDNF를 엘로트합니다.</li>
		<li>항-BDNF 특이적항체(19)를이용하여 mbtBDNF를 검출한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mbtBDNF 생물학적 활성 검증
<ol><li>서부 블롯에 의한 pTrkB 및 pERK 의 검출.<ol>
<li>60mm 배양 접시에 2백만 개의 쥐 피질 뉴런을 시드하십시오.</li>
		<li>7 일 동안 뉴런을 배양 (DIV7). 그런 다음 실험을 시작할 때 배지를 비보충 신경병으로 변경합니다.</li>
		<li>중간 변화 후 1 시간, 50 ng /mL의 최종 농도에 mbtBDNF를 추가합니다. 37 ºC에서 30 분 동안 배양하십시오. 음의 제어 접시(BDNF로 자극되지 않는)와 양수 제어 접시(50 ng/mL의 시판 가능한 BDNF로 처리)를 유지하십시오.</li>
		<li>중간 매체를 수집하고 부드럽게 1x PBS로 모든 접시를 씻어. 수집하고 1배 의 PBS를 폐기하십시오.</li>
		<li>접시를 얼음 위에 놓고 각 접시에 50-80 μL의 용해 버퍼를 추가합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 셀을 lyse합니다. 참고: 리시스 단계는 단백질 탈포실화 및 분해를 피하기 위해 가능한 한 빨리 수행해야 합니다. 격렬한 스크레이핑의 1-2 분은 서양 얼룩에 의해 관심있는 단백질을 시각화하기에 충분합니다.</li>
		<li>용해 버퍼를 수집하고 5 s의 최고 속도로 소용돌이 믹서를 저어.</li>
		<li>10분 동안 14,000 x g(4°C)에서 리시스 버퍼를 원심분리합니다. g</li>
		<li>BCA 단백질 정량화프로토콜(20)에의해 상피물의 단백질 함량을 정량화한다.</li>
		<li>조건당 단백질30-50 μg를 함유한 알리쿼트에 적재 버퍼를 추가하고 서부 블로팅을 위해 12% 폴리아크릴아미드 젤에 적재합니다. BDNFAvi 생물학적 활성을 확인하기 위해 특정 인-항체를 사용하여 pTrkB 및 pERK를 검출합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>pCREB 면역 형광에 의한 BDNF-QD 생물학적 활성의 검증.<ol>
<li>씨앗 40,000 랫트 피질 뉴런 10 mm 커버립, 이전에 자동 적으로 및 이전에 설명 된 대로 폴리 L-리신으로 처리21.</li>
		<li>37 ºC에서 뉴런 유지 보수 버퍼 (보충 재료 참조)에서 7-8 일 동안 뉴런을 배양합니다.</li>
		<li>실험을 시작하려면 배지를 보충되지 않은 신경 물질 매체로 변경하고 37 ºC에서 1 h로 배양합니다.</li>
		<li>mbtBDNF를 양자점(BDNF-QD)에 결합하여 mbtBDNF 알리쿼트, 필요한 퀀텀닷 스트렙타비딘 컨쥬게이트(streptavidin-QD)를 추가하여 1:1 BDNF-QD 어이어 비율을 달성하도록 준비한다. 그런 다음 신경 물질 배지로 20 μL로 희석하십시오. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸서 빛으로부터 보호합니다. 참고: 동일한 양의 퀀텀닷 스트렙타비딘 공주체로 다른 튜브를 준비하고 음의 대조군으로서 신경물질 배지로 20 μL로 희석합니다.</li>
		<li>mbtBDNF/ 스트렙타비딘-QD 혼합물을 로커의 실온에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>BDNF-QD를 신경유배지에서 원하는 최종 농도(200pM 및 2nM)로 희석한다.</li>
		<li>비보충 신경물질 배지로 1시간 의 인큐베이션 후, BDNF-QD 또는 스트렙타비딘-QD(대조군)로 뉴런을 37°C에서 30분 동안 200pM 및 BDNF 2nM의 최종 농도로 자극한다.</li>
		<li>커버립을 1x PBS(37°C)로 3회 세척하고, 포스파타아제 억제제를 함유한 4% 파라포름알데히드 용액으로 커버슬립을 처리하여 15분 동안 세포를 고정한다.</li>
		<li>PBS로 세포를 3회 세척한 다음 블로킹/투과화 버퍼(BSA 5%, Triton X-100 0.5%, 1x 포스파타제 억제제)로 1h로 배양한다.</li>
		<li>항 pCREB 항체 1:500 (3 % BSA, 0.1 % 트리톤 X-100)을 4 ° C에서 하룻밤 동안 배양합니다.</li>
		<li>다음 날, 1x PBS로 3회 세척하고, 이차 항체 1:500(3% BSA, 0.1% 트리톤 X-100)으로 1시간 동안 배양한다.</li>
		<li>1x PBS로 3회 세척합니다. Hoechst 핵 얼룩 용액 (5 μg /mL)을 7 분 동안 추가합니다.</li>
		<li>1x PBS로 3회 세척하고 마운트합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>살아있는 뉴런에서 BDNF-QD의 역행 축축운송 의 시각화<ol>
<li>이전에 설명된 바와 같이 미세유체 챔버및 종자 뉴런을준비한다 16.</li>
		<li>문화에서 7-8 일 후, 비 보충 신경 물질 매체로 매체를 변경합니다.</li>
		<li>mbtBDNF를 양자점(BDNF-QD)에 결합하여 mbtBDNF 알리쿼트, 필요한 퀀텀닷 스트렙타비딘 컨쥬게이트(streptavidin-QD)를 추가하여 1:1 BDNF-QD 어이어 비율을 달성하도록 준비한다. 그런 다음 신경 물질 배지로 20 μL로 희석하십시오. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸서 빛으로부터 보호합니다. 참고: 동일한 양의 퀀텀닷 스트렙타비딘 공주게이트로 다른 튜브를 준비하고 신경물질 배지를 대조군으로 20 μL로 희석시다.</li>
		<li>mbtBDNF/ 스트렙타비딘-QD 혼합물을 로커의 실온에서 30분 동안 배양합니다.</li>
		<li>BDNF-QD를 원하는 최종 농도(2nM)로 희석합니다.</li>
		<li>비보충 신경물질 배지를 가진 1h의 배양 후 BDNF-QD 또는 대조군 혼합물을 미세유체 챔버의 축축 구획에 첨가한다. BDNF-QD의 순 역행 수송을 보장하기 위해 37 °C에서 210 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>라이브 셀 이미징의 경우, 이러한 목적(37°C 및 5% CO2)에 적합한 현미경을 사용하여 100배 의 목표를 사용하여 세포 체납구에 근접하는 마이크로그루브 세그먼트에서 축소 역행 수송을 시각화한다. 1 프레임/s에서 이미지를 수집합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Huang, E., Reichardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins%3A+Roles+in+Neuronal+Development+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins: Roles in Neuronal Development and Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 24, 677-736 (2001).</li>
<li>Skaper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotrophin+family+of+neurotrophic+factors%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mollecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The neurotrophin family of neurotrophic factors: an overview.</a> Methods in Mollecular Biology. 846, 1-12 (2012).</li>
<li>Gonzalez, A., Moya-Alvarado, G., Gonzalez-Billault, C., Bronfman, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanism+regulating+neuronal+growth+by+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanism regulating neuronal growth by brain-derived neurotrophic factor.</a> Cytoskeleton. 73 (10), 612-628 (2016).</li>
<li>Cunha, C., Brambilla, R., Thomas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+role+for+BDNF+in+learning+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Mollecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A simple role for BDNF in learning and memory.</a> Frontiers in Mollecular Neuroscience. 3, 1(2010).</li>
<li>Bronfman, F. C., Lazo, O. M., Flores, C., Escudero, C. A. Spatiotemporal intracelular dynamics of neurotrophin and its receptors. Implications for neurotrophin signaling and neuronal function. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBronfman%2C+FC+%22Neurotrophic+Factor.+Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22">Neurotrophic Factor. Handbook of Experimental Pharmacology</a>. Lewin, G., Carter, B. 220, Springer. Berlin, Heidelberg. (2014).</li>
