Name: 낭포성 섬유증 얼룩말 피시 태아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염을 중화하는 파지 치료 응용 프로그램 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 배우세요 낭포성 섬유증 얼룩말 피시 태아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염을 중화하는 파지 칵테일 준비 및 투여 방법을. 이 기술은 생체 내 파지 효능 평가에 활용됩니다.

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이 작품은 이탈리아 낭포성 섬유증 재단 (FFC #22/2017)에 의해 지원되었다; 아소시아지오네 "글리 아미치 델라 리티" 카스키고와 FFC #23/2019; 피우 온루스 라 마노 테사 온루스에서 Un respiro).

AB 균주(유럽 제브라피시 자원 센터 EZRC)의 성인 제브라피쉬(Daniorerio)는국제(EU 지침 2010/63/EU) 및 국가 지침(2014년 3월4일, n.26)에 따라 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호에 따라 유지됩니다. 표준 조건은 28 ° C에서 빛 / 10 h 어두운 주기와 탱크 수온의 14 h와 물고기 시설에서 설정됩니다.
1. 솔루션 및 도구 준비
<ol><li>성장하는 제브라피시 배아를 위한 E3 배아 배지에 대한 50배 스톡 솔루션과 1배 작동 용액을 준비한다(표 1참조).</li>
	<li>색소 침착 차단 용액을 만들고, 배아 색소 침착을 24 시간 후 수정 (24 hpf)에서 차단합니다 (표 1참조).</li>
	<li>표 1에설명된 대로 25배 스톡 및 1배 작동 트리케인 마취용액을 준비한다. 참고: 재고 용액을 손상시킬 수 있는 용액의 반복된 동결 및 해동을 피하기 위해 25x 트리카인 2mL의 알리쿼트(aliquots)를 만들어 -20°C에 보관하십시오.</li>
	<li>마이크로 웨이브 플라스크 또는 병에 증류 된 H2O의 100 mL에서 아가로즈 1 g을 용해하여 배아 미세 주입을위한 트랙을 준비합니다. 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 1-3분 간 전자레인지에 조리합니다.</li>
	<li>페트리 접시(90mm x 15mm)에서 제브라피쉬 미세 주입 금형(재료 표참조)을 배치하고 약 10mm 너비의 액체 아가로즈 젤을 부어 표면 전체를 덮습니다.</li>
	<li>아가로즈가 고화되면 금형을 제거합니다. 페트리 접시를 1x E3 배아 배지로 채웁니다. 이는 약 1주일 동안 4°C로 저장할 수 있다. 사용하기 전에 트리카인을 함유한 신선한 E3 배지로 교체하십시오. 참고: 오래된 곰팡이는 곰팡이 또는 세균 오염을 일으킬 수 있습니다.</li>
	<li>10cm 의 보로실리케이트 모세혈관을 사용하여 미세 주입을 위한 바늘을 준비하고 손잡이를 조여 마이크로 피펫 풀러에 고정하십시오. 다음 설정으로 풀러를 설정 : 열 500, 속도 100, 시간 150, 당기 150.</li>
</ol>2. P. 아에루기노사 (PAO1) 접종 준비
<ol><li>GFP+P. aeruginosa 균주 PAO119 의 5 mL에서 (표 1참조) 및 흔들림 (200 rpm)으로 37 °C에서 하룻밤 성장한다.</li>
	<li>위의 하룻밤 배양을 LB 국물의 10mL에서 OD600 = 0.1로 희석하고 흔들림(200 rpm)으로 37°C에서 OD600 = 0.5로 자랍니다.</li>
	<li>원심분리기 2mL은 16,100 x g에서 4°C에서 2분 동안 배양하고 세포 펠릿을 OD600 =1로 재보설하고, 약 1 x 109 cfu/mL에 상응하는 1mL의 생리용액(표 1참조).</li>
	<li>생리용액에 약 5 x 107cfu/mL로 세포 현탁액을 희석하고 4°C에 보관하십시오.</li>
</ol>3. 파지 재고 준비
