Name: 종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 학습하세요 측면 꼬리 정맥 주입 모델을 이용한 폐 전이 병리학 분석 방법을. 디지털 이미지 분석으로 종양 부담을 정량화하여 암 연구의 재현성을 높입니다.

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대표적인 데이터는 국립암연구소(K22CA218549~S.T.S.S)를 통해 지원되었다. 본 원에 보고된 포괄적인 분석 방법 개발에 도움을 주는 것 외에도, 오하이오 주립대학 종합암 센터 비교 병리학 및 마우스 Phenotyping 공유 리소스(디렉터 – 크리스타 라 펄, DVM, 박사)에게 조직학 및 면역 조직화학 서비스 및 알고리즘 개발 및 분석을 위한 병리학 이미징 코어에 감사드립니다.

동물 사용은 OSU 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)-승인 프로토콜 2007A0120-R4 (PI: 지나 사이즈모어 박사)에 따라 대학 실험실 동물 자원 (ULAR) 규정을 따랐다.
1. 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입
<ol><li>세포 및 주사 주사기 의 준비<ol>
<li>사용되는 마우스 및 세포 농도의 수에 따라 적절한 수의 세포를 플레이트. 참고: 전이의 발달에 주입된 세포의 수와 시간은 사용된 세포주에 따라 달라지며 최적화되어야 합니다. 본 데모에서, 1 x 106 MDA-MB-231 세포는 NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스로 정맥주사되고, 거시성 폐 병변은 24일 이내에 사후 주입 후 관찰된다. MVT1 뮤린 유방 종양 세포 17의 경우, 3 x 106 세포는 14일22,23에 의해 관찰된 수많은 폐 전이를 가진 면역 유능한 FVB/N 마우스로 주입된다.</li>
		<li>1x PBS로 세포판을 흡입하고 헹구세요. 트립시니징 셀을 최소한의 부피로, 적절한 양의 매체를 추가하고, 혈종계 또는 다른 바람직한 방법을 사용하여 세포를 계산합니다. Trypan 파란색(0.4%) 또는 기타 라이브/데드 셀 염료를 사용하여 실행 가능한 세포 수를 결정할 수 있습니다.</li>
		<li>펠릿 셀은 180 x g 에서 5 분 동안 회전합니다.</li>
		<li>마우스당 100 μL의 부피가 주입되는 멸균 1x PBS에서 적절한 수의 세포를 재일시 중단합니다. 생존력을 유지하기 위해 얼음에 세포 현탁액을 유지합니다.</li>
		<li>주입 하기 전에, 완전히 응고를 피하기 위해 200 μL 또는 1 mL 파이펫으로 세포를 다시 중단. 28G 인슐린 주사기에 100 μL을 그립니다( 재료 표 참조).</li>
		<li>주사기를 수직으로 유지하고 주사기를 두드리고 플런저를 천천히 조정하여 기포를 제거하십시오. 정맥에 기포를 주입하면 치명적일 수 있는 공기/가스 색전증이 발생할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>측면 꼬리 정맥 주입 참고: 실험적인 유방암 전이 assays를 위해, 주사는 6주 된 암컷 마우스를 > 수행됩니다.<ol>
<li>꼬리에 의해 마우스를 처리하고 적절한 크기의 슬롯 튜브 / 구속 장치로 동물을 밀어 넣습니다 (사용되는 구속 장치에 대한 재료 표 참조).</li>
		<li>구속 장치의 플러그 부분을 삽입하고 측면 꼬리 정맥이 쉽게 볼 수 있도록 측면에 마우스를 배치합니다. 마우스는 생식기, 등류 정맥 및 2 개의 측면 카우달 정맥에 맞춰 복부 동맥을 가지고 있습니다.</li>
		<li>무균 닦아 마우스 꼬리의 표면을 청소합니다. 검지 손가락과 엄지 손가락 사이의 꼬리를 지배적이지 않은 손으로 잡고 약간의 긴장을 가합니다.</li>
		<li>꼬리의 말단 부분에서 시작하여, 벨끝으로 정맥에 평행하게 바늘을 삽입한다.</li>
		<li>허용되는 경우 조심스럽게 바늘 을 다시 캡 하고 20-30 ° 각도로 구부립니다. 한 손으로 접근하거나 바늘 재래핑 장치를 적극 권장합니다. 참고: 정맥이 붕괴될 수 있으므로 흡인할 필요는 없습니다. 그러나, 혈액의 작은 플래시처음 배치 될 때 볼 수 있습니다. 바늘은 적절한 배치와 정맥으로 원활하게 진행됩니다.</li>
		<li>전체 볼륨을 정맥에 천천히 분배합니다. 플런저를 밀어붙일 때 저항해서는 안 됩니다.</li>
		<li>저항이 느껴지면 주사기 바늘을 즉시 제거하십시오. 필요한 경우 꼬리의 근위 쪽 끝으로 이동하거나 측면 정맥을 반대하는 바늘 (이상적으로 3 번 이상 시도)을 다시 삽입하십시오.</li>
		<li>소량의 혈액은 주사 후 대체 될 가능성이 높습니다. 멸균 거즈로 부드러운 압력을 가하고 무균 닦아 닦아냅니다.</li>
		<li>즉시 적절한 날카로운 용기에 주사기를 폐기하십시오.</li>
		<li>마우스를 깨끗하고 통풍이 잘 되는 케이지로 되돌리고 고통의 징후를 모니터링합니다.</li>
		<li>전이 형성의 징후 (노동 호흡, 구부러진 자세, 체중 감소) 및 일반적인 고민에 대한 마우스 2-3x / 매주 모니터링. 전이의 발달 시간은 세포주와 마우스 변형에 달려 있습니다.</li>
		<li>생체 내 살아있는 동물 영상 장치를 사용하는 경우, 화상 마우스는 세포의 성공적인 주입을 확인하고 시간 "제로"데이터를 얻기 위해 꼬리 정맥 주입 직후 (생체 내 생체 발광 화상 진찰에 대한 구체적인 세부 사항은 본원에 포함되지 않지만 양 외 24에 의해 설명된다).</li>
	</ol></li>
