Name: Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization(시신경엽 시각화를 위한 유충 및 성체 초파리 뇌의 해부, 면역조직화학 및 마운팅) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: 학습하세요 초파리 뇌 해부, 면역조직화학 및 마운팅 기법을 통해 시신경엽 구조를 시각화하는 방법을. 유충 및 성체 Drosophila 뇌의 3차원 구조를 명확하게 관찰할 수 있습니다.

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Bsh 항체의 부분 표본을 공유해 주신 Claude Desplan에게 감사드립니다. DE-Cadherin, Dachshund, Eyes Absent, Seven-up 및 Bruchpilot 단클론 항체는 NIH의 NICHD에 의해 만들어지고 아이오와 대학교 생물학과, 아이오와 시티, IA 52242에서 유지 관리되는 발달 연구 하이브리도마 은행에서 획득되었습니다. 이 연구는 T.E.에게 수여된 NSERC 디스커버리 그랜트(NSERC Discovery Grant)의 지원을 받았습니다. U.A.는 NSERC Alexander Graham Bell Canada Graduate Scholarship의 지원을 받습니다. PV는 온타리오 대학원 장학금의 지원을 받습니다.

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<li>Bertet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+patterning+of+neuroblasts+controls+notch-mediated+cell+survival+through+regulation+of+hid+or+reaper%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Temporal patterning of neuroblasts controls notch-mediated cell survival through regulation of hid or reaper.</a> Cell. 158, 1173-1186 (2014).</li>
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</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

이 프로토콜에서는 유충 및 성체 초파리의 뇌를 면역염색하고 여러 방향으로 장착하는 방법을 설명합니다. 유충과 성충의 뇌를 염색하는 방법은 이전에 설명되었지만22,23,24,27,28 특정 시신경 구조를 최적으로 시각화하기 위한 장착 전략은 주목을 덜 받았다 28. 여기에 설명된 프로토콜은 연구자들에게 장착 방향과 시각화된 시신경 엽 구조 간의 관계에 대한 더 큰 이해를 제공할 것으로 예상됩니다.
이 프로토콜에 설명된 방향 외에도 성충 및 유충 시신경 시각화의 대체 각도는 시신경엽을 중앙 뇌에서 분리함으로써 달성할 수 있습니다. 시신경...