<ol><li>P. aeruginosa 균주 PAO1의 접종 1 콜로니 5 mLLB 국물의 5 mL에서 및 흔들림과 함께 37 °C에서 하룻밤 배양. 하룻밤 문화를 500mLLB 국물에600 = 0.01로 희석하고 37°C에서 OD600 = 0.05로 흔들리면 약 2.5 x 107 cfu/mL에 해당한다.</li>
	<li>P. aeruginosa의희석 된 배양에,10-3의감염 (M.O.I.)의 복합성을 얻기 위해 약 1.25 x 107 파지를 추가합니다. 37°C에서 OD600이 약 0.1-0.3으로 떨어질 때까지 흔들어 서 배양한다(사용된 파지에 따라 약 3~5시간). 참고: PAO1 균주를 감염시키는 이 실험에는 포도비리대 2개, 젠뱅크 가입 번호 vB_PaeP_PYO2, MF490236, vB_PaeP_DEV, MF490238, vB_PaeP_DEV, MF490238, 2개의 묘비리대, vB_PaeM_E215, MF490241, vB_PaeM_E217, MF490240을 감염시키는 실험에 4개의 파오가 선정되었습니다. 각 파지에 대해 아래 단계를 개별적으로 수행합니다.</li>
	<li>37°C에서 30분 동안 DNase 및 RNase의 1 mg/mL로 용해를 배양합니다. 원심분리기는 5,000 x g에서 4°C에서 30분 동안 조심스럽게 상류체(SN)를 복구합니다. 0.8 μm 모공 직경을 갖는 필터로 SN을 필터링합니다.</li>
	<li>SN에 58 g/L의 NaCl과 105 g/L의 PEG6000을 추가하십시오. RT 20분에서 교반하여 녹인 다음 밤새 4°C로 유지하십시오. 파지 강수량에 대한 4 °C에서 30 분 동안 20, 000 x g에서 원심 분리기. SN을 제거하고 TN 버퍼의 15mL에서 파지 펠릿을 조심스럽게 용해하십시오(표 1참조).</li>
	<li>아래 단계에 설명된 대로 CsCl 밀도 그라데이션으로 파지를 정화합니다.<ol>
<li>SW41 로터용 폴리알로머 초원심분리기 튜브에서 표 1에설명된 4개의 CsCl 솔루션 중 2mL를 계층화하여 CsCl 단계 밀도 그라데이션을 준비한다.  4개의 튜브 각각에 3.5mL의 파지 서스펜션을 추가합니다. 참고 : CsCl은 독성, 처리하고 폐기하는 적절한 안전 절차를 채택한다.</li>
		<li>튜브를 로터에 도입하고 튜브가 균형을 이루도록 하십시오(두 개의 면관 간의 중량 차이는 0.01g≤).</li>
		<li>4°C 및 100xg(SW41 로터의 경우 25,000rpm)에서 2시간 동안 원심분리기. x g 원심 분리 후 튜브를 천천히 제거하고 조심스럽게 지지에 고정시하십시오. 19 G 바늘주사기를 사용하여 일반적으로 d=1.5와 d=1.4 밀도 영역 사이에 위치한 흰색/오팔레센트 밴드를 그립니다.</li>
		<li>주사기에서 SW60 로터의 새로운 폴리알로머 튜브로 서스펜션을 전송하고 d=1.4 솔루션을 사용하여 튜브의 균형을 정밀하게 조정합니다.</li>
		<li>적어도 16h에 대해 4°C 및 150,000xg(SW60 로터의 경우 38,000rpm)에서 서스펜션을 원심분리한다. x g</li>
		<li>위와 같이 보이는 밴드를 수집하고(3.3.3 단계 참조) 6,000 Da 컷오프로 투석 튜브로 옮길 수 있습니다. 얻어진 가시대2x는 500mL의 물에 대해 20분, TN 버퍼 500mL에 대해 하룻밤 동안 2배나 투석을 한다. 0.22 μm 모공 필터로 필터링하고 4 °C에서 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 파지 칵테일 준비
<ol><li>이전에 격리되고 특징인8인변형 PAO1을 감염시키는 4개의 파지를 혼합합니다. 혼합하기 전에 각 파지 스톡의 티터를 플라크분석20으로추정한다.</li>
	<li>파지 칵테일을 5× 108 pfu/mL의 전체 티터로 조립하여 각 실험 직전에 동일한 pfu/mL에서 4개의 파지 제제를 동등하게 혼합하여 정확한 파지 티터를 보장합니다.</li>
</ol>5. cftr morpholinos 미세 주입을위한 제브라피시 배아의 수집 및 준비
참고: cftr 모르폴리노스(cftr-MOs) 미세 주입을cftr위해 야생형 제브라피시로부터 1-2세포 배아를 수집합니다.