</ol>2. 폐 조직 고정 및 전이성 폐 종양 부담의 분석
<ol><li>조직 병리학을 위한 폐의 구조적 형식을 유지하기 위한 폐 조직 인플레이션<ol>
<li>승인된 안락사 절차(예: 챔버 부피/분의 30-70% 변위)가 뒤따르고, 핀이 있는 해부판에 마우스 시체를 고정한다. 해부 중에 마우스의 털을 막기 위해 70%의 에탄올을 스프레이하거나 바르십시오. 참고: 이산화탄소 질식은 특히 느린 유량에서 예상되는 배경 병변으로 폐 출혈을 일으킬 수 있습니다.</li>
		<li>중음절절로 흉부를 열고 복막을 통해 절개/캐니드를 확대하고, xyphoid 과정을 파악하여 다이어프램을 잘라냅니다.</li>
		<li>별도의 가위를 사용하여 블레이드를 무디게하지 않고 흉골의 양쪽을 따라 갈비뼈를 자르고 조심스럽게 갈비뼈를 제거하여 폐가 확장 될 수있는 공간을 남겨 둡시하십시오.</li>
		<li>하안 타액 땀샘과 적외선 근골격계를 제거하여 기관지를 분리합니다. 기관의 양쪽에 핀을 배치하면 바늘 삽입 중에 원치 않는 움직임을 방지 할 수 있습니다.</li>
		<li>26 G 주사기를 2-3mL의 10% 중성 버퍼포름으로 채우고 기관지에 삽입한다.</li>
		<li>천천히 포르말린을 주입하고 폐가 팽창하는 것을 감시합니다 (일반적으로 포르말린의 ~ 1.5 mL이 필요합니다).</li>
		<li>포르말린이 폐에서 누출하기 시작하면 (인플레이션을 피하기), 한 쌍의 집게로 기관을 꼬집어 주사기 바늘을 제거하고 전체 호흡기 장치를 분리하십시오. 조직의 추가 트리밍이 수정 후 수행 할 수 있기 때문에 폐, 심장 등을 포르말린에 직접 배치하십시오.</li>
		<li>표준 방법을 사용하여 완전한 처리, 포함, 조직의 단면, 헤마톡시린 및 에오신 (H&E) 염색.</li>
	</ol></li>
	<li>전이성 폐 종양 부담 분석<ol>
<li>40배율의 고해상도 슬라이드 스캐너에서 H&E 염색 폐 단면을 스캔합니다(그림 3).</li>
		<li>폐 전이의 정량화를 위해 이미지 분석 소프트웨어(예: Visiopharm 이미지 분석)로 이미지를 가져옵니다. 참고: 새 사용자는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하기 위해 현장 또는 온라인 교육을 받는 것이 좋습니다. 수많은 웨비나 도 상용 웹 페이지를 통해 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>소프트웨어의 앱 라이브러리에서 Visiopharm 10118 H&E 폐 전이 앱을 선택합니다. 참고 : 이 응용 프로그램의 목적은 H&E 스테인드 슬라이드에 폐 전이를 표시하고 정량화하는 것입니다. 10118 H&E 폐 전이 앱의 일환으로, 첫 번째 이미지 처리 단계는 조직 검출 앱으로 폐 조직을 분할합니다. 두 번째 이미지 처리 단계는 폐 조직 내부의 전이를 식별하는 전이 감지 앱을 사용합니다. 전이는 전이로 식별되기에 대해 너무 잘못 모양이 있거나 너무 빨갛거나 너무 희소한 영역과 함께 모양을 통해 식별됩니다.</li>
		<li>모양과 희소성 을 정의하는 매개 변수를 조정하여 대표 이미지에 가장 잘 맞춥니다. 종양 전이 및 정상 폐 조직의 분할 영역은 각 조직 유형에 대해 상이한 색 레이블을 사용하여 표시될 수 있다. 참고: 앱이 정상 폐 조직과 전이를 정확하게 분리할 수 없는 경우, Visiopharm 결정 포리스트 프로그램을 사용하는 사용자 지정 앱은 실험에 대해 수행한 대로 작성해야 할 수 있습니다( 그림 2 및 그림 3 참조). 사용자 지정 알고리즘 작성에 대한 자세한 내용은 아래를 따릅니다. 그렇지 않으면 2.2.9 단계로 진행하십시오.</li>
		<li>원하는 이미지에 여러 클래스 (즉, 폐 조직 (비 신생물), 전이, 적혈구, 상피 및 / 또는 공백을 훈련하여 작동하는 결정 숲 프로그램을 엽니 다. 도 2에서 종양 전이는 파란색이고 정상 조직은 녹색이며 기관지 상피는 노란색입니다. 또한 적혈구는 빨간색과 공기 공간에 분홍색으로 되어 있습니다.</li>
		<li>이미지에 대한 각 클래스 를 적절하게 교육하기 위해 예 또는 아니오 질문의 프롬프트 시리즈를 따르십시오. 알고리즘의 정확도는 예/아니오 질문의 수를 결정합니다. 분석을 위해 사용자 지정 알고리즘/앱은 정확도를 50(범위 0-100 범위)으로 설정하여 작성되었습니다.</li>
		<li>알고리즘/앱의 정확도를 높이기 위해 필터를 적용하여 각 클래스의 기능을 조정하여 알고리즘/앱의 정확도를 향상시킵니다. 피처는 클래스가 이미지를 보는 방식을 변경하여 특정 색상이나 강도를 가져옵니다. 참고: 사용자 지정 알고리즘의 경우 8500 μm2 이상을 측정하는 전이가 전이로 표시되고 측정됩니다. 이것은 크기 차이를 차지하고 전이가 너무 작아서 감지할 수 없습니다. 8500 μm2 미만의 작은 모양의 영역과 작은 전이성 영역이 정상 조직 정량화에 포함되었다.</li>
		<li>앱 또는 사용자 지정 알고리즘에서 수정된 설정을 저장한 다음 알고리즘/앱을 전체 집합 또는 일련의 H&E 염색 조직에 적용합니다.</li>
		<li>마지막으로 표 1에 나열된 변수를 포함하는 모든 출력 변수를 내보냅니다. 미크론 제곱(μm2)의 면적은 각 조직 유형에 대해 정량화될 수 있으며 백분율은 표본 총 순 조직 영역(즉, 총 조직 마이너스 공공간)으로부터 유래된다.</li>
		<li>사용자 지정 알고리즘을 만들 때, 정확한 측정을 보장하고 조직 유형을 구별하기 위해 수의 병리학자 보드 인증 수의 병리학자와 협의하여 조직 마크업을 검토하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