<li>Ascano, M., Bodmer, D., Kuruvilla, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+trafficking+of+neurotrophins+in+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Endocytic trafficking of neurotrophins in neural development.</a> Trends in Cell Biology. 22 (5), 266-273 (2012).</li>
<li>Deinhardt, K., Salinas, S., Verastegui, C., Watson, R., Worth, D., Hanrahan, S., Bucci, C., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab5+and+Rab7+control+endocytic+sorting+along+the+axonal+retrograde+transport+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rab5 and Rab7 control endocytic sorting along the axonal retrograde transport pathway.</a> Neuron. 52 (2), 293(2006).</li>
<li>Escudero, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Jun+N-terminal+kinase+%28JNK%29-dependent+internalization+and+Rab5-dependent+endocytic+sorting+medaited+long-distance+retrograde+neuronal+death+induced+by+axonal+BDNF-p75+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">c-Jun N-terminal kinase (JNK)-dependent internalization and Rab5-dependent endocytic sorting medaited long-distance retrograde neuronal death induced by axonal BDNF-p75 signaling.</a> Scientific Reports. 9, 6070(2019).</li>
<li>Vrabec, J. P., Levin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of cell death in glaucoma.</a> Eye. 21, Suppl 1 11-14 (2007).</li>
<li>Liot, G., Zala, D., Pla, P., Mottet, G., Piel, M., Saudou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+huntingtin+alters+retrograde+transport+of+TrkB+receptors+in+striatal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutant huntingtin alters retrograde transport of TrkB receptors in striatal dendrites.</a> Journal of Neuroscience. 33 (15), 6298-6309 (2013).</li>
<li>Zhou, B., Cai, Q., Xie, Y., Sheng, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snapin+recruits+dynein+to+BDNF-TrkB+signaling+endosomes+for+retrograde+axonal+transport+and+is+essential+for+dendrite+growth+of+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Snapin recruits dynein to BDNF-TrkB signaling endosomes for retrograde axonal transport and is essential for dendrite growth of cortical neurons.</a> Cell Reports. 2 (1), 42-51 (2012).</li>
<li>Haubensak, W., Narz, F., Heumann, R., Lessmann, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BDNF-GFP+containing+secretory+granules+are+localized+in+the+vicinity+of+synaptic+junctions+of+cultured+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">BDNF-GFP containing secretory granules are localized in the vicinity of synaptic junctions of cultured cortical neurons.</a> Journal of Cell Science. 111 (11), 1483-1493 (1998).</li>
<li>Adachi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucocorticoid+affects+dendritic+transport+of+BDNF-containing+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Glucocorticoid affects dendritic transport of BDNF-containing vesicles.</a> Scientific Reports. 5, 12684(2015).</li>
<li>Biocompare: The Buyer's Guide for Life Scientists. Mirus Bio. Cellular Toxicity Caused by Transfection: Why is it important. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/">https://www.biocompare.com/Bench-Tips/121111-Cellular-Toxicity-Caused-by-Transfection-Why-is-it-important/</a> (2012).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+underlying+activity-dependent+insertion+of+TrkB+into+the+neuronal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanism underlying activity-dependent insertion of TrkB into the neuronal surface.</a> Journal of Cell Science. 122 (17), 3123-3136 (2009).</li>
<li>Zhao, X., Zhou, Y., Weissmiller, A., Pearn, M., Mobley, W., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+axonal+transport+of+quantum+dot-labeled+BDNF+in+primary+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled BDNF in primary neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. 91, 51899(2014).</li>
<li>Sung, K., Maloney, M., Yang, J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+producing+mono-biotinylated%2C+biologically+active+neurotrophic+factors%3A+an+essential+reagent+for+single+molecule+study+of+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport.</a> Journal of Neuroscience Methods. 200 (2), 121-128 (2011).</li>
<li>Deerinck, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+fluorescent+quantum+dots+to+confocal%2C+multiphoton+and+electron+microscopic+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">The application of fluorescent quantum dots to confocal, multiphoton and electron microscopic imaging.</a> Toxicologic Pathology. 36 (1), 112-116 (2008).</li>
