Name: 두개 내 주입 및 자기 공명 이미징을 통해 뇌 전이를 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 학습하세요 두개내 종양 주입 및 MRI를 활용한 뇌 전이 모델링 방법을. 정확한 종양 부피 측정과 일련의 성장 모니터링이 가능하여 뇌 전이 메커니즘 연구에 효과적입니다.

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대표적인 데이터는 국립암연구소(K22CA218472~G.M.S.를 통해 지원되었다. 두개 내 주사는 오하이오 주립 대학 포괄적 인 암 센터 표적 검증 공유 자원 (이사 - 레나 Shakya 박사)에서 수행되며 MRI는 오하이오 주립 대학 포괄적 인 암 센터 소형 동물 이미징 공유 리소스 (디렉터 - Kimerly Powell 박사)에서 완료됩니다. 공유 자원은 OSUCCC, 국립 암 연구소 (P30 CA016058)의 OSUCCC 암 센터 지원 보조금, 오하이오 주립 대학 대학 및 부서와의 파트너십 및 설립 된 충전 시스템을 통해 자금을 조달합니다.

본 명세서에 기재된 모든 방법은 오하이오 주립대학(P.I. Gina Sizemore)의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 의해 승인되었습니다. 프로토콜 #2007A0120). 모든 설치류 생존 수술 IACUC 정책은 멸균 기술, 소모품, 악기 뿐만 아니라 절개 부위의 모피 제거 및 멸균 제제의 사용을 포함하여 다음과 같습니다.
1. 유방암 세포의 두개 내 주입
참고: 본 명세서에서 기재된 방법은 1차 MMTV-PyMT 종양(23)으로부터유래된 DB7 뮤린 유방 종양 세포주를 이용하였다. 이전 연구는 인간 질환의 것을 모방 하는 역사를 가진 BCBM의 모델로 DB7 세포의 두개 내 주입을 설립했다 12. 중요하게도, 면역능력이 있는 FVB/N 마우스는 이 마우스 균주로부터 DB7 세포가 유래되었기 때문에 이 모델에 사용된다. 이것은 유방암 모형이기 때문에, 성인 여성 마우스는 이 연구 결과에 이용됩니다.
<ol><li>셀을 준비합니다.<ol>
<li>멸균 후드에서 표준 기술을 사용하여 세포 배양 판에서 배지를 흡인합니다.</li>
		<li>1x DPBS로 셀을 세척하고 제조업체의 프로토콜을 사용하여 트립시니징합니다.</li>
		<li>트립신 반응을 중지하고 혈종계 또는 바람직한 방법을 사용하여 세포의 농도를 결정하기 위해 FBS 함유 매체의 적절한 부피를 추가합니다.</li>
		<li>펠릿 셀은 4°C에서 4분 동안 300 x g로 합니다.</li>
		<li>흡인 매체는 1x DPBS로 세척하고 4 °C에서 4 분 동안 300 x g에서 다시 회전합니다.</li>
		<li>1x DPBS에서 세포를 적절한 농도로 재중단, 2 μL의 주사용 부피 당 약 50,000 세포. 참고: 셀 번호는 선의 공격성에 따라 달라지며 조사자가 결정해야 합니다. 우리는 일상적으로 2 μL을 사용하지만, 볼륨 & 6 μL의 사용은15,,16,,17,,18,,19보고된다. 낮은 볼륨은 정밀도를 유지하는 데 매우 중요합니다.</li>
		<li>생존력을 유지하기 위해 주입될 때까지 재중단된 세포를 얼음 위에 놓습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수술을 위해 마우스를 준비합니다.<ol>
<li>모피를 가진 마우스의 경우: 탈모 크림/로션 또는 면도로 두개골에서 털을 제거하십시오. 수술 전 24-48시간 이내에 수술을 너무 가까이 수행하면 피부 품질과 봉합강도를 방해할 수 있습니다. 참고: 약 25g의 여성 FVB/N 마우스는 주로 여성 질환인 전이성 유방암의 연구로 인해 사용되었습니다.</li>
		<li>IACUC에 의해 결정되고 수의사참석에 의해 결정된 진통관리: 부프레노르핀 SR-LAB의 피하 주사 (0.05-0.1 mg/kg 복용량, Buprenorphine 주식: 0.5 mg/mL의 복용량에 대 한 0.0025-0.088 mL) 적어도 24 최대 제공 하기 전에 h 진 통, 반복 될 수 있습니다 48-72 첫 번째 복용량 후 h, 필요한 경우. 또한 수술 전 최소 24-48시간 동안 비스테로이드성 소염진통제(예: 식수의 이부프로펜 20% 이부프로펜)를 투여하고 수술 후 최소 72h의 수술 후 진통증을 제공하기 위해 수술 후 2-7일 동안 계속된다. 참고 : 오하이오 주립 대학에서, Buprenorphine SR-LAB은 규제 물질로 대학 실험실 동물 자원 수의학 직원에 의해 관리됩니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수술을 위한 스테레오전술 유닛을 준비한다.<ol>
<li>모든 마취 기계, 디지털 Vernier 스케일 및 디지털 인젝터를 켭니다. 참고: 모든 수술 도구는 수술 전에 적절하게 세척하고 살균해야 합니다.</li>
		<li>생물학적 안전캐비닛(도 1A)에서유도 챔버 부착이 있는 마취기계를 활용한다.</li>
		<li>마취 기계의 모든 튜브가 스테레오테틱프레임(도 1B, 인셋 1C)에연결되어 있는지 확인하고 튜브의 클램프가 사용 중인 모든 장치에 대해 열려 있습니다. 수술에 사용되지 않는 고정 프레임에 가는 튜브에 대한 클램프를 닫습니다.</li>
		<li>마우스 중량(예: 25g 동물 중량: 코콘 유량 34mL/분)에 따라 권장코 콘 유량을 제조업체에 제조하기 위해 마취 기계를 설정합니다. 참고: 이 입체 설정에 포함된 헤드 홀더는 성인 마우스에만 권장됩니다. 스테레오전술 설정에 포함된 제조업체 권장 사항을 따르도록 합니다.</li>
		<li>주사기에 미리 채워진 적절한 마취(예: 이소플루란)가 마취기계(도1B)에부착되어 있는지 확인한다. 참고: 주사기를 과도하게 프라이밍하면 수술 중에 너무 많은 마취가 마우스에게 전달되어 마취가 과다 복용될 수 있습니다.</li>
		<li>스테이지 잠금을 비틀어 드릴 비트 어댑터와 1mm 드릴 비트를 각 드릴에 삽입하고 비트 잠금을 수동으로 조이면 드릴을 잠급구합니다.</li>
		<li>입체 프레임에 드릴을 부착합니다(도1C).</li>
		<li>클린 해밀턴 주사기와 5 교대 세척 1 x DPBS, 다음 70% 에탄올, 다음 다시 한 번 1 x DPBS에. 동물이 주사를 준비할 때까지 따로 둡니다.</li>