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연구원이 전이를 위한 실험 모형으로 종양 세포의 정맥 주사를 계속 사용함에 따라, 결과전이성 종양 부담을 분석하는 표준 사례는 부족합니다. 경우에 따라 특정 세포주를 조작하거나 화학 화합물을 사용하는 경우 전이성 종양 부담의 현저한 차이를 거시적으로 관찰할 수 있다. 그러나, 다른 경우에, 전이성 파종 및 성장에 있는 미묘한 다름은 철저한 병리학 적인 분석 없이 간과되거나 잘못 해석될 수 있습니다. 이 연구는 전이성 폐 종양 부담 분석의 포괄적인 방법을 포함하 여 이전에 발표 된 꼬리 정맥 주입 프로토콜을 진행합니다. 중요한 것은, 이러한 디지털 병리학 분석 방법은 자발적전이뿐만 아니라 다른 실험전이 모델(즉, 심내 외성 등) 및 환자 유래 제노이식(PDX) 모델뿐만 아니라 자발적인 전이성 주입에 따른 폐 전이성 종양 부담의 정량화에도 적용될 수 있다. 수의병리학자에 의한 디지털 이미징 및 소프트웨어 알고리즘 개발의 사용은 전이성 폐 종양 부담을 분석하기 위해 이 접근법의 재현성, 정확성 및 철저함을 보장합니다<sup class...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.
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Katie A. Thies1,&#160;Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University
to:
Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1 
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center 
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61270/pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein">Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells</a>. The author list was updated.

Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

매우 복잡하고 비효율적인 과정임에도 불구하고1, 전이는 암 환자의 이환율과 사망률에 중요한 기여이다2. 사실, 대부분의 암 관련 죽음은 질병의 전이성 퍼짐에 기인합니다3,4. 종양 세포가 성공적으로 전이되기 위하여는, 그(것)들은 1 차 적인 사이트에서 분리하고, 인접한 기질기를 통해 침략하고, 혈액 순환 또는 림프로 침입하고, 이차 사이트의 모세관 침대로 여행하고, 이차 조직으로 사치스럽게, 증식하거나 전이성 병변을 형성하기 위하여 증가하거나 성장해야 합니다. 마우스 모델의 사용은 전이성 파종 및 growth6,7을 담당하는 분자 메커니즘의 이해를 증진하는 데 매우 중요했습니다. 본명, 우리는 유방암 전이에 초점을 맞추고, 유전자 변형 마우스 모델뿐만 아니라 이식 방법이 종종 사용되는 - 장점과 한계의 자신의 세트와 각각.
유전자 조작 된 유방 종양 모델은 MMTV-LTR (마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복) 및 WAP (유청 산성 단백질)를 포함한 유방 선및 특정 프로모터를 사용하여 유방 상피8에서 트랜스 유전자의 발현을 유도합니다. 폴리마 중형 T 항원(PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 및 simian 바이러스 40(SV40)을 포함한 온코진은 이러한 방식으로 발현되었으며, 이러한 유전 적 모델은 1차 종양 개시 및 진행을 연구하는 데 유용하지만, 몇 가지 판독적으로 대사를 거친 장기에 대해 보다 쉽게 대사한다. 더욱이, 이러한 유전 마우스 모델은 종종 자발적 또는 실험 전이 모델보다 더 많은 시간과 비용이 금지된다. 전이를 연구하기 위해 대부분의 유전자 조작 된 유방 종양 모델의 한계를 감안할 때, 이식 기술은이 복잡한 과정을 연구하는 매력적인 방법이되고있다. 여기에는 직교, 꼬리 정맥, 심장 내 및 적합한 세포주의 두개 내 주입이 포함됩니다.
여러 유방암 세포주가 유방 지방 패드14,15로 직교 주입에 따라 쉽게 전이되지만, 전이성 종양 부담의 일관성과 재현성은 도전이 될 수 있으며, 이러한 연구의 기간은 몇 달의 순서에 있을 수 있습니다. 폐 전이를 평가하기 위해, 특히, 꼬리 정맥내의 정맥 주사는 종종 전이성 확산이 일반적으로 몇 주 내에 발생하는 보다 재현 가능하고 시간 효율적인 방법입니다. 그러나, 정맥 주사 모델은 전이성 캐스케이드의 초기 단계를 우회하기 때문에, 이러한 연구의 결과를 해석에주의를 기울여야한다. 이 데모에서는 정확하고 포괄적인 분석 방법과 함께 유방 종양 세포의 꼬리 정맥 주입을 보여줍니다.
연구 공동체가 유방암 전이의 복잡한 과정을 이해하는 데 상당한 진전을 이루었음에도 불구하고 현재 150,000명 이상의 여성이 전이성 유방암16을 가지고 있는 것으로 추정됩니다. 단계 IV 유방암을 가진 사람들의, >36% 환자의 폐 전이17이 있습니다; 그러나, 전이의 부위 별 패턴 및 발생률은 분자 하위타입18,19,20,21에 따라 달라질 수 있다. 유방암 관련 폐 전이를 가진 환자는 이 질병을 위한 효과적인 처리 및 새로운 biomarkers를 확인하는 필요를 강조하는 단지 21 달의 중앙 생존이 17. 종양 세포의 정맥 주사를 포함하여 실험적인 전이 모형의 사용은, 이 중요한 임상 도전의 우리의 지식을 계속 전진할 것입니다. 디지털 이미징 병리학 및 이 프로토콜 내에서 설명된 전이성 폐 종양 부담 분석 방법과 결합될 때, 꼬리 정맥 주사는 유방암 전이 연구를 위한 귀중한 도구입니다.