<li>Unsain, N., Nuñez, N., Anastasia, A., Mascó, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+epilepticus+induces+a+TrkB+to+p75+neurotrophin+receptor+switch+and+increases+brain-derived+neurotrophic+factor+interaction+with+p75+neurotrophon+receptor%3A+an+initial+event+in+neuronal+injury+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Status epilepticus induces a TrkB to p75 neurotrophin receptor switch and increases brain-derived neurotrophic factor interaction with p75 neurotrophon receptor: an initial event in neuronal injury induction.</a> Neuroscience. 154 (3), 978-993 (2008).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bicinchoninic+acid+%28BCA%29+assay+for+protein+quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation.</a> Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).</li>
<li>Moya-Alvarado, G., Gonzalez, A., Stuardo, N., Bronfman, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+%28BDNF%29+regulates+Rab5-positive+early+endosomes+in+hippocampal+neurons+to+induce+dendritic+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) regulates Rab5-positive early endosomes in hippocampal neurons to induce dendritic branching.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 493(2018).</li>
<li>Sasi, M., Vignoli, B., Canossa, M., Blum, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurobiology+of+local+and+intercellular+BDNF+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Neurobiology of local and intercellular BDNF signaling.</a> Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 469 (5), 593-610 (2017).</li>
<li>Gonzalez, A., Lazo, O. M., Bronfman, F. C. The Rab5-Rab11 endosomal pathway is required for BDNF-induced CREB transcriptional regulation in neurons. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1">https://www.biorxiv.org/content/10.1101/844720v1</a> (2019).</li>
<li>Mowla,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+post-translational+processing+of+the+precursor+to+brain-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (16), 12660-12666 (2001).</li>
<li>Longo, P., Kavran, J., Kim, M. S., Leahy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+Mammalian+Cell+Transfection+with+Polyethyleneimine+%28PEI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transient Mammalian Cell Transfection with Polyethyleneimine (PEI).</a> Methods in Enzymology. 529, 227-240 (2013).</li>
<li>Raymond, C., Tom, R., Perret, S., Moussouami, P., L'Abbé, D., St-Laurent, G., Durocher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+polyethyleneimine-mediated+transfection+process+for+large-scale+and+high-throughput+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A simplified polyethyleneimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications.</a> Methods. 55 (1), 44-51 (2011).</li>
<li>Dalton, A., Barton, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-expression+of+secreted+proteins+from+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Over-expression of secreted proteins from mammalian cell lines.</a> Protein Science. 23 (5), 517-525 (2014).</li>
<li>Hunter, M., Yuan, P., Vavilala, D., Fox, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protein+expression+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Optimization of protein expression in mammalian cells.</a> Current Protocols in Protein Science. 95 (1), 77(2019).</li>
<li>Stepanenko, A. A., Heng, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+and+stable+vector+transfection%3A+Pitfalls%2C+off-target+effects%2C+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Transient and stable vector transfection: Pitfalls, off-target effects, artifacts.</a> Mutation Research. 773, 91-103 (2017).</li>
<li>Guerzoni, L. P., Nicolas, V., Angelova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modulation+of+TrkB+receptor+signaling+upon+sequential+delivery+of+curcumin-DHA+loaded+carriers+towards+promoting+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">In vitro modulation of TrkB receptor signaling upon sequential delivery of curcumin-DHA loaded carriers towards promoting neuronal survival.</a> Pharmaceutical Research. 34 (2), 492-505 (2017).</li>
<li>Angelova, A., Angelov, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+and+multi-drug+delivery+nanoparticles+towards+neuronal+survival+and+synaptic+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Dual and multi-drug delivery nanoparticles towards neuronal survival and synaptic repair.</a> Neural Regeneration Research. 12 (6), 886-889 (2017).</li>
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본 문서에서는, 친화도 크로마토그래피 기반 절차에서 mbtBDNF의 생산 및 정화를 위한 최적화된 방법론이 기술되고, 성 및협력자(17)의작업을 기반으로 한다. 최적화는 리포펙타민과 같은 더 비싼 형질 전환 방법의 효율성을 유지하면서 비용 효율적인 트랜스페트 시약 (PEI)의 사용을 포함한다. 이러한 최적화는 프로토콜의 상당한 비용 절감으로 이어지며 높은 비용 효율성을 유지하면서 확장성을 제공합니다. 또한 이 프로토콜에는 최대 2개월 동안 조건부 용지를 동결하는 등 사용 편의성 고려 사항이 포함되어 있습니다. 이러한 최적화는 각 실험실의 요구에 맞게 절차를 조정하고, 비용 효율성을 개선하며, 균일하고 생물학적으로 활동적인 재조합 BDNF를 산출합니다. 프로토콜은 또한 크로마토그래피 장치의 사용을 원추형 튜브내구슬의 중력 강수량으로 대체함으로써 소규모 생산에 적응할 수 있다. 이는 실행 가능한 방법론을 구성하지만 시간이 덜 효율적이며 경험에서 수익률이 낮아졌습니다. 비오틴 라벨BDNF는 ...