		<li>디지털 인젝터를 설정하여 0.4 μL/min의 속도와 2μL의 대상으로 전달합니다. 이 속도와 볼륨은 뇌로 종양 세포의 느린 도입을 허용, 이는 압력과 관련 손상을 감소.</li>
	</ol></li>
	<li>마우스를 고정 프레임에 놓습니다.<ol>
<li>전술한 유도 챔버를 사용하여 마우스(예를 들어, 이소플루란)를 마취한다.</li>
		<li>심층 마취 평면에서 절차 전반에 걸쳐 마우스를 유지합니다. 기계에 의해 관리되는 % 마취는 유량, 자극의 정도 및 체온을 포함하여 요인의 수에 달려 있습니다. 리듬 호흡 (동물이 헐떡이지 않음)에 대해 평가하여 마취의 깊이에 대한 절차 전반에 걸쳐 마우스를 자주 모니터링하십시오. 팔페브랄 반사의 부족 (면 팁 어플리케이터로 자극 할 때 눈꺼풀의 펄럭임); 발가락 핀치의 부족 (발가락을 꼬집어의 유해한 자극에 사지의 철수). 참고: 마우스의 다른 긴장은 마취에 다른 반응을 가질 것입니다.</li>
		<li>마우스가 적절한 깊은 마취 평면에 있는 후에, 마우스를 스테레오전술 단위로 이송합니다. 마우스가 체온과 적절한 마취 평면을 유지하기 위해 스테레오테전술 기계에 있는 동안 가열 패드를 사용합니다. 참고: 로우 프로파일을 달성하기 위해 우리는 반전 파이펫 팁 박스 (그림 1D의마우스 상승 상자) 내에 배치 공기 활성화 손 워머를 사용합니다.</li>
		<li>마우스의 입을 열고 입체 프레임에 코 조각에 있는 입 바의 쓰루에 치아를 놓습니다(그림2A). 마우스의 코/입 위에 코 콘을 밀어(그림 2B).<ol>
<li>마우스를 머리 수준으로 마우스를 입 바에 놓습니다. 면 팁 어플리케이터의 무딘 끝으로 입을 부드럽게 열고 제자리에 미끄러. 코 콘이 마우스의 코 위에 완전히 있는지 확인하거나 마취가 제대로 전달되지 않습니다. 코 콘은 치아가이 홈 (인셋 도 2A)내에 앉지 않으면 코와 교전되지 않습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>멸균 면봉을 사용하여 각 마우스의 눈에 눈 윤활유를 놓습니다. 눈 윤활제의 적용은 각막의 건조를 완화하고 각막 외상과 관련된 각막 손상 및 수술 후 합병증의 기회를 감소시킵니다.</li>
		<li>왼쪽 귀 막대를 왼쪽 귀의 내측 캔투스에 대고 우울하여 마우스의 두개골을 안정화하고 스테레오전술 프레임의 나사를 사용하여 제자리에 고정합니다. 그런 다음 오른쪽 귀의 내측 캔에 대해 오른쪽 이어 바를 밀어 고정 프레임(도 2B)에단단히 나사. 참고: 이어 바를 배치할 때 마우스의 머리가 레벨과 직선인지 확인합니다. 머리가 비뚤어지거나 각진 경우 주사는 뇌의 잘못된 위치에 있을 것입니다. 이어 바는 적당한 수동 프로빙으로 자극시 두개골이 고정될 때까지만 조여야 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>calvarial 창을 만듭니다.<ol>
<li>베타딘 용액과 70% 에탄올을 각각 3배 번 번갈아 가며 두피를 준비하고 청소합니다. 수술 부위가 눈에 가깝기 때문에 수술 스크럽 위에 베타딘 용액을 사용하십시오.</li>
		<li>멸균 메스를 사용하여 두개골의 중앙 중앙 측면을 따라 피부를 3mm 절개하십시오 (처탈 봉합사 선 에 따라). 절개시 출혈은 최소화되어야 합니다. 이 경우, 멸균 면 팁 어플리케이터와 출혈 부위에 일관되고 단단한 압력을 가하십시오.gt;30 초.</li>
		<li>디지털 Vernier 스케일을 0으로 재설정하도록 하는 bregma(그림2C)에수직으로 드릴을 식별하고 방향을 지정합니다.</li>
		<li>드릴 2mm 측면을 시상 봉합사(도2C)로이동합니다. 재현성을 위해, 각합봉구 선의 왼쪽 또는 오른쪽에 있는 위치가 모든 동물에게 일관되게 유지되는지 확인합니다.</li>
		<li>드릴을 최고 속도로 켭니다. 회전 비트로 인한 조직 손상을 피하기 위해 피부가 드릴에서 멀리 이동되도록하고 조심스럽게 두개골에 드릴을 시작합니다. 칼바리아를 통해 약 0.5mm 깊이의 구멍을 뚫고 갈변창을 생성합니다. 드릴을 너무 멀리 낮추거나 뇌로 드릴하지 않도록주의하십시오. 드릴이 움직이는 동안 드릴 부위에 멸균 식염수로 떨어지면 주변 조직에 열 손상을 일으킬 수 있는 기계에 의해 생성된 열을 상쇄할 수 있습니다.</li>
		<li>calvarial 창이 만들어지면 드릴을 조심스럽게 들어 올려 스테레오데틱 프레임에서 제거합니다.</li>
		<li>70% 에탄올을 사용하여 드릴 비트를 청소하고 다시 사용중인 경우 따로 설정합니다. 그렇지 않은 경우 드릴 비트를 제거하고 70 % 에탄올에 잠급하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>뇌에 암세포 주입<ol>
<li>자동 인젝터 유닛을 스테레오전술장치(도 1D)에부착합니다.</li>
		<li>깨끗한 해밀턴 주사기에서 1x DPBS로 완전히 재장매된 셀의 2 μL을 당깁니다. 덩어리 형성을 줄이고 균일 한 세포 슬러리를 보장하기 위해 주사기를 채우기 직전에 세포를 다시 중단해야합니다. 공기 주머니/거품이 없도록 셀 볼륨의 6-8μL을 당기는 것이 이상적입니다.</li>
		<li>주사 장치에 해밀턴 주사기를 배치하고, 주입기가 제대로 작동하는지 확인하기 위해 일회용 멸균 드레이프에 소량의 부피를 분배하여 주입바늘을 프라임. 면 팁 어플리케이터(도1D, 인세트)로70% 에탄올로 주사기를 닦아냅니다. 이것은 주사관을 따라 종자의 종양 세포의 리스크를 감소시키는 바늘 샤프트의 외부 배럴에서 종양 세포를 제거합니다.</li>
		<li>바늘 끝을 칼변변창 중앙에 정렬하여 노출된 뇌원을 거의 만지도록 합니다.</li>
		<li>디지털 Vernier 스케일을 0으로 재설정합니다.</li>
		<li>천천히 뇌에 3mm의 깊이에 바늘을 삽입하고 바늘이 진행하기 전에 적어도 60 초 동안 뇌에 남아 있도록. 이 시간 프레임은 뇌 parenchyma 바늘 주위에 준수 할 수 있습니다, 이는 허리 압력과 바늘 관을 따라 종양 세포의 잠재적 추방을 감소.</li>
		<li>인젝터 화면에서 실행을 선택하여 주입 부위에 셀 전달을 시작합니다. 이 볼륨을 주입하는 데 약 5 분이 소요됩니다. 이 단계에 대 한 연장 된 시간은 뇌 parenchyma에 주입 힘에 의해 발생 하는 이차 손상을 줄이기 위해.</li>
		<li>주사 프로토콜이 완료되면 바늘이 적어도 3 분 동안 뇌에서 쉬게하여 뇌 가렌치마가 주사에 적응할 수 있게 하십시오.</li>