<table><tbody><tr><td>알코올 준비 패드</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-750</td><td>주사 전 꼬리 청소</강력></td></tr><tr><td>해부 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-5</td><td>마우스 해부 및 폐 조직 팽창</td></tr><tr><td>DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L 포도당 및 피루브산 나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10013CV</td><td>MDA-MB-231 및 MVT1 세포주를 위한 세포 배양 배지 베이스</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 염 용액 1x</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21030CV</td> 주입 에탄올(70% 용액)을 <td>위한 종양 세포 재현탁에 사용됨</td></tr> <tr><td></td><td>OSU</td><td></td><td>는 해부 중 마우스의 털을 최소화하는 데 사용됨; 주의 - 가연성</td></tr><tr><td>Evan's blue dye</td><td>Millipore Sigma</td><td>E2129</td><td>꼬리 정맥 주입 방법을 사용한 연습을 위해 멸균 PBS에서 1 %로 사용; 사용 주의 - 위험한 시약</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Millipore Sigma</td><td>F4135</td><td>세포 배양 배지 첨가제; DMEM 겸자에 10%로 사용</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>10-270</td><td>해부 및 폐 조직 팽창</td></tr><tr><td>FVB/NJ 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>001800</td><td>MVT1 세포</td></tr><tr><td>혈구계(Bright-Line)용 syngeneic</td> 마우스 균주 <td>Millipore Sigma</td><td></td><td>세포 수를 얻기 위한 세포 배양에 사용하기 위한</td>Z359629</tr><tr><td>인슐린 주사기(28G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-1B</td><td>(BD 329424)</td></tr><tr><td>MDA-MB-231 세포</td><td>ATCC</td><td></td><td>인간 유방암 세포주</td></tr><tr><td>MVT1 세포</td><td></td><td></td><td>마우스 유방 종양 세포</td></tr><tr><td>바늘(26G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826-15</td>는 <td>마우스의 주사기를 팽창시키는 데 사용됩니다. 폐</td></tr><tr><td>중성 완충 포르말린 (10 %)</td> <td>피셔 사이언티픽</td><td>245685</td><td>조직 고정제로 사용되며 폐 조직을 팽창시킵니다. 주의하십시오 - 위험한 시약</td></tr><tr><td>NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td>OSUCCC에 의해 유지 관리 대상 검증 공유 리소스</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신 100x</td><td>ThermoFisher</td><td>15140163</td>세포 <td>배양 배지</td></tr><tr><td>첨가제 멸균 거즈</td><td>Fisher Scientific</td><td>출</td><td>혈이 발생할 경우 마우스의 꼬리에 압력을 가하기 위한</td>NC9379092</tr><tr><td>주사기(5mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-458</td><td>쥐 폐 조직</td></tr><tr><td>꼬리 정맥 억제</td>기를 팽창시키는 데 사용 <td>Braintree Scientific, Inc.</td><td>TV-150 STD</td>는 <td>꼬리 정맥 주사를 위해 마우스를 억제하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>Trypan blue (0.4 %)</td><td>ThermoFisher</td><td>15250061</td><td>생존력을 평가하기 위해 세포 배양에 사용됩니다</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25 %</td><td>ThermoFisher</td><td>25200-114</td>는 <td>플레이트에서 종양 세포를 분리하기 위해 세포 배양에 사용됩니다</td></tr></tbody></table>.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

대부분의 암 환자를 위한 이환율 과 사망의 1차 원인인 전이는 마우스에서 전임상적으로 모델링하는 것이 어려울 수 있습니다. 몇 가지 자발적인 전이 모델을 사용할 수 있습니다. 따라서, 적절한 세포주의 꼬리 정맥 주입을 포함하는 실험전이 모델은 전이 연구의 주축이다. 암세포가 측면 꼬리 정맥에 주입될 때, 폐는 식민지화의 그들의 바람직한 사이트입니다. 이 기술의 잠재적 인 제한은 전이성 폐 종양 부담의 정확한 정량화입니다. 몇몇 조사자는 사전 정의된 크기의 macrometastases를 계산하고 조직의 단면 다음 micrometastases를 포함하는 동안, 그 외는 일반적인 조직 지역에 근거를 둔 전이성 병변의 지역을 결정합니다. 이 두 정량화 방법 모두 전이성 부담이 높을 때 매우 어려울 수 있습니다. 본명, 우리는 영상 분석 소프트웨어를 사용하여 전이성 종양 부담을 정량화하는 고급 방법에 이어 폐 전이의 정맥 주사 모델을 시연한다. 이 프로세스를 통해 평균 전이 크기, 총 전이 수 및 총 전이 영역을 포함한 다중 엔드 포인트 매개 변수를 조사하여 포괄적인 분석을 제공할 수 있습니다. 또한, 이 방법은 정확도를 보장하기 위해 미국 수의병리학자(SEK)에서 인증한 수의병리학자 위원회에 의해 검토되었습니다.