겹눈과 기저 시신경엽으로 구성된 초파리 시각 시스템은 신경 회로 발달 및 기능 연구를 위한 훌륭한 모델이었습니다. 최근 몇 년 동안 특히 시신경엽은 신경 발생 및 회로 배선 1,2,3,4,5,6,7,8과 같은 신경 발달 과정을 연구하는 강력한 시스템으로 부상했습니다. 그것은 4 개의 신경 필로 구성됩니다 : lamina, medulla, lobula 및 lobula plate (후자의 두 개는 소엽 복합체를 구성)1,2,3,4,5,6. 눈의 광수용체는 박판(lamina)과 수질(medulla)의 뉴런을 표적으로 하여 시각적 입력을 처리하고 소엽 복합체 1,2,3,4,5,6의 뉴로pils로 전달합니다. 소엽 복합체(lobula complex)의 투영 뉴런(projection neuron)은 이후 시각 정보를 중추 뇌(central brain) 1,5,9의 고차원 처리 센터로 보냅니다. 시신경의 복잡한 조직은 망막근시를 유지하고 다양한 유형의 시각적 자극을 처리해야 할 필요성에 의해 필요하기 때문에 정교한 신경 회로가 어떻게 조립되는지 연구하는 데 매력적인 시스템입니다. 특히, 수질은 오랫동안 척추 신경 회로 발달의 모델이었던 신경 망막과 그 조직과 발달 모두에서 놀라운 유사성을 공유합니다 3,8.
시신경 엽 발달은 배아 발생 중에 시작되며, 시신경 플라코드 2,4,5,6,7,8을 형성하는 ~35개의 외배엽 세포의 사양이 지정됩니다. 유충 부화 후, 시포는 두 개의 뚜렷한 원시골로 세분됩니다: 1) 층막과 외골의 뉴런을 생성하는 외부 증식 센터(OPC)와 2) 내부 수질과 소엽 복합체 4,5,6,10의 뉴런을 생성하는 내부 증식 센터(IPC). 후기 2차 인스타 유충에서 OPC 및 IPC의 신경 상피 세포는 신경 아세포로 변형되기 시작하여 중간 신경절 모세포 4,5,11,12를 통해 신경 세포를 생성합니다. 시신경 엽 신경 아세포는 공간적 및 시간적으로 제한된 전사 인자에 의해 패턴화되며, 이들은 함께 작용하여 자손에서 신경 다양성을 생성합니다 11,12,13,14. 번데기에서 시신경 엽의 회로는 프로그램 된 세포 사멸11,15, 신경 세포 이동12,16, 축삭 / 수지상 표적10,17, 시냅스 형성(18,19) 및 신경 필 회전10,17을 포함한 여러 과정의 조정을 통해 조립됩니다.
여기에서는 유충과 성충의 뇌를 절개하고, 면역 염색하고, 시신경엽을 이미징하기 위해 장착하는 방법을 설명합니다. 시신경엽의 복잡한 3차원 구조를 감안할 때, 시신경엽을 분석하려면 시신경엽의 성체 신경세포와 유충 전구세포가 서로에 대해, 그리고 중추 뇌에 대해 어떻게 위치해 있는지 이해해야 합니다. 따라서 우리는 장착 방향이 시신경엽 구조의 공간 조직과 어떻게 관련되는지에 특히 중점을 둡니다. 유충 뇌(전방, 후방 및 측방)를 위한 세 가지 장착 전략과 성체 뇌를 위한 세 가지 장착(전방, 후방 및 수평)을 설명하며, 각 전략은 특정 시신경엽 전구 개체군 또는 신경생물을 이미징하기 위한 최적의 각도를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>Bioshop</td><td>PBS405</td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>Bioshop</td><td>FOR201</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 (염소) 보조</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td>1:500 사용</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 (마우스) 보조</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td><td>1:500 사용</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (기니피그) 보조</td><td>Invitrogen</td><td>A-21450</td><td>1:500 사용</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 (rat) secondary</td><td>Invitrogen</td><td>A-21247</td><td>1:500</td></tr><tr><td>커버 슬립</td><td>VWR</td><td>48366-067</td><td></td></tr><tr><td>해부 겸자 - # 5</td><td>Dumont</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>해부 겸자 - # 55</td><td>Dumont</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>해부 접시</td><td>Corning</td><td>722085</td><td></td></tr><tr><td>드라이 와이프</td><td>Kimbery Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>염소 항-Bgal 1차 항체</td><td>Biogenesis</td><td></td><td>1:1000</td></tr>에 <tr><td>사용 기니피그 항-Bsh 1차 항체</td> 1<td>:500에</td><td>Claude Desplan</td><td></td>의 선물</tr> 사용 <tr><td>기니피그 항-Vsx1 1차 항체</td><td>Erclik et al. 2008</td><td></td><td>1:1000에 사용</td></tr><tr><td>실험실 필름</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.600</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR</td><td>CA4823-180</td><td></td></tr><tr><td>마우스 anti-dac primary antibody</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)</td><td>mabdac2-3</td><td>1:20</td></tr><tr><td>마우스 anti-eya 1차 항체</td><td>DSHB</td><td>eya10H6</td><td>1:20</td></tr><tr><td>마우스 anti-nc82 1차 항체</td><td>DSHB</td><td>nc82</td><td>1:50</td></tr><tr><td>마우스 anti-svp primary antibody</td><td>DSHB</td><td>Seven-up 2D3</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Polymer Clay</td><td>사용 가능 모든 유형의 점토 사용</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti-GFP</td><td>Invitrogen</td><td>A-11122</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Rat anti-DE-Cadherin 1차 항체</td><td>DSHB</td><td>DCAD2</td><td>1:20</td></tr><tr><td>Slowfade 마운팅 배지</td><td>Invitrogen</td><td>S36967</td><td>Vectashield 장착 매체(cat# H-1000)도 사용할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td>Triton-x-100</td><td>Bioshop</td><td>TRX506</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection, immunohistochemistry and mounting of larval and adult drosophila brains for optic lobe visualization(시신경엽 시각화를 위한 유충 및 성체 초파리 뇌의 해부, 면역조직화학 및 마운팅)

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization

초파리 시신경엽( Drosophila optic lobe)은 4개의 신경세포(lamina, medulla, lobula 및 lobula plate)로 구성되어 있으며, 신경 다양성을 생성하고 회로 조립을 주도하는 발달 메커니즘을 탐구하기 위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 시신경엽의 복잡한 3차원 구조를 감안할 때, 시신경엽을 분석하려면 시신경엽의 성체 신경세포와 유충 전구세포가 서로에 대해, 그리고 중추 뇌에 대해 어떻게 위치해 있는지 이해해야 합니다. 여기에서는 시신경 이미징을 위한 유충 및 성충 뇌의 절개, 면역 염색 및 장착을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 장착 방향과 시신경엽의 공간 조직 사이의 관계에 특히 중점을 둡니다. 유충의 세 가지 장착 전략(전방, 후방 및 측방)과 성충의 세 가지 장착 전략(전방, 후방 및 수평)에 대해 설명하며, 각 전략은 뚜렷한 시신경 구조를 위한 이상적인 이미징 각도를 제공합니다.