		<li>적어도 3 분 후, 0.75 mm/min의 속도로 뇌에서 바늘을 올립니다. 바늘 관을 추적하는 백압과 종양을 줄이기 위해 매우 느리고 일관된 방식으로이 작업을 수행하십시오.</li>
		<li>바늘이 뇌를 빠져나간 후, 주의 깊게 주입기에서 해밀턴 주사기를 제거하고 단계 1.2.8에 설명 된 대로 깨끗하게하십시오.</li>
		<li>멸균 면봉을 사용하여 calvarial 창에 따뜻한 뼈 왁스를 발라주세요. 뼈 왁스는 두개골 내에서 종양을 유지하기 위해 물리적 인 장벽 역할을합니다.</li>
		<li>절개를 닫습니다 (예를 들어, 5-0 PDS 는 외과 의사에게 가장 편안한 간단한 중단 패턴 또는 봉합사 클립에서 5-0 PDS 해빙 가능한 봉합사)를 닫습니다.</li>
		<li>마취의 투여를 중지하고 귀 막대를 잠금 해제하고 슬라이딩하여 장치에서 마우스를 제거하고 마우스에서 코 콘을 슬라이딩하고 입 바에서 치아를 분리합니다.</li>
		<li>복구를 위해 37°C로 따뜻한 세트에 있는 깨끗한 케이지에 마우스를 놓습니다. 일반적으로 마취가 중단된 후 10-15분 후에 발생하는 복구 중에 마우스를 모니터링합니다.</li>
		<li>마우스를 복구한 후 호스트 기관의 IACUC에서 결정한 초기 제거 기준을 모니터링합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 자기 공명 이미징
<ol><li>가돌리늄 기반 조영제(0.1M MultiHance의 체중 마우스 100 μL/20g)를 일반 인계 주입24 10-20분 전에 쥐에 투여한다. 그런 다음 흡입된 마취제(예: 이소플루란)를 95% O 2 및 5%CO2(즉, 2 실내 공기 가스)와 혼합한 유도 챔버를 사용하여 마취한다.</li>
	<li>체온을 유지하기 위해 가열 된 홀더에 마우스를 놓습니다. 귀 갈래와 물린 막대로 머리를 고정하고 마우스 뇌 표면 코일이 장착 된 9.4 T 자석에 홀더를 배치합니다. 이미징 시간 동안 마취를 유지, 연구는 일반적으로 마우스 당 약 20 분 걸립니다. 공압 베개와 작은 동물 모니터링 시스템을 사용하여 시술 내내 호흡률과 심박수(~70bpm)를 모니터링합니다.</li>
	<li>국소화 영상을 얻은 다음 T2 가중치 희귀 시퀀스(TR = 3500-4228 ms)를 사용하여 마우스 뇌를 이미지화하고, TE=12 ms, RARE Factor = 8, FOV=2.0 x 2.0 cm, 매트릭스 크기 = 256 x 256, 1mm 또는 0.5mm 슬라이스 두께, NA=2-4, 15-30 연속 슬라이스) 및 포스트 가돌리늄 기반 의 대비 T1 가중 희귀 시퀀스 (TR = 1200 ms, TE=7.ms, TE=7.ms , FOV = 2.0 x 2.0cm, 매트릭스 크기 = 256 x 256, 1 mm 또는 0.5 mm 슬라이스 두께, NA = 2-4, 15-30 인접 슬라이스).</li>
	<li>이미징 후, 회복을 위해 37°C로 따뜻한 세트에 마우스를 케이지에 배치합니다.</li>
</ol>3. 체적 종양 측정
<ol><li>총 종양 부피 획득<ol>
<li>이미지J에서 MRI DICOM 데이터 파일을 엽니 다, 건강의 국립 연구소 (https://imagej.nih.gov/ij/)를 통해 무료로 다운로드 로 사용할 수있는 이미지 처리 소프트웨어(https://imagej.nih.gov/ij/) 25. 참고: ImageJ는 종양 볼륨 계산에 대해 임베디드 픽셀 치수를 활용하는 데 필요한 DICOM 파일을 볼 수 있습니다(이미지,"길이 단위"가 원하는 대로 설정할 수 있는 속성(예: mm).</li>
		<li>프리핸드 선택 도구를 사용하여 종양 주위의 윤곽선을 그립니다. 어두운 방에서 이러한 선택을 수행하여 가시성을 향상시킵니다. 세션 간의 일관성을 유지하기 위해 밝기/대비를 조정하지 마십시오.</li>
		<li>분석 탭에서 측정값을 선택하여 선택한 영역의 영역을 가져옵니다. 밀리미터 단위가 3.1.1 단계에서 선택되면, 지역은 입방 밀리미터로 주어집니다. 원하는 경우 ctrl+D를선택하여 Freehand 선택을 포함합니다. 편집으로 이동하여 출력 색상을 변경 | 옵션 | 색상. 이미지를 RGB 이미지로 변환(이미지 | 입력 | RGB 색상) .tif 파일로 저장하기 전에.</li>
		<li>개별 마우스에 대한 모든 종양 함유 슬라이스를 측정하고 값을 적절한 데이터 분석 소프트웨어 프로그램(예: Microsoft Excel 또는 GraphPad 프리즘)으로 복사합니다.</li>
		<li>각 슬라이스의 영역을 합하여 총 종양 부피를 얻습니다. 슬라이스 두께(면적/두께)에 따라 영역을 수정해야 합니다.</li>
		<li>전체 단계 3.1.1.-3.1.5. 모든 마우스가 총 종양 부피를 가질 때까지. 종양을 설명하는 다소 주관적인 특성을 감안할 때 동일한 방법론이 여러 번 반복되고 기술적 오류를 줄이기 위해 평균되는 것이 이상적입니다.</li>
		<li>규모 막대를 설정하려면 DICOM 데이터 파일을 열고 분석으로 이동 | 도구 | 배율 막대를 조정합니다. 치수가 이미 DICOM 파일에 포함되어 있기 때문에 원하는 길이/너비를 선택하기만 하면 됩니다. RGB 이미지에 대한 은밀한(이미지 | 입력 | RGB 색상) .tif 파일로 저장하기 전에.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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MRI를 통한 직렬 모니터링에 이어 두개 내 주사의 활용은 시간이 지남에 따라 종양 부피 정확도로 종양 성장을 시각화하는 독특한 능력을 제공한다. 디지털 이미징 분석의 적용은 종양 부피, 출혈, 괴사 및 치료에 대한 반응에 대한 뇌 병변의 해석을 허용합니다.
모든 절차와 마찬가지로 성공을 위해 따라야 할 주요 단계가 있습니다. 첫째, 입체 장치의 신중한 설정은이 기술의 성공에 필수적이다. 뮤린 크라늄의 작은 크기로 인해 약간의 위화감은 종양 증가율에 극적으로 다른 영향을 초래하고 실험 동물에서 걸릴 수 있습니다. 따라서 이러한 계측기의 사용에 대한 적절한 교육이 필요합니다. 둘째, 절차 전반에 걸쳐 가열 원은 마취 평면이 너무 낮게 떨어지지 않도록 합니다. 낮은 체온은 약물 대사 감소와 마취 및 /또는 회복 시간을 연장 할 수 있기 때문에 마취하에 갑자기 죽을 위험에 동물을 배치합니다. 조립식 가열 패드는 부피가 크고 스테레오 전술 기계에서 기동하기 어려울 수 있지만, 모든 상용...