꼬리 정맥 주사를 위해 표지가 없는 세포를 사용하는 경우, (1) 거세메타제가 관찰될 수 있는 경우 또는 (2) 현미경 전이가 존재하는 경우 내시경 분석 후 부검 시간까지 폐 식민지화를 확인하기 어려울 수 있다. 광범위한 전이성 폐 종양 부담으로 마우스는 호흡을 수고하게 됩니다. 어떤 종양 연구와 마찬가지로, 마우스는 주의 깊게 연구 기간 내내 감시되어야 합니다. 표지 된 세포의 사용은 성공적인 꼬리 정맥 주입을 확인하는 쉬운 방법입니다; 따라서 데모에서 luciferase 태그 MDA-MB-231 세포의 사용. 그러나 생체 내 이미징이 실험 설계 및 기타 요인에 따라 항상 가능하거나 필요한 것은 아닙니다. 도 1A는 정확한 주입의 확인으로 루시파라래이태그 MDA-MB-231 세포의 꼬리 정맥 주입 후 2 시간 미만 흉부 공간에서 생물 발광 신호를 나타낸다. 이 실험의 경우, 흉부 부위의 광자 수는 시간이 지남에 따라 증가하고 강력한 생물 발광 신호가 24 일째에 존재합니다(...

암세포의 정맥 주사는 전이 연구에서 자주 사용되지만 전이성 종양 부담은 분석하기 어려울 수 있습니다. 본명, 전이의 꼬리 정맥 주사 모델을 시연하고 결과전이성 폐 종양 부담을 분석하는 새로운 접근법을 포함한다.