뉴런은 시냅스 통신을 허용하는 복잡하고 전문적인 형태를 소유하는 신경계의 기능 단위이며, 따라서 다양한 자극에 대응하여 조정되고 복잡한 행동의 생성이다. 점선 및 축삭과 같은 신경 투영은 신경 통신에 관여하는 중요한 구조적 특징이며, neurotrophins는 그들의 형태와 기능1을결정하는 결정적인 선수입니다. Neurotrophins는 NGF, NT-3, NT-4 및 두뇌 유래 신경 영양인자 (BDNF)2를포함하는 분비성장 인자의 가족입니다. 중추신경계(CNS)에서 BDNF는 신경전달, 수지상 식소, 수지상 척추의 성숙, 장기 전능성 등 다양한 생물학적 과정에 참여한다3,,4. 따라서, BDNF는 신경 기능을 조절에 중요한 역할을 한다.
다양한 세포 프로세스는 BDNF 역학 및 기능을 조절합니다. 신경 표면에, BDNF는 tropomyosin 수용체 키나아제 B (TrkB) 및/또는 p75 neurotrophin 수용체 (p75)를 결합합니다. BDNF-TrkB 및 BDNF-p75 복합체는 내분비소로 분류되어 다른 내세포 세포기관5,,6,,7,,8에서분류된다. BDNF/TrkB 복합체의 정확한 세포내 인신 매매는 다른 뉴런회로9,,10,,11에서적절한 BDNF 신호에 필요합니다. 이러한 이유로, BDNF 인신 매매 역학의 깊은 이해와 병리학 적 과정에서 발견 되는 그것의 변경 은 건강 및 질병에 BDNF 신호를 이해 하는 데 필수적이다. 이 과정을 모니터링하는 신규 및 특정 분자 도구의 개발은이 분야를 앞으로 추진하고 관련된 규제 메커니즘을 더 잘 파악하는 데 도움이 될 것입니다.
뉴런에서 BDNF 인신 매매의 연구에 사용할 수있는 몇 가지 도구가 있습니다. 일반적으로 사용되는 방법론은 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 GFP mCherry12,13의단황 형광 적변 변이체와 같은 형광 분자로 태그된 재조합 BDNF의전환과관련이 있다. 그러나, BDNF 과발현의 주요 단점은 이 neurotrophin의 알려진된 농도를 전달의 가능성을 제거 한다는 것입니다. 또한, 세포 독성이 발생할 수 있으며,결과(14)의해석을 모호하게 할 수 있다. 대체 전략은 플래그-TrkB와 같은 에피토프 태그가 지정된 TrkB의 전환입니다. 이 방법론은 TrkB 내재화 역학 의 연구를 허용15,하지만 그것은 또한 트랜스페션을 포함, 변경 된 TrkB 기능 및 세포 독성귀착될 수 있습니다. 이러한 방법론적 장애물을 극복하기 위해, 비틴-리게아제 효소 BirA에 의해 모노 바이오티닝될 수 있는 Avi 서열(BDNFAvi)을 함유하는 NGF 및 BDNF의 재조합 변이체가16,,17로개발되었다. 바이오타이니드 재조합 BDNF는 형광, 구슬, 파라자성 나노 입자를 포함하는 다른 스트렙타비딘 바운드 도구에 결합될 수 있다. 살아있는 세포 이미징의 관점에서, 양자점(QD)은 소분자형광호(18)에비해 광표백에 대한 밝기 및 저항증가와 같은 단일 입자 추적에 바람직한 특성을 가지므로 자주 사용되는 형광이 되고 있다.
BDNFAvi를 이용한 모노바이오티니얼BDNF(mbtBDNF)의 생산은 BDNFAvi와 BirA의 발현을 구동하는 플라스미드의 공동 변환에 의해 달성되었으며, 그 다음으로 20m2의 BDNF 의 수율1-2μg의 수율로 합산 단백질의 정제를달성하였다. 여기서는 조작의 용이성을 위해 크로마토그래피 컬럼 기반 프로토콜에서 단백질 회복을 극대화하고자 하는 HEK293 컨디셔닝 된 미디어의 500mL에서 BDNFAvi 정화를 허용하는 이 프로토콜의 수정을 제안합니다. 사용된 경피제인 폴리에틸렌네이민(PEI)은 경질 수율을 희생하지 않으면서 비용 효율적인 방법을 보장합니다. 모노 바이오타이니션 단계는 공동 트랜스페션과 관련된 합병증을 피하고 BDNF의 균일한 라벨링을 보장하기 위해 체외 반응에 적응되었습니다. mbtBDNF의 생물학적 활성은 마이크로 유체 챔버에서 BDNF의 역행 축축산 수송을 연구하기 위해 pCREB 및 라이브 세포 이미징의 활성화를 포함하여 서양 블롯 및 형광 현미경 실험에 의해 입증되었다. 이 프로토콜을 사용하면 균일한 모노 바이오티니화 및 생물학적 활성 BDNF의 최적화된 고수량 생산을 허용합니다.