뇌전이 성인 1차 중추신경계 종양1보다10배 더 흔하며, 폐암, 유방암, 흑색종을 가진 거의 모든 고형종양 유형에서 가장 높은부각2를나타낸다고 보고되었다. 1차 종양 부위에 관계없이 뇌 전이의 발달은 인지 기능 저하, 지속적인 두통, 발작, 행동 및/또는 성격 변화와 종종 연관되는 불량 예후로 이어집니다1,,3,,4,,5. 유방암의 관점에서, 질병의 예방 및 치료에 많은 진보가 있었습니다. 그러나, 유방암으로 진단된 여자의 30%는 전이를 개발하기 위하여 계속될 것이고, 단계 IV 질병을 가진 그들, 대략 7%(SEER 2010-2013)에는 두뇌 전이6,,7이있습니다. 뇌 전이에 대한 현재 치료 옵션은 외과 절제술, 입체 방사선 수술 및 / 또는 전체 뇌 방사선 요법을 포함한다. 그러나, 이 적극적인 치료에도, 이 환자를 위한 중앙생존은 짧은 8-11 달7,,8,,9입니다. 이러한 냉혹한 통계는 참신하고 효과적인 치료 전략의 식별 및 구현의 필요성을 강력하게 지원합니다. 따라서, 뇌에 전이되는 모든 암과 마찬가지로, 실험실에서 유방암 과 관련된 뇌 전이(BCBM)를 적절히 모델링하여 현장에서 상당한 발전을 보장하는 것이 필수적입니다.
현재까지, 연구원은 뚜렷한 장점과 한계를 가진각각10,,11를가진 두뇌에 전이의 기계장치를 공부하기 위하여 다양한 방법론을 이용했습니다. 꼬리 정맥 및 심내 주입과 같은 실험전이 종양 세포를 몸 전체에 퍼뜨리고 주입 된 세포에 따라 다른 전이성 부위에 엄청난 종양 부담을 초래할 수 있습니다. 이러한 결과 다음 혼란 은 구체적으로 뇌에 전이 를 공부 하는 경우. 상기 자궁내 동맥 주입 방법은 종양 세포의 뇌 파종을 구체적으로 표적으로 하지만 기술적으로 수행하기 어려울 수 있기 때문에 제한적이기 때문에 유리하다. 정형소 1 차 종양 절제술은 종종 전체 전이성 폭포를 회수할 때 전이의 가장 임상적으로 관련된 모델로 간주됩니다. 그러나, 이 접근은 림프절, 폐 및 간과 같은 그밖 전이성 사이트에 비교된 두뇌 전이의 극적으로 더 낮은 비율로 생기기 위하여 자발적인 전이에 대한 장기간 대기 기간을 관련시킵니다. 종종, 동물은 뇌 전이의 발달 의 발달 의 앞에 이 그밖 전이성 사이트에 종양 부담 때문에 연구 결과에서 제거되어야 합니다. 뇌 열대 세포주를 관련 시키는 다른 방법은 뇌에 전이에 효과적; 그러나, 이러한 모델은 개발 하는 데 시간이 걸릴 종종 전파와 그들의 트로피즘을 잃게 하는 점에서 제한. ,이러한 한계를 감안할 때, 연구자들은 일상적으로뇌11,12,13,,14에 암 전이를 모델링하기 위해 두개내 주사 방법을 사용해 왔으며,14에는 다양한,방법론으로15,16,,17,,18,,19., 이 접근은 유사하게 한계가 있다는 것을 인정됩니다, 1 차적인 종양에서 내래의 교배, 혈액 두뇌 장벽을 통해 침투, 두뇌 내의 설치를 포함하여 초기 전이성 단계의 조사를 허용하지 않는다는 점에서 가장 중요한 것은. 그러나, 연구자가 뇌 내의 성장을 중재하는 종양 유래 요인(예를 들어, 종양 세포에 있는 종양 발생 인자의 유전적 조작), (2) 전이성 미세 환경의 변화가 이 부위에서 암 성장을 변화시키는 방법(예를 들어, 변경된 기질 성분을 가진 형질마우스 간의 비교) 및 (3) 치료 신약의 효과성을 시험할 수 있게 한다.
두개 내 주사 모델의 잠재적 인 유용성을 감안할 때, 주입 중 기술적 오류를 줄이고 시간이 지남에 따라 종양 성장을 정확하게 모니터링하는 것이 절대적으로 필요합니다. 본명에 기술된 방법은 흡입된 가스 마취의 연속적인 주입, 및 종양 세포의 직접 이식을 관체 드릴 및 주입 스탠드를 사용하여 뇌 완두엽종으로 직접 이식하는 것을 포함한다. 가스 마취를 투여하면 마취의 깊이와 길이를 미세 조정하고 빠르고 원활한 회복을 보장할 수 있습니다. 디지털 제어, 자동화 된 드릴 및 바늘 주입 시스템은 사출 현장 정밀도를 향상시키고 종종 드릴링 및 무료 손 주입 방법으로 발생하는 기술적 오류를 줄입니다. 자기 공명 영상 (MRI)의 사용은 종양 성장, 종양 부피, 조직 반응, 종양 괴사 및 치료에 대한 반응을 모니터링하는 정밀도를 더욱 증가시킵니다. MRI는 연조직20,,21에대한 선택의 이미징 양식이다. 이 이미징 기술은 이온화 방사선을 사용하지 않으며 특히 연구 과정에서 여러 이미징 세션에 대해 컴퓨터 단층 촬영(CT)보다 선호됩니다. MRI는 CT 또는 초음파 화상 진찰 (USG) 그 때 유효한 연조직 대비의 훨씬 더 중대한 범위를 가지고 있고 더 상세하게 해부학을 제시합니다. 그것은 뇌 자체 내에서 이상에 대 한 더 민감 하 고 구체적인. MRI는 2D USG 또는 2D 광학 이미징의 경우와 같이 피사체를 물리적으로 움직일 필요 없이 임의의 이미징 평면에서 수행될 수 있다. 두개골이 다른 이미징 양상에서와 같이 MRI 신호를 감쇠시키지 않는다는 것을 언급하는 것이 중요합니다. MRI는 CT 또는 USG의 뼈에서 나온 유물에 의해 가려질 수 있는 구조물의 평가를 허용합니다. 또 다른 장점은 상대적으로 낮은 독성 또는 부작용으로 병변 검출 한계를 향상시키는 MRI에 사용할 수있는 많은 콘트라스트 에이전트가 있다는 것입니다. 중요한 것은, MRI는 종양 부피 해독에 제한되는 부검시의 조직학적 평가와 달리 실시간으로 모니터링할 수 있게 한다. 생물 발광 화상 진찰과 같은 그밖 화상 진찰 양식은, 초기 종양 탐지 및 시간이 지남에 따라 감시를 위해 실제로 효과적입니다; 그러나, 이 방법은 세포주의 유전 조작 (예를 들면, 루시파아제/GFP 태깅)를 요구하고 체적 측정을 허용하지 않습니다. MRI는 MR 이미지의 환자 모니터링 및 다운스트림 체피 분석을 미러로 하여 더욱 유리하며,부검(22)에서히스토릭 종양 크기와 밀접한 상관관계가 있는 것으로 알려져 있다. MRI 스크리닝을 통한 연쇄 모니터링은 또한 신경학적 장애의 임상 모니터링을 증가시킵니다.
전반적으로, 직렬 MRI에 선행된 입체 내 종양 주입의 제시된 방법은 암에 있는 두뇌 전이의 기계장치를 공부하기 위하여 믿을 수 있고, 예측가능하고, 측정가능한 결과를 생성하는 것을 가능하게 합니다.