프로토콜에 설명된 방향으로 장착된 유충 및 성체 시신경엽의 공초점 이미지는 그림 1 과 그림 2에 나와 있습니다.
그림 1은 전방, 후방 및 측방 방향으로 위치한 유충 뇌의 개략도와 대표적인 공초점 절편을 보여줍니다. 전방 장착 방향에서는 OPC 상피(DE-Cadherin), 수질 신경아세포(deadpan&gt;βgal) 및 층판 뉴런(Dachshund)이 뇌를 감싸는 세포 띠로 표면에 나타납니다(그림 1B,D). OPC는 전사 인자 6,11,12의 차등 발현에 의해 등쪽/배쪽 축...

이 프로토콜은 이미징을 위해 유충 및 성체 초파리 시신경엽을 준비하는 세 가지 단계인 1) 뇌 절개, 2) 면역조직화학, 3) 장착을 설명합니다. 3단계에 중점을 두었는데, 이는 특정 시신경엽 구조를 시각화하기 위해 뚜렷한 장착 방향이 필요하기 때문입니다.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization(시신경엽 시각화를 위한 유충 및 성체 초파리 뇌의 해부, 면역조직화학 및 마운팅)

The Drosophila optic lobe, comprised of four neuropils: the lamina, medulla, lobula and lobula plate, is an excellent model system for exploring the ...

우리는 시신경엽에 특히 중점을 두고 유충 및 성체 초파리의 뇌를 절개, 면역 염색 및 장착하는 프로토콜을 설명합니다. 시신경엽의 복잡한 3차원 구조를 감안할 때, 여기에 설명된 프로토콜은 연구자들이 장착 방향과 시각화된 시신경엽 구조 간의 관계를 더 잘 이해할 수 있도록 할 것으로 예상됩니다. 이 프로토콜은 유충 및 성체 시신경엽에 대한 세 가지 장착 전략을 설명하며, 각 전략은 이미징 중 특정 시신경엽 구조를 시각화하기 위한 최적의 각도를 제공합니다.해부를 시작하기 전에 3개의 웰 플레이트의 모든 웰을 웰당 400마이크로리터의 PBS로 채우고 집게를 사용하여 초파리 바이알 또는 병 내부를 기어 다니는 15개의 떠돌이 제3 인스타 유충을 부드럽게 선택합니다. 모든 유충을 세 개의 웰 플레이트의 첫 번째 웰에 놓고 한 유충을 플레이트의 중간 웰로 옮깁니다. 우세하지 않은 손을 사용하여 우물 바닥에서 유충의 몸을 구속하고 우세한 손을 사용하여 유충 입 고리를 부드럽게 잡습니다.입 고리를 몸에서 당겨 뇌를 제거합니다. 그런 다음 상상 디스크를 포함한 부속 조직을 제거합니다. 그런 다음 뇌를 접시의 세 번째 우물에 넣습니다.모든 뇌를 절개한 후에는 P200 피펫을 사용하여 세 번째 웰에서 PBS를 조심스럽게 제거하고 뇌가 물에 잠길 수 있을 만큼의 용액만 남깁니다. 500 마이크로 리터의 갓 준비된 냉간 고정 용액을 우물에 추가하십시오. 뇌가 접시 안에서 소용돌이치도록 집게로 용액을 부드럽게 저어주고 유리 현미경 슬라이드로 우물을 덮습니다.그런 다음 접시를 얼음 위에 30분 동안 올려 티슈를 고정합니다. 세척 당 400 마이크로 리터의 신선한 PBS와 트리톤으로 뇌를 5 번 씻으십시오. 뇌는 이제 1차 항체 배양을 할 준비가 되었습니다.성체 뇌 해부의 경우, 10-15마리의 성체 파리를 마취하고 얼음 위에서 실험실 닦음에 올려 놓습니다. 집게를 사용하여 날개를 가진 성인 파리 한 마리를 400 마이크로 리터의 PBS가 들어있는 3 웰 해부 플레이트의 한 웰로 부드럽게 옮깁니다. 주로 사용하지 않는 손에 한 쌍의 집게를 사용하여 파리의 흉부를 우물 바닥에 대고 잡고 주로 사용하는 손으로 초미세 집게를 사용하여 몸의 나머지 부분에서 머리를 부드럽게 잡아당깁니다.시체를 실험실에 버리고 우세하지 않은 손으로 닦고 우세한 손을 사용하여 주둥이로 우물 바닥에 머리를 고정합니다. 양쪽 집게를 사용하여 뇌가 노출될 때까지 눈 사이의

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연구

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Developmental Biology

발생생물학

여기 GFP 태그 glial 세포와 결합하여 라이브 미세 분석을 사용하여 개발 Drosophila의 눈을 glial 세포의 마이 그 레이션을 검사하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

Drosophila 아이 Imaginal 디스크에 Glial 세포 이미징 마이 그 레이션 라이브

애벌레의, Pupal 및 성인의 해부 및 Immunohistochemistry<em&gt; Drosophila</em&gt; 망막

이 비디오는 성체 파리의 온전한 뇌를 다리 슬라이드 아래에 장착하는 방법을 설명하고 형광 현미경 검사를 위해 면역 염색된 뇌에 수행되는 프로토콜을 보여줍니다.