<table><tbody><tr><td>2 방향 스톱콕</td><td>BioRad</td><td>7328102</td><td>크로마토 그래피 장치 구성 요소</td></tr><tr><td>2- 메르 캅토 에탄올</td><td>시그마</td><td>M6250</td><td>BDNF 용출 완충액</td></tr><tr><td>아크릴 아미드 / 비사 크릴 아미드</td><td>BioRad 1610154</td><td></td><td>SDS-PAGE 겔 준비</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 10K</td><td>Millipore</td><td>UFC901024</td><td>BDNF 농도</td></tr><tr><td>암모늄 퍼 설페이트</td><td>시그마</td><td>A9164</td><td>SDS-PAGE 겔 제제</td></tr><tr><td>안티 B-III-Tubulin 항체</td><td>시그마</td><td>T8578</td><td>BDNF 생물 활성 검출 용 웨스턴 블롯 분석</td></tr><tr><td>안티 BDNF 항체</td><td>Alomone</td><td>AGP-021</td><td>BDNF 정량화를위한 웨스턴 블롯 분석</td></tr><tr><td>안티 BDNF 항체</td><td>Alomone</td><td>ANT-010</td><td>BDNF 정량화를위한 웨스턴 블롯 분석</td></tr><tr><td>안티 ERK 항체</td><td>세포 신호</td><td>9102</td><td>BDNF 생체 활성 검출을 위한 웨스턴 블롯 분석</td></tr><tr><td>안티 pCREB 항체 (S133)</td><td>세포 신호</td><td>9198</td><td>BDNF 생물학적 활성 검출을 위한 웨스턴 블롯 분석</td></tr><tr><td>안티 pERK 항체 (T202, Y204)</td><td>세포 신호</td><td>4370</td><td>BDNF 생물 활성 검출 안티 pTrkB 항체를 위한 웨스턴 블롯 분석</td></tr><tr><td>(Y515)</td><td>Abcam</td><td>ab109684</td><td>BDNF 생물학적 활성 검출을 위한 웨스턴 블롯 분석</td></tr><tr><td>항생제/항진균제</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>HEK293 유지 관리</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A26209</td><td>BDNF 모노비오틴화 완충액</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>뉴런 유지 Bicine</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>B3876</td><td>BDNF 모노비오틴화 완충액</td></tr><tr><td>BirA-GST</td><td>BPS Bioscience</td><td>70031</td><td>BDNF AviTag 모노비오틴화</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>HyClone</td><td>HC용 효소. SH30396.02</td><td>HEK293 유지 관리</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>001-000-162</td><td>BDNF 완충액 변형 성분, 웨스턴 블롯 및 면역 형광에 대한 차단 완충액</td></tr><tr><td>D-Biotin</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td>BDNF 모노비오틴화 완충액</td></tr><tr><td>DMEM High Glucose Medium</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Neuron seeding</td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>11995-081</td><td>HEK293 유지보수</td></tr><tr><td>Econo Column Funnel</td><td>BioRad</td><td>7310003</td><td>크로마토그래피 장치 구성 요소</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>108418</td><td></td></tr><tr><td>EZ-ECL Kit</td><td>Biological Industries</td><td>1633664</td><td>Western blotting에 의한 단백질 검출</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Neuron 및 HEK293 유지보수</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Merck</td><td>104094</td><td>BDNF 용출 완충액, 웨스턴 블롯 분석용 용해 완충액</td></tr><tr><td>Hettich Rotina 46R 원심분리기</td><td>Hettich</td><td>단종</td><td>파편 매체 제거에 사용되는 원심분리기</td></tr><tr><td>Hettich Universal 32R 원심분리기</td><td>Hettich</td><td>단종</td><td>원심분리기 단백질 농축기 원심분리에 사용되는 단</td>종</tr> 원심분리기 <tr><td>Horse Serum</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Neuron seeding</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 500</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29005063</td><td>웨스턴 블롯 이미지 획득</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma</td><td>I55513</td><td>BDNF 버퍼 변형 구성 요소</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Winkler</td><td>BM-1370</td><td>PBS 구성 요소</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>104873</td><td>PBS 구성 요소</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td>구획화된 뉴런용 커버 코팅</td></tr><tr><td>Luer Tubing Adaptor</td><td>BioRad</td><td>7323245</td><td>크로마토그래피 장치 구성 요소</td></tr><tr><td>Luminata&trade; Forte Western HRP Substrate</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0100</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Mg(CH3COO)2</td><td>Merck</td><td>105819</td><td>BDNF monobiotinylation buffer</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Calbiochem</td><td>475904</td><td>면역형광 분석용 마운팅 시약</td></tr><tr><td>MyOne C1 Streptavidin Magnetic Beads</td><td>Invitrogen</td><td>65001</td><td>비오틴화(Biotinylation) 검증</td></tr><tr><td>Na2HPO4<</td><td>/sub>Merck</td><td>106586</td><td>BDNF 완충액 변형 