<table><tbody><tr><td>Surgical Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue Products</td><td>19-027132</td><td>포비돈-요오드, 7.5%</td></tr><tr><td>뼈 왁스</td><td>수술 전문 분야</td><td>903</td><td>멸균 및 가단성 밀랍 및 이소프로필 팔미테이</td></tr>트 <tr><td>Buponorphine SR-Lab</td><td>ZooPharm</td><td>N/A</td><td>장기형 주사 가능한 진통제 5 mL (0.5 mg/mL) 폴리메트릭 제형</td></tr><tr><td>코튼 팁 어플리케이터</td><td>Puritan</td><td>25-806 10WC</td><td>멸균 긴 줄기 코튼 팁 어플리케이터</td></tr><tr><td>눈 연고</td><td>Puralube</td><td>17033-211-38</td><td>윤활 바셀린 및 미네랄 오일 기반 안과 연고</td></tr><tr><td>손난로 Hothands</td><td></td><td>HH2</td><td>공기 활성화 열 팩</td></tr><tr><td>이부프로펜</td><td>업 & 최대</td><td>094-01-0245</td><td>액체 현탁액에 5mL당 100mg</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein INC</td><td>1182097</td><td>마취제에 사용하기 위한 액체 마</td></tr>취제 <tr><td>메스</td><td>Integra Miltex</td><td>4-410</td><td>#10 일회용 메스 블레이드</td></tr><tr><td>스킨 접착제</td><td>Vetbond</td><td>1469SB</td><td>피부 안전 상처 접착제</td></tr><tr><td>멸균 드레싱</td><td>TIDI 제품</td><td>25-517</td><td>개별 포장된 멸균 드레이프</td></tr><tr><td>봉합</td>사 <td>Covidien</td><td>SP5686G</td><td>45cm 쐐기 5-0 모노필라멘트 폴리프로필렌 봉합</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>사<tr><td>Stereotaxic Unit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>High Speed Drill (Foredom)Kopf</td><td></td> <td>Model 1474</td><td>Max of 38,000 RPM</td></tr><tr><td>Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td><td>Kopf</td><td>Model 923-B</td><td>이빨 구멍과 노즈콘이 있는 마우스 바</td></tr><tr><td>파열 방지 이어바</td><td>Kopf</td><td>모델 922</td><td>마우스 애플리케이션에 적합한 이어바</td></tr><tr><td>입체 계측기</td><td>Kopf</td><td>모델 940</td><td>디지털 판독 모니터</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>가 있는 베이스 플레이트, 프레임 및 선형 스케일 어셈블리<tr><td><<강>인젝터/강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인젝터 바늘 및 주사기</td><td>Hamilton</td><td>80366</td><td>26 게이지 바늘, 51mm 바늘 길이 및 10 &mu; L 볼륨 주사기</td></tr><tr><td>Legato 130A 자동 주사기 펌프</td><td>KD Scientific</td><td>P/N: 788130</td><td>자동 인젝터</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>가 있는 프로그래밍 가능한 터치 스크린 베이스<tr><td>Anesthesia Machine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SomnoSuite 저유량 디지털 기화기</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>디지털 마취기</td></tr><tr><td>SomnoSuite Kent</td><td>Scientific</td><td>SOMNO-MSEKIT</td> 마우스용 스타터 키트<td>에는 인덕션 챔버, 마취 주사기 2개, 18인치 튜브, 플라스틱 노즈콘, 폐 마취 가스 캐니스터 2개가 포함되어</td></tr></tbody></table> 있습니다.