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

현재 꼬리-정맥 주입으로 인한 전이성 폐 종양 부담을 분석하기 위한 황금 표준은 없습니다. 디지털 이미지 분석을 활용하여 매우 효율적인 방식으로 폐 전이를 정확하고 재현 가능하게 정량화했습니다. 이 방법은 시간과 비용 효율적입니다.또한 디지털 이미지 분석과 결합하면 결과로 발생하는 폐 전이성 종양 부담을 매우 정확하고 포괄적으로 분석할 수 있습니다. 인간 유방암 세포를 주사할 수 있도록 준비하려면 먼저 사용할 마우스의 수와 세포 농도에 따라 적절한 수의 세포를 적절한 세포 배양 배지에 배치합니다. 세포가 80-90% 밀도에 도달하면 PBS로 플레이트를 세척하고 표준 프로토콜에 따라 최소한의 트립신으로 세포를 분리합니다.세포가 분리되면 계수를 위해 신선한 배양 배지에 세포를 다시 현탁시키고 원심분리로 세포를 수집합니다. 그런 다음 얼음 위에 마우스당 100마이크로리터의 PBS에 적절한 농도로 세포를 다시 현탁시킵니다. 주사 직전에 뭉치지 않도록 세포를 얼음 위에 철저히 다시 현탁시키고 100마이크로리터의 세포를 28게이지 인슐린 주사기에 넣습니다.주사기를 수직으로 유지하면서 플런저를 천천히 조정하여 기포를 제거하면서 샤프트를 두드립니다. 허용되는 경우 바늘 뚜껑을 조심스럽게 다시 닫고 바늘 끝을 20-30도 각도로 구부립니다. 생후 6주가 넘은 암컷 쥐를 플라스틱 쥐 보호구에 묶어 놓고 옆 꼬리 정맥이 잘 보이도록 옆으로 눕힙니다.생식기, 등쪽 정맥 및 두 개의 측면 꼬리 정맥과 일치하는 복부 동맥을 찾고 무균 물티슈를 사용하여 꼬리 표면을 청소합니다. 주로 사용하지 않는 손의 검지와 엄지 손가락 사이의 꼬리를 잡고 약간의 장력을 가하고 꼬리의 원위 부분부터 바늘을 정맥과 평행하게 경사면이 위로 향하게 삽입합니다. 세포의 전체 부피를 정맥으로 천천히 전달합니다.주사 후 소량의 혈액이 대체될 가능성이 높습니다. 멸균 거즈로 주사 부위에 부드러운 압력을 가합니다. 그런 다음 주사기를 적절한 날카로운 물건 용기에 버리고 모니터링이 가능한 깨끗하고 통풍이 잘되는 케이지에 마우스를 넣습니다.꼬리 정맥 주입 후 1시간 이내에 살아있는 동물 생체 내 이미징을 수행하여 성공적인 세포 주입을 확인하고 타임 제로 데이터를 얻습니다. 조직 병리학을 위한 폐의 구조적 형식을 유지하려면 마우스를 해부 보드에 고정하고 70% 에탄올로 털을 적십니다. 정중선 절개로 흉부를 열고 절개 부위를 복막을 통해 두개골 및 꼬리 방향으로 연장하고 횡격막을 제거할 수 있도록 xiphoid 과정을 잡습니다.두 번째 가위를 사용하여 흉골의 양쪽을 따라 갈비뼈를 자르고 흉곽을 조심스럽게 제거하여 폐가 팽창할 수 있는 공간을 남겨둡니다. 기관을 분리하려면 턱밑 타액선과 침하근을 제거하고 기관 양쪽에 핀을 삽입하여 바늘 삽입 중 원치 않는 움직임을 방지합니다. 26게이지 바늘이 장착된 3밀리리터 주사기에 2-3밀리리터의 10% 중성 완충 포르멜린을 넣고 바늘을 기관에 삽입합니다.포르멜린을 천천히 주입하면서 폐가 확장되는 것을 관찰합니다. 포르멜린이 폐에서 새어 나오기 시작하면 집게를 사용하여 기관을 꼬집고 바늘을 제거합니다. 그런 다음 전체 호흡기를 분리하고 장기를 신선한 포르멜린 용기에 직접 넣습니다.전이성 폐 종양 부담을 분석하기 위해 고해상도 슬라이드 스캐너에서 H&E 염색된 폐 조직 절편을 40배 배율로 스캔하고 이미지를 적절한 이미지 분석 소프트웨어 프로그램으로 가져옵니다. 형태와 희소성을 정의하는 파라미터를 이미지에 가장 잘 맞도록 조정합니다. 각 조직 유형에 대해 다른 색상 레이블을 사용하여 종양 전이 및 정상 폐 조직의 분할된 영역을 표시하려면 Decision Forest 프로그램을 열고 프롬프트된 일련의 예 또는 아니오 질문에 따라 각 클래스에 대해 이미지를 적절하게 훈련합니다.각 클래스의 기능을 조정하려면 필터를 적용하여 선명하게 하거나, 흐리게 하거나, 모양별로 정렬하여 알고리즘의 정확도를 높입니다. 이 분석에서 종양 전이는 파란색으로 나타납니다. 정상 조직은 녹색이고 세기관지 상피는 노란색입니다.적혈구는 빨간색으로 관찰할 수 있으며 공기 공간은 분홍색으로 나타납니다. 모든 기능이 설정되면 수정된 설정을 저장하고 전체 세트 또는 일련의 H&E 염색 조직에 알고리즘을 적용합니다. 그런 다음 모든 출력 변수를 내보내 각 조직 유형에 대해 미크론 제곱 단위의 면적을 정량화하고 표본 총 순 조직 면적의 백분율을 계산할 수 있도록 합니다.루시퍼라아제 태그가 붙은 인간 상피 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입 후 2시간 이내에 흉부 공간 내에 생물 발광 신호가 존재한다는 것은 정확한 주입을 확인하는 것으로 간주될 수 있습니다. 이 실험에서 흉부 부위의 광자 수는 시간이 지남에 따라 증가했으며 주입 후 24일째에도 강력한 생물 발광 신호가 여전히 존재했습니다. 부검 당시, 이 쥐에서 많은 거시적 폐 병변이 관찰되었습니다.시연된 바와 같이 이미지 분석 소프트웨어와 맞춤형 알고리즘을 사용하여 전체 폐 조직을 다양한 조직 특징으로 분할할 수 있습니다. 이러한 방식으로 폐 조직을 분할함으로써 소프트웨어는 다양한 매개변수를 정량화할 수 있습니다. 여기에서는 인간 상피 유방암 세포를 주입한 마우스의 폐 조직에 대해 수행한 분석의 원시 데이터를 보여주고 전이성 집락화를 차단하도록 설계된 약물로 치료했습니다.이러한 이미지에서 알 수 있듯이, 폐 결절의 총 수가 다르지 않기 때문에 이러한 치료 그룹 간의 전이성 종양 부담의 차이는 쉽게 간과될 수 있습니다. 그러나 모든 매개변수에 대한 포괄적인 분석은 순 폐 전이 면적 비율에서 상당한 차이를 보였으며, 이는 전이성 폐 종양 부담 분석에 대한 철저한 접근의 필요성을 강조했습니다.기포가 없는 적절한 세포 재현탁은 폐색전증을 예방하는 데 중요하며, 성공적인 폐 팽창은 정확한 이미지 분석을 위해 조직 구조의 무결성을 유지하는 데 도움이 됩니다. 폐 조직의 면역 염색을 수행하여 폐 병변 또는 폐 미세 환경 내에서 관심 세포 또는 단백질의 존재를 확인할 수 있습니다.