성분</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Winkler</td><td>BM-1630</td><td>PBS 성분, BDNF 완충액 변형 성분</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Merck</td><td>106346</td><td>BDNF 완충액 변형 성분</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>뉴런 유지 보수</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose Beads</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>BDNF AviTag 정제</td></tr><tr><td>Nikon Ti2-E</td><td>형광 이미징용</td><td>Nikon</td><td></td> 현미경</tr><tr><td>니트로셀룰로오스 멤브레인</td><td>BioRad</td><td>1620115</td><td>웨스턴 블로팅용 단백질 전달</td></tr><tr><td>ORCA-Flash4.0 V3 디지털 CMOS 카메라</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td>epifluorescence imaging 용 카메라</td></tr><tr><td>P8340 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>시그마</td><td>P8340</td><td>BDNF 완충액 변형 구성</td></tr><tr><td>요소 파라 포름 알데히드</td><td>Merck</td><td>104005</td><td>면역 형광 분석 용 고정제</td></tr><tr><td>Penicillin / Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Neuron maintenance</td></tr><tr><td>Poli-D-Lysine</td><td>Corning</td><td>DLW354210</td><td>Cover coating 구획화된 뉴런용</td></tr><tr><td>Poli-L-Lysine</td><td>Millipore</td><td>P2363</td><td>비구획화된 뉴런용 커버 코팅</td></tr><tr><td>Poly-Prep 크로마토그래피 컬럼</td><td>BioRad</td><td>7311550</td><td>크로마토그래피 장치 구성 요소</td></tr>: <tr><td>Polyethyleneimine 25K</td><td>Polysciences Inc.</td><td>PLY-0296</td><td>HEK293 트랜스펙션</td></tr><tr><td>양자 점 655 스트렙타비딘 접합체</td><td>Invitrogen</td><td>Q10121MP</td><td>생체 및 고정 세포 실험용 모노비오틴화 BDNF AviTag 라벨</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>S4521</td><td>면역형광 분석용 세제</td>Syldgard</tr><tr><td>184 실리콘 엘라스토머 베이스</td><td>Poirot</td><td>4019862</td><td>미세유체 챔버 준비</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td>SDS-PAGE 겔 제제</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Winkler</td><td>BM-2000</td><td>용해 완충액 성분</td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Merck</td><td>108603</td><td>면역형광 및 웨스턴 블롯 분석에서 세포 투과화</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.5%</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>HEK293 계승</td></tr></tbody></table>

뉴런의 세포 인신 매매 연구를 위한 튜브에서 정제하고 직접 모노 바이오티니레이트 bdnf를 정화하는 향상된 프로토콜

An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons

Avi 서열을 포함하는 재조합 BDNF(BDNFAvi)는 HEK293 세포에서 생산된 다음 친화 성염색체에 의해 비용 효율적으로 정제된다. 재현 가능한 프로토콜은 튜브에 효소 BirA와 직접 모노 바이오티니레이트 BDNFAvi를 개발하였다. 이 반응에서, 모노 바이오티니화 BDNFAvi는 그것의 생물학 활동을 유지합니다.
Neurotrophins는 신경 발달 및 유지 보수에 있는 역할을 하는 표적 유래 성장 인자입니다. 그(것)들은 다른 신경 구획 사이 장거리 신호화를 허용하기 위하여 내분비 통로를 따라 급속한 수송 기계장치가 필요합니다. neurotrophins의 인신 매매를 연구하는 분자 공구의 발달은 생체 내 기록을 사용하여 세포에 있는 이 단백질의 정확한 추적을 가능하게 했습니다. 이 프로토콜에서는 모노 바이오타이니드 BDNF 생산을 위한 최적화되고 비용 효율적인 절차를 개발했습니다. 생체개능 avi 서열(BDNFAvi)을 함유한 재조합 BDNF 변종은 마이크로그램 범위의 HEK293 세포에서 생산된 다음 친화성 크로마토그래피를 사용하여 쉽게 확장 가능한 절차로 정제된다. 정제된 BDNF는 튜브내 효소 BirA와의 직접 체외 반응에 의해 균일하게 모노 바이오티니화될 수 있다. 모노 바이오타이니드 BDNF(mbtBDNF)의 생물학적 활성은 상이한 형광에 대한 연쇄상 구각에 공인될 수 있다. BDNFAvi 및 mbtBDNF는 각각 서부 얼룩을 사용하여 하류 인광 표적의 검출및 전사 인자 CREB의 활성화를 통해 입증된 생물학적 활성을 유지한다. 스트렙타비딘 양자점을 사용하여, 우리는 인계 CREB 특정 항체로 검출된 CREB의 활성화와 수반되는 mbtBDNF 내재화를 시각화할 수 있었습니다. 또한, mbtBDNF는 연쇄상 구균-양자점에 공주하여 미세유체 챔버에서 자란 피질 뉴런의 역행 운송 분석에 적합했다. 따라서, 튜브에서 생성된 mbtBDNF는 뉴런에서 생리적 신호 내역및 인신매매를 연구하는 신뢰할 수 있는 도구이다.

크로마토그래피 컬럼 기반 프로토콜을 사용하면 상당한 양의 HEK293 조건부 미디어를 처리할 수 있습니다. 도 1에서,조건부 미디어의 500mL로부터 BDNFAvi의 정제 결과를 도시한다. Ni-NTA 아가로즈 구슬로부터 BDNFAvi의 연속 출례는 BDNFAvi의 농도감소(도 1A)를산출한다. 4회 연속 출루(각 15분 간) 구슬에 의해 포착된 BDNF의 대부분이 회복됩니다. 용출물의 농도는 6 내지 28 ng/μL범위이며, 총 수율은 BDNFAvi(표1)의약 60μg에 달한다. 생성된 BDNFAvi는 그 때 비생물화BDNFAvi의 부재에 의해 입증된 바와 같이 BirA-GST에 의해 중재된 체외 반응에 의해 효율적으로 생체화되었다(도1B). 도 1B에 제시된 생체세니클...

Avi 서열을 포함하는 재조합 BDNF(BDNFAvi)는 HEK293 세포에서 비용 효율적인 방식으로 생산되며 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. BDNFavi는 튜브에 효소 BirA와 직접 모노 바이오티니화된다. BDNFavi 및 모노 바이오타이니드 BDNFavi는 시판되는 BDNF와 비교하여 생물학적 활성을 유지합니다.

뉴런의 세포 인신 매매 연구를 위한 튜브에서 정제하고 직접 모노 바이오티니레이트 BDNF를 정화하는 향상된 프로토콜

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells and then cost-effectively purified by affinity chromatography. A ...