두개 내 주입 및 자기 공명 이미징을 통해 뇌 전이를 모델링

Modeling Brain Metastases Through Intracranial Injection and Magnetic Resonance Imaging

암의 전이성 확산은 질병 진행, 공격적인 암 아류형 및 /또는 늦은 진단의 불행한 결과입니다. 뇌 전이는 특히 파괴적이고 치료하기 어렵고 가난한 예후를 부여합니다. 미국에 있는 두뇌 전이의 정확한 부각은 추정하기 어려운 남아 있는 동안, 외두개 치료가 암 치료에 있는 더 효과적인 되기 위하여 계속됨에 따라 증가할 가능성이 높습니다. 따라서, 이 사이트에서 전이를 치료하기 위한 새로운 치료 접근법을 식별하고 개발할 필요가 있다. 이를 위해 암세포의 두개내 주사는 뇌전이를 모델링하는 잘 확립된 방법이 되고 있다. 이전에는 종양 성장을 직접 측정할 수 없는 것이 이 모델에 기술적 장애가 되었습니다. 그러나 자기 공명 영상(MRI)과 같은 작은 동물 이미징 양식의 가용성과 품질을 높이는 것은 시간이 지남에 따라 종양 성장을 모니터링하고 실험 기간 동안 뇌 내의 변화를 추론하는 능력을 크게 향상시키고 있다. 본명, 뮤린 유방 종양 세포의 두개 내 주입을 면역능력 마우스로 내하여 MRI가 입증된다. 제시된 사출 접근법은 이소플루란 마취와 디지털 제어, 자동 드릴 및 바늘 주입을 사용하여 정밀도를 향상시키고 기술적 오류를 줄이는 스테레오전술 설정을 활용합니다. MRI는 오하이오 주립 대학 제임스 종합 암 센터 작은 동물 화상 진찰 공유 자원에 있는 9.4 테슬라 계기를 사용하여 시간이 지남에 측정됩니다. 종양 부피 측정은 ImageJ의 사용을 통해 매 시점에서 입증됩니다. 전반적으로, 이 두개 내 주입 접근은 두뇌 전이의 드라이버에 새로운 가설을 시험하기 위하여 이 모형 시스템의 유용성을 크게 향상시키는 결합된 정확한 주입, 일상적인 감시 및 정확한 종양 부피 측정을 허용합니다.