pathological-analysis-lung-metastasis-following-lateral-tail-vein

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 문서는 인간의 암 세포 라인의 전이성 잠재력을 결정하는 데 사용되는 실험적인 전이 분석의 절차를 설명합니다.

실험 전이 분석

이 비디오는 꼬리 정맥 주입을 사용하여 표지된 암세포를 마우스 모델에 주입하는 기술에 대해 설명합니다. 또한 실시간 생체 내 살아있는 동물 이미징을 사용하여 유방암, 전이 형성 및 성장을 모니터링합니다.

꼬리 정맥 주사: 마우스 모델에서 전이성 연구를 위한 암세포 투여 방법

이 비디오에서는 마우스 모델의 꼬리 정맥을 통해 흑색종 세포를 정맥 주사합니다. 흑색종 세포는 순환계를 통해 더 멀리 이동하면서 멀리 떨어진 미세환경에 적응하고 폐와 같은 장기에 전이를 일으킵니다.

실험적 전이성 흑색종 마우스 모델: 폐 내 흑색종 세포의 전이 가능성을 연구하기 위한 플랫폼

이 원고 종양 전이의 동물 모델에서 폐에 종양 세포 축적을 계량 하는 방법을 설명 합니다.

폐 종양 세포 모집 분석 결과

전이는 암의 독성에 지대한 영향을 미치며 사망의 약 90%를 차지합니다.  우리는 이 임상 현상에 대한 치료제의 효능을 결정하는 데 유용한 마우스의 전이성 흑색종 모델에 대한 프로토콜을 보고합니다.

동계 쥐 흑색 종 세포의 주입은 폐에서 그들의 전이성 잠재력을 확인하는 방법

문맥 주사를 통해 유선종양 세포를 쥐 간으로 전달하는 수술이 개발되었습니다. 이 모델을 사용하면 간의 종양 세포 유출, 파종, 생존 및 전이성 성장을 포함하여 완전히 면역이 있는 숙주에서 간 전이의 후기 단계를 조사할 수 있습니다.

포탈 정맥 주입 모델 간 전이 유방암의 공부를

이 기사의 목적은 폐 전이 분석 결과 (푸 마)에 대 한 프로토콜에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 것입니다. 이 모델 widefield 형광 또는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 폐 조직에서 전이성 osteosarcoma (OS) 세포 성장 연구에 연구를 허용 합니다.

폐 전이 분석 결과 사용 하 여 다리에 전이성 폐 식민지 공부에서 실용적인 고려 사항

순환 종양 세포 (CTCs) 암 전이 동안 폐 식민을 촉진 역할을 해독 하는 동물 모델 필요 합니다. 여기, 우리가 설립 하 고 성공적으로 수행는 vivo에서 시험의 구체적으로 테스트를 폐 식민 CTCs에 고분자 fibronectin (polyFN) 어셈블리의 요구.

순환 종양 세포 시각화 폐 조직에 대 한 폐 식민 분석 결과의 설립

기술된 접근법은 실험적인 꼬리 정맥 전이 실험과 생체 내 살아있는 동물 화상 진찰을 결합하여 폐에 있는 전이 수 그리고 크기의 정량화 이외에 유방암 전이 대형 및 성장의 실시간 감시를 허용합니다.

꼬리 정맥 전이 검사의 결합된 사용 및 생체 내 실시간 생체 내 이미징을 결합하여 폐암 전이성 식민지화 및 폐의 부담을 정량화

우리는 내인성 HER2 증폭 염증성 유방암 세포주의 꼬리 정맥 주사를 통해 생성된 유방암 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다.

염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

학습하세요 측면 꼬리 정맥 주입 모델을 이용한 폐 전이 병리학 분석 방법을. 디지털 이미지 분석으로 종양 부담을 정량화하여 암 연구의 재현성을 높입니다.

종양 세포의 측면 꼬리 정맥 주입 다음 폐 전이의 병리학 적 분석

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