이 절차의 전반적인 목표는 HEK293 세포의 트랜스퍼와 크로마토그래피 컬럼의 정화와 관련된 최적화된 프로토콜에서 BDNF oviduct를 생산하고 정화하는 것입니다. BDNF oviduct는 그 때 형광 현미경 검사법에 의하여 후방 표지 및 검출을 위한 체외 반응에 의해 mono-biotinylated됩니다. 이 절차의 주요 장점은 최적화된 방식으로 BDNF의 생산, 정제 및 모노 바이오타이니션을 허용한다는 것입니다.임신 매개 변수는 비용 효율적인 트랜스페트 시약을 사용하여 최대 BDNF 생산에 최적화되었으며, 정제 공정은 조작을 용이하게 하고 절차를 확대할 수 있는 크로마토그래피 설정에서 수행된다. 비보충 DMEM의 500 마이크로리터와 15센티미터 당 보충되지 않은 DMEM의 500 마이크로리터에서 20 마이크로그램의 폴리에틸렌닌 60 마이크로그램을 희석하여 시작합니다. 실온에서 5분 동안 배양한 다음 DNA 용액을 폴리에틸렌광 튜브로 조심스럽게 피펫하여 위아래로 움직이면 한 번 섞습니다.실온에서 25분 동안 배양한 다음 각 15센티미터 접시에 PEI/DNA 혼합물1밀리리터를 드립합니다. PEI/DNA 혼합물로 세포를 3시간 동안 배양한 다음 배지를 인큐베이션 버퍼로 변경합니다. 세포의 전환 후 48 시간, 모든 접시에서 매체를 수집합니다.그런 다음 염화나트륨, 인산염 완충 성분, 이미다졸 및 프로테아제 억제제를 포함한 HEK293 상퍼나탄에 BDNF 배지 성분을 첨가한다. 15분 동안 얼음으로 배양하세요. 그런 다음 배지를 원심분리기 튜브로 알리쿼트합니다.원심분리기는 섭씨 10, 000g에서 45분간 4도의 금 원심분리기. 이 단계는 매체에 매달린 세포 파편과 죽은 세포의 제거를 허용합니다. 그런 다음 초월체를 수집합니다.BSA를 0.1%의 최종 농도로 추가하고 최대 2개월 동안 섭씨 영하 20도에 보관하십시오. BDNF를 정화하려면 37도 의 온도 조절 된 욕조에서 미디어를 해동하십시오. 그런 다음 미디어를 원심분리기 튜브로 알리쿼트합니다.원심분리기는 섭씨 3도, 500g에서 1시간 동안 4도 의 금 원심분리기. 이 단계를 통해 남은 파편을 제거하여 크로마토그래피 컬럼을 통과하는 적절한 흐름을 보장할 수 있습니다. 그런 다음 단백질 농축기를 사용하여 미디어를 500 밀리리터에서 100 밀리리터로 줄입니다.최적의 농도를 위해 제조업체에서 권장하는 원심분리 매개 변수를 따르십시오. 그런 다음 500 마이크로리터의 니켈-NTA 아가로즈 구슬을 농축 된 미디어에 추가하고 섭씨 4도의 로커에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 크로마토그래피 장치를 조립하고 미디어를 부어 넣습니다.5 분 동안 휴식을 취한 다음 양방향 스톱 콕을 열어 중간 이쪽으로 흐르게하십시오. 5 밀리리터의 워시 버퍼로 5분간 세척하여 열의 구슬을 다시 보재하십시오. 세 번 반복합니다.마지막으로 열에 용출 버퍼 1밀리리터를 추가하여 구슬을 다시 일시 중지합니다. 15분 동안 배양한 다음 마이크로센심분리기 튜브에서 용액을 수집합니다. BDNF의 완전한 용출을 위해 이 단계를 세 번 반복합니다.BDNF를 생체화하기 위해 단백질 800 나노그램을 함유한 알리쿼트(aliquot)를 복용하고 생체자극완약 시약을 추가한 다음 BDNF와의 일대일 어금니언 관계에서 BirA-GST를 추가합니다. 혼성화 오븐에서 60분간 30도의 혼합 오븐에서 인큐베이션하여 15분마다 튜브의 내용이 반전으로 혼합됩니다. 그런 다음 첫 번째 단계에서와 동일한 양의 ATP 및 BirA-GST를 추가하고 60 분 동안 배양하여 15 분마다 튜브의 내용을 혼합합니다.생체 화 BDNF는 즉각적인 생체 자극 확인을 위해 얼음에 남아 있거나 후방 분석을 위해 영하 80도에 보관될 수 있습니다. BDNF oviduct의 생체 자극을 확인하려면 블로킹 버퍼에서 BDNF 샘플 당 스트렙타비딘 자기 비드 30 마이크로리터를 차단하는 것으로 시작합니다. 실온에서 1시간 동안 배양한 다음 마그네틱 랙 분리기에서 마그네틱 구슬을 침전한 다음 차단 버퍼를 폐기합니다.50마이크로리터의 신선한 블로킹 버퍼와 BDNF 샘플을 구슬에 추가하여 완전히 다시 중단합니다. 튜브의 내용을 균질화하고 마이크로 센드심분리기 튜브 회전기에서 1 시간 동안 섭씨 4도에서 배양하십시오. 생체 자극 반응의 효율을 평가하기 위해 텍스트에 설명된 바와 같이 서부 블로팅샘플을 준비한다.BDNF oviducts를 퀀텀닷에 수렴하려면 BDNF에 일대일 어금니관계를 달성한 다음 최종 20마이크로리터로 희석하기 위해 필요한 퀀텀닷 부피를 추가하는 것으로 시작합니다. 튜브의 내용체를 균질화한 다음 알루미늄 호일로 감싸빛으로부터 보호합니다. 로커에서 실온에서 30분 동안 배양하십시오.그런 다음 BDNF oviduct를 원하는 최종 농도로 희석시키고 미세 유체 챔버의 축산구에 추가하여 후방 라이브 또는 고정 된 세포 이미징을 위해 210 분 동안 배양합니다. 