도 3는 뮤린 유방 종양 세포의 두 시간 지점(7일 및 10일)에 단일 마우스에 대한 종양 부피 정량화를 간과한다. 이 실험을 위해, 50,000 DB7 세포가 주입되었고, 동물의 뇌는 MRI에 의해 평가되었다. 각 스캔에 대해 30개의 슬라이스(두께 0.5mm)가 캡처되었습니다. 스캔당 30슬라이스의 평가에 따르면 7일째 주사 후 5개의 슬라이스가 종양부담(도 3A)을나타내고 10일째에 주사 후 9슬라이스가 종양 부담(도3B)을나타냈다. 각 이미지는 설명된 바와 같이 종양 영역에 대해 평가되었고, 각 프레임에 대한 영역은 도 3C에묘사된다. 총 종양 부피는 슬라이스 두께에 대해 결정되고 조정됩니다. 도 4는 대표적인이미지(도 ...

두개 내 뇌 전이 모델링은 정확하고 시기 좋은 방법으로 치료에 종양 크기와 반응을 모니터링할 수 없다는 것에 의해 복잡합니다. 제시된 방법론은 자기 공명 화상 진찰 분석과 두개 내 종양 주입을 결합할 때, 정확하고 일관된 주사, 향상된 동물 감시 및 정확한 종양 부피 측정을 육성합니다.

Metastatic spread of cancer is an unfortunate consequence of disease progression, aggressive cancer subtypes, and/or late diagnosis. Brain metastases are ...

이 두개 내 주사 프로토콜은 정확한 주사, 일상적인 모니터링 및 정확한 종양 볼륨 측정을 허용하여 뇌 전이 메커니즘의 보다 효과적인 연구를 할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 간두개 종양 성장의 연쇄 모니터링을 허용한다는 것입니다. 절차를 보여주는 조나단 스페하르, 크기 모어 실험실에서 대학원 연구 동료, 안나 Bratasz, 오하이오 주립 대학 작은 동물 이미징 공유 자원에서 이미징 연구 과학자.절차를 시작하기 전에 드릴의 스테이지 잠금을 비틀어 드릴 비트 어댑터를 만들고 1밀리미터 드릴 비트를 드릴에 삽입하고 비트 잠금을 수동으로 조여 드릴을 잠급합니다. 드릴을 스테레오테프레임에 부착하고 디지털 인젝터 전달 속도를 분당 0.4 마이크로리터로 설정하고 두 개의 마이크로리터를 목표로 합니다. 페달 반사에 대한 반응의 부족을 확인한 후 마취 된 마우스를 프레임에 놓고 면 팁 어플리케이터의 무딘 끝을 사용하여 입 바의 쓰루에 치아를 배치하십시오.왼쪽 이어 막대를 왼쪽 귀의 내측 캔투스에 대고 두개골을 안정시키고 스테레오전술 프레임의 나사를 사용하여 두개골을 제자리에 고정시하십시오. 그런 다음 같은 방식으로 오른쪽 귀 막대와 두개골의 다른 쪽을 확보합니다. 칼변변경 창을 만들기 위해, 세 가지 순차적 교대 베타딘 용액과 70 %에탄올 스크럽으로 두피를 청소하고 처진 봉합선 다음 두개골의 중앙 중앙 측면을 따라 피부를 통해 3 mm 절개를 만들기 위해 멸균 메스를 사용합니다.멸균 드릴 비트를 bregma에 수직으로 식별하고 방향을 지정하여 디지털 vernier 스케일을 0으로 재설정하고 드릴 비트를 2밀리미터 측면으로 시상 봉합사및 1밀리미터 앞쪽으로 관상 봉합사에 이동시확인합니다. 드릴에서 피부를 멀리 이동하고 최고 속도를 사용하여 랜드 마크에주의를 기울이고, 조심스럽게 구멍을 드릴, 약 0.5 밀리미터 깊이, calvaria를 통해, 필요에 따라 멸균 식염수의 방울로 드릴 사이트를 냉각. calvarial 창이 만들어지면 드릴을 조심스럽게 들어 올리고 스테레오전술 프레임에서 드릴을 제거합니다.암세포 주입의 경우, 자동 인젝터 유닛을 스테레오전술 장치에 부착하고 DPBS에서 철저하게 재장매된 세포의 6~8마이크로리터를 멸균 해밀턴 주사기로 적재한다. 주사기를 인젝터에 적재하고 소량의 용액을 일회용 멸균 드레이프에 분배하여 주사를 위한 바늘을 프라이밍합니다. 면 팁 어플리케이터를 사용하여 주사기를 70% 에탄올로 닦고 바늘 끝을 칼변변 창 중앙에 맞추어 노출된 뇌에 거의 닿을 때까지 정렬합니다.디지털 버니어 스케일을 0으로 재설정하고 바늘을 뇌에 3밀리미터 깊이로 천천히 삽입합니다. 주입 부위에 세포 전달을 시작하기 위해 인젝터 화면에서 실행을 선택하기 전에 적어도 60 초 동안 뇌에 바늘을 둡니다. 모든 세포가 전달되었을 때, 바늘이 적어도 3 분 동안 뇌에서 휴식을 취하여 뇌 의 parenchyma가 분당 0.75 밀리미터의 속도로 뇌에서 바늘을 철회하기 전에 주사에 적응할 수 있도록 하십시오.종양 부담의 자기 공명 화상 진찰을 위해, 적당한 실험 시점에서 화상 진찰의 앞에 100 분, 표준 관면 주입에 의해 마우스에 체중 가돌리늄 기지를 둔 조영제의 20 그램 당 100 마이크로 리터를 관리합니다. 마우스 를 주입 후 마취시키고 마취 된 마우스를 가열 된 홀더에 놓습니다. 홀더를 마우스 뇌 표면 코일을 장착한 9.4 T 자석에 넣고 국소화 이미지를 얻습니다.그런 다음 T2 가중 희귀 시퀀스를 사용하여 마우스 뇌를 이미지하고 가돌리늄 기반 의 대비 T1 가중 희귀 시퀀스를 게시합니다. 총 종양 부피를 측정하기 위해 ImageJ에 대한 관심있는 MRI 데이터 파일을 열고 무료 손 선택 도구를 사용하여 종양 주위에 윤곽을 그립니다. 그런 다음 분석 탭을 열고 측정값을 선택하여 선택한 영역의 영역을 가져옵니다.특정 시점에서 개별 마우스에 대한 슬라이스를 포함하는 모든 종양이 평가되면 값을 적절한 데이터 분석 프로그램으로 내보냅니다. 여기서, 7일째및 10일째에 단일 마우스에 대한 종양 부피 정량화의 대표적인 개요를 관찰할 수 있다. 스캔 당 30 슬라이스의 평가는 이 분석을 위해, 7 일째 에 주사 후, 5 개의 조각은 종양 부담을 나타냈다는 것을 밝혔습니다.10일째되는 동안, 9개의 슬라이스는 종양 부담을 나타냈다. 각 이미지의 종양 영역은 그 때 입증된 대로 측정되었고, 시간이 지남에 따라 종양 부피의 변화를 추적할 수 있게 되었다. 각 세포주 및 각 받는 사람 마우스 모델은 고유하므로 이미징 정확도를 보장하기 위해 주입된 셀 수와 MRI 일정의 최적화가 필요합니다.이 절차에 따라, 뇌는 근본적으로 모든 다운 스트림 분석에 대 한 수확 될 수 있습니다., 단일 세포 격리 또는 조직 병리학 분석을 포함 하 여.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 두개내 주사를 수행하여 쥐의 뇌에 종양 세포를 이식하는 방법을 보여줍니다.