성인 초파리 뇌 장착: 컨포칼 이미징을 위한 슬라이드를 준비하는 방법

면역염색은 조직 내의 특정 세포 유형과 단백질을 시각화하는 효과적인 기술입니다. 초음파 처리를 활용함으로써, 여기에 설명된 프로토콜은 면역 염색 전에 후기 단계의 배아와 유충에서 Drosophila melanogaster 조직을 해부해야 할 필요성을 완화합니다. 우리는 포름알데히드가 고정된 전체 산 유충의 면역 염색을 위한 효율적인 방법론을 제공합니다.

늦게 단계 배아와 애벌레의 초음파 - 촉진 면역 형광 염색<em&gt; 초파리</em&gt; 조직<em&gt; 제자리에서</em

이 프로토콜은 그대로 애벌레 뇌의 맥락에서 라이브 세포 이미징을 수행하는 데 사용하는 효율적인 방법을 자세히 설명합니다. 라이브 세포 이미징 방식은 지속적으로 이전에 간과 된 메커니즘을 밝혀, 비대칭 신경 줄기 세포 분열의 연구뿐만 아니라 다른 신경 인성과 발달 과정에 대한 귀중한 있습니다.

의 라이브 영상<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 Neuroblasts

초파리의 성체 구조는 상상 원반이라고 하는 주머니와 같은 구조에서 파생됩니다. 이러한 디스크의 분석은 조직 결정, 구획 경계 설정, 세포 증식, 세포 운명 사양 및 평면 세포 극성을 포함한 많은 발달 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 프로토콜은 광/형광 현미경 검사를 위해 가상 디스크를 준비하는 데 사용됩니다.

해부하고, 상상 디스크의 면역 염색에서 초파리

성인 초파리 뇌는 신경 회로, 높은 뇌 기능, 복잡한 질환 연구를위한 유용한 시스템이다. 효율적인 방법은 뇌 기반 연구를 용이하게 작은 비행 머리에서 전체 뇌 조직을 해부한다. 여기에 우리가 잘 보존 된 형태와 성인 두뇌의 간단한 한 단계 해부 프로토콜을 설명합니다.

간단한 한 단계 성인의 전체 마운트 준비에 대한 해부 프로토콜<em&gt; 초파리</em&gt; 두뇌

이 프로토콜 설명 해 부와 성인 초파리 melanogaster 의 immunostaining 뇌 조직. 특히,이 프로토콜은 신경 개발의 많은 측면을 기본 일반적인 원리를 밝히기 위해 정확 하 게 사용할 수 있는 예제 신경 하위 집합으로 초파리 버섯 몸과 포토 리셉터 뉴런의 사용을 강조 표시 합니다.

해 부 및 Immunofluorescent 얼룩의 버섯 몸과 성인 초파리 melanogaster 두뇌 신경 세포 포토 리셉터

이 문서는 초파리 번데기 망막 조직의 immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 추출에 대 한 처리에 대 한 프로토콜 함께 해 부에 대 한 수술 메서드를 제공 합니다.

Immunohistochemistry, 서쪽 분석 및 RNA 격리에 대 한 초파리 번데기 망막의 해 부

이 연구는 참수, 고정, 동결 절제, 형광 염색, 면역 염색 및 이미징을 포함하는 조직 처리를 위한 단순화된 프로토콜을 제시하며, 이는 공초점 및 다광자 이미징으로 확장될 수 있습니다. 이 방법은 복잡한 해부에 필적하는 효능을 유지하며 고급 운동 기술의 필요성을 우회합니다. 정량적 이미지 분석은 광범위한 조사 잠재력을 제공합니다.

향상된 뇌 형광 염색 및 면역 염색을 위한 초파리 머리의 직접 동결 절편

학습하세요 초파리 뇌 해부, 면역조직화학 및 마운팅 기법을 통해 시신경엽 구조를 시각화하는 방법을. 유충 및 성체 Drosophila 뇌의 3차원 구조를 명확하게 관찰할 수 있습니다.

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization(시신경엽 시각화를 위한 유충 및 성체 초파리 뇌의 해부, 면역조직화학 및 마운팅) (동영상) | JoVE Journal

Dissection, Immunohistochemistry and Mounting of Larval and Adult Drosophila Brains for Optic Lobe Visualization(시신경엽 시각화를 위한 유충 및 성체 초파리 뇌의 해부, 면역조직화학 및 마운팅)

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