크로마토그래피 컬럼 기반 프로토콜을 사용하면 상당한 양의 HEK293 조건부 미디어를 처리할 수 있습니다. 이 실험에서는 BDNF oviduct를 정화하기 위해 500 밀리리터의 조건부 미디어가 처리되었습니다.4연속 은출은 각각 15분 동안 지속되는 것으로, 마이크로리터당 6~28나노그램에 이르는 BDNF oviduct의 농도가 감소했습니다. 총 수율은 BDNF oviduct의 약 60 마이크로그램에 달했습니다. 이 정제 된 BDNF는 BirA-GST에 의해 중재 된 체외 반응에 의해 생체 화되었다.이 샘플은 자기 비드 클리어 버퍼의 상퍼중비 생체화 BDNF oviduct의 부족에 의해 입증된 바와 같이 균질하게 바이오티니드하였다. 이러한 결과는 제안된 프로토콜이 생체외 모노 바이오타이니션에서 상당한 양의 BDNF oviduct 및 균질성 정제를 허용한다는 것을 보여줍니다. 이어서 모노바이오티니화 BDNF의 생물학적 활성은 2개의 상이한 실험접근법을 사용하여 평가하였다.첫째, 60mm 플레이트에서 시드된 피질 뉴런은 30분 동안 모노 바이오티니드 BDNF의 밀리리터당 50나노그램으로 자극된 다음 단백질은 서부 얼룩 분석을 위해 제조되었다. 모노 바이오티니징 BDNF의 생물학적 활성은 인-트rkB 및 인-ERK를 검출함으로써 정량화되었다. TrkB에 BDNF의 결합은 ERK를 포함하는 몇몇 다운스트림 키나아제의 수용체의 자동 인산화 및 활성화를 트리거합니다.BDNF로 자극되지 않은 부정적인 대조 조건과 BDNF로 자극된 양성 조절 조건이 BDNF oviduct 생물학적 활성의 분석을 위해 포함되었다. 밴드는 모두 인계 단백질이었고, 상업용 BDNF 및 모노 바이오티니화 BDNF로 치료된 뉴런에서 비슷한 강도를 보였으며, 둘 다 부정적인 대조군 조건보다 더 강한 신호를 보였다. 이어서 연쇄상구균점에 결합된 모노바이오티니화 BDNF의 생물학적 활성은 살아있는 이미징 실험에서 사용될 수 있음을 입증하기 위해 평가되었다.피질 뉴런은 10mm 커버로 시드되었고, 인-CREB를 고정하고 염색하기 전에 30분 동안 200피코몰러 또는 2개의 나노몰라 BDNF 양자점의 최종 농도로 처리하였다. CREB는 피질 뉴런에서 활성화된 ERK12에 의해 표적으로 하는 전사 인자입니다. BDNF 양자점의 농도가 증가함에 따라 신경세포를 자극하여 CREB의 인산화용량 증가와 핵을 둘러싼 양자점 입자의 존재는 BDNF 양자점 입자가 내분비화되어 BDNF 매개 TrkB와 관련된 신호 경로의 활성화를 촉발시켰다.200피코모라 BDNF 양자점으로 신경을 자극하는 반면, 2나노몰러 BDNF 양자점으로 자극하는 반면, 인-CREB 신호의 2배 증가가 인-CREB 신호의 3.5배 증가를 초래했다. 따라서, 생체화 된 BDNF oviduct는 생물학적으로 활성화되고 면역 형광 및 살아있는 세포 이미징에 적합한 streptavidin 양자점에 결합할 때 그 활동을 잃지 않습니다. 마지막으로, BDNF 양자점의 이미징 잠재력은 미세유체 챔버를 사용하여 구획화된 배양에서 평가되었다.피질 뉴런은 축산 및 소종 절인 구획을 분리하기 위해 미세 유체 챔버에서 시드되었으며 3.5 시간 동안 두 개의 나노 몰러 BDNF 양자점으로 자극되었습니다. 살아있는 세포 현미경 검사가 수행되었고, 결과 kymographs는 세포기관을 포함하는 BDNF 양자점의 속도를 정량화하기 위하여 이용되었습니다. 초당 0.91 마이크로미터의 평균 이동 속도가 검출되었으며, 이는 세포질 흉포 성 흉포 매개 수송의 이전 분석과 일치합니다.2개의 나노몰러 스트렙타비딘 양자점으로 취급된 미세유체 챔버는 kymograph에 의해 도시된 것과 같이 마이크로 단에 있는 움직이는 양자점을 보여주지 않았습니다. 동일한 조건하에서 자란 세포는 500 피코몰라 또는 2나노몰라 BDNF 양자점으로 210분 동안 자극한 다음 핵 얼룩으로 고정및 표지하였다. BDNF 양자점으로 처리된 뉴런은 마이크로 그룹과 소마토덴드리틱 구획의 근해 및 탈모 부분을 포함하여 모든 분석된 하위 구획에서 표지된 단백질의 용량 의존적 축적을 보여준다.대조적으로, 제어 뉴런은 챔버 전체에 거의 양자 점 신호를 보여주지 않았다. 따라서, BDNF 양자점은 미세 유체 챔버에서 라이브 및 고정 세포에서 검출될 수 있다. 이 비디오를 시청한 후에는 크로마토그래피 컬럼 기반 비용 효율적인 절차에서 모노 바이오타이니드 BDNF oviduct를 생산하는 방법에 대한 좋은 이해를 가져야 합니다.

an-improved-protocol-to-purify-directly-mono-biotinylate-recombinant

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

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뉴런의 세포 인신 매매 연구를 위한 튜브에서 정제하고 직접 모노 바이오티니레이트 BDNF를 정화하는 향상된 프로토콜

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