두개내 정소성 모델: 마우스 뇌에 암세포를 이식하는 절차

이 비디오는 형광 표지된 암세포의 경동맥내 주입에 의한 뇌 전이 마우스 모델의 확립을 보여줍니다. 마우스 모델은 새로운 치료법의 효과와 근본적인 생리학적 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

Brain Metastasis Mouse Model: 경동맥내 암세포 주입에 의한 뇌 전이 마우스 모델을 생성하는 방법

출처: Lim, M., et al. 암세포의 내부 경동맥 주입에 의한 뇌 전이 모델링. J. Vis. Exp. (2022)이 영상에서는 마취된 쥐가 암세포를 총경동맥(CCA)에 주입하여 뇌로의 표적 전달을 촉진하는 수술을 받습니다. 이 시술에는 경동맥의 정확한 봉합 및 조작이 포함되어 주입된 세포를 내부 경동맥(ICA)으로 향하게 하여 시간이 지남에 따라 뇌의 종양 형성을 촉진합니다.

암세포의 내부 경동맥 주입을 통한 뇌종양 전이 모델링

유방암 뇌 전이의 마우스 모델은 MDA-MB231/Br-GFP 세포의 초음파 영상 유도 심장 내 주입으로 설정됩니다. 다 초점 두개 내 전이의 개발은 고해상도 9.4 T MRI를 사용하여 세로 방향으로 모니터링하고있다.

종 MRI에 이어 유방암 뇌 전이 마우스 모델을 개발하기 위해 초음파 영상 유도 심장 내 주입

치료 옵션을 완화 남아있는 동안 그 빈도는 증가로 뇌 전이는 긴급 충족되지 않은 의료 요구되고있다. 암 세포의 intracarotid 동맥 주입을 통해 뇌 전이의 실험 동물 모델을 만들기 소설 개입 요법의 질병 생물학 및 평가의 기계론의 연구를 용이하게한다.

Intracarotid 암 세포 주입 뇌 전이의 마우스 모델을 제작하기

우리는 내인성 HER2 증폭 염증성 유방암 세포주의 꼬리 정맥 주사를 통해 생성된 유방암 뇌 전이의 이종이식 마우스 모델을 설명합니다.

염증성 유방암 세포의 꼬리 정맥 주입을 통한 뇌 전이 모델링

뇌 전이는 암 환자의 심각한 이환율과 사망률의 원인입니다. 대부분의 뇌 전이 마우스 모델은 사망률 및 치료 개입 결과의 혼란 분석을 혼란시키는 전신 전이에 의해 복잡합니다. 여기에 제시된 것은 최소한의 전신 종양으로 일관된 두개 내 종양을 생성하는 암세포의 내 경동맥 주사를위한 프로토콜입니다.

암세포의 내경동맥 주입에 의한 뇌전이 모델링

입체정위 두개내 주입 기법은 종양 세포를 마우스 피질에 정밀하고 국소적으로 이식할 수 있게 하여 뇌의 전이 정착 연구에 강력한 모델이 됩니다.

뇌 전이 모델링: 입체정위 피질 내 주사를 통한 전이 정식 집락화 및 조직학적 성장 패턴 분석

이 원고는 실험적인 뼈 전이를 확립하기 위해 뼈를 포함한 뒷다리 조직에 암세포를 특이적으로 전달하는 기술인 장골 내 동맥(IIA) 주입의 자세한 절차를 제공합니다. 처음에는 유방 종양 모델로 확립되었지만, 이 프로토콜은 다른 암 유형으로도 쉽게 확장될 수 있습니다.

현미경 뼈 전이의 효율적이고 선택적 모델링을위한 내부 장골 동맥 주입

후속 샘플 용해를 통한 동적 핵 분극은 생물학적 시스템의 신진대사에 대한 실시간 연구를 가능하게 했습니다. 과분극[1-13C]피루브산은 in vitro에서 전립선 암종 세포주에서 젖산 탈수소효소 활성을 연구하는 데 사용되었습니다.

과분극 (13) C 대사 자기 공명 분광학 및 이미징

학습하세요 두개내 종양 주입 및 MRI를 활용한 뇌 전이 모델링 방법을. 정확한 종양 부피 측정과 일련의 성장 모니터링이 가능하여 뇌 전이 메커니즘 연구에 효과적입니다.

두개 내 주입 및 자기 공명 이미징을 통해 뇌 전이를 모델링

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