<ol><li>세균성 미세 주입 실험 이틀 전에, 번식 쌍을 설정하고 이전에 설명된 바와 같이 배아를수집21. AB 균주의 성인 제브라피쉬(Daniorerio)는유럽 의 제브라피시 자원 센터, EZRC에서 구입하였다.</li>
	<li>다음 날, 플라스틱 파이펫으로 수정 직후 또는 미세 메쉬 여과기를 사용하여 배아를 수집합니다. 수집된 배아를 E3 배아 배지를 함유한 페트리 접시에 놓고 플라스틱 파이펫으로 이물질을 조심스럽게 제거하여 배아 발달을 손상시킬 수 있는 오염을 피하십시오.</li>
	<li>멸균수에 2개의 모르폴리노 주식 용액(1mM)을 최종 농도0.25 pmol/embryo ATG-MO +0.25 pmol/embryo 스플라이스-MO로 희석하여 모르폴리노 주입 용액 5μL을 준비한다. 배아 주입을 추적하려면, 모르폴리노 주입 용액 믹스에 페놀 레드의 0.5 μL을 추가한다.</li>
	<li>미세 젤 로딩 팁이 있는 20 μL 마이크로피펫을 사용하여 모르폴리노 믹스 용액의 약 5μL로 마이크로 주입 바늘을 적재합니다. 스탠드에 연결된 미세 조작기에 바늘을 고정하고 스테레오 현미경 으로 배치합니다. 참고 : 마이크로 인젝터 펌프의 압력이 밀어 붙이기 때문에 용액이 바늘 끝에 도달 할 필요가 없습니다.</li>
	<li>바늘 끝을 미세한 멸균 핀셋으로 절단하여 바늘 끝을 잘라냅니다. 현미경의 안구에 있는 스케일 바를 사용하여 낙하의 직경을 측정합니다. 또는, 마이크로미터 슬라이드에 미네랄 오일 한 방울을 만들고 액수를 오일 드롭에 주입하여 미세 주입 량을 설정하여 액적 크기를 평가합니다. 직경 156μm의 낙하를 사용하여 2nL의 부피를 주입하십시오.</li>
	<li>보상 압력을 15hPa로 조정하여 마이크로인젝터를 설정하고, 주입 시간0.5초로, 300~600hPa 사이의 사출 압력을 사용하여 사용되는 바늘에 따라 정확한 사출 량을 얻을 수 있다.</li>
	<li>플라스틱 파이펫으로 배아는 5.2 단계에서 96mm 직경의 페트리 접시에 놓인 유리에 배아를 배치합니다. 참고: 너무 많은 E3 배지는 배아의 초리온으로 미세 주입 바늘의 적절한 침투를 방지할 수 있습니다.</li>
	<li>이전에설명된 바와 같이 2nL을 배아에 주입하는 바늘로 초리온및 노른자를 관통한다.</li>
	<li>주입된 배아를 E3 배지로 페트리 접시에 넣고 28°C의 인큐베이터에 넣어 다음 날까지 개발할 수 있도록 합니다.</li>
</ol>6. 박테리아와 파지 칵테일을 곁들인 제브라피시 배아의 미세 주입
참고: 전신 감염을 수행하기 위해 배아는 일반적으로 26 hpf 후에 시작되는 혈액 순환이 있어야합니다.
<ol><li>후 26 hpf (제브라피시 발달 단계는 Kimmel21을참조) pronase 용액을 가진 비반향 배아 는 2 mg / mL의 농도에서 E3 배지에서 pronase 분말을 용해하여 제조. 배아를 부드럽게 피펫하여 초리온을 부러뜨린다. pronase/E3 매체를 버리고 신선한 E3로 접시를 여러 번 헹군모든 pronase를 제거합니다.</li>
	<li>주사 전에 트리카인을 함유하는 E3 배지에서 제브라피시 배아를 마취시킵니다.</li>
	<li>마취배아를 1단계에서 준비한 트랙으로 피펫한다. 미세 겔 로딩 팁을 사용하여 배아를 측면 위치에 배치합니다.</li>
	<li>5부에 설명된 바와 같이 P. aeruginosa 제제의 약 5 μL을 가진 미세 주입 바늘을 적재한다.</li>
	<li>바늘을 큐비어 덕트의 시작점에 등대 삽입하여 노른자 낭 위로 퍼지기 시작합니다. 1-3 nL의 부피를 주입하고 볼륨이 덕트 내에서 직접 확장하고 순환으로 들어가는지 확인합니다.</li>
	<li>매 50개의 주입 배아 후에, 1.5mL 원심분리기 관에 100 μL의 멸균 PBS를 주입하여 주사 부피가 동일하게 유지되었는지 확인합니다. LB 한천에 접종을 플레이트 (표 1참조) 37 °C 하룻밤 CFU를 평가하기 위해.</li>
	<li>마이크로 주입 된 배아를 신선한 E3 배지 + PTU로 두 개의 깨끗한 페트리 접시에 옮기고 28 ° C에서 배양하십시오.</li>
	<li>두 개의 선택된 시간 지점에서: 세균 주사 후 30 분 또는 3 시간, 인큐베이터에서 세균 주입 배아와 페트리 접시 중 하나를 꺼내 파지 칵테일 주입에 대한 6.3에 설명 된 대로 트랙에 정렬.</li>
	<li>파지 칵테일의 약 5 μL(4단계에서 제조)을 미세한 젤 로딩 팁으로 마이크로 주입 바늘을 적재하고 마이크로 인젝터에 고정시킵니다(5단계 참조).</li>
	<li>이전에 박테리아로 주입 된 배아의 Cuvier덕트에 파지 칵테일을 주입하십시오.</li>
	<li>마이크로 주입 된 배아를 신선한 E3 배지 + PTU로 두 개의 깨끗한 페트리 접시에 옮기고 28 ° C에서 배양하십시오.</li>
</ol>7. PAO1 및 파지주입된 배아의 세균 부담 평가
<ol><li>8마피에서 페트리 15개의 마취배아를 페트리 접시에서 1.5mL 원심분리기 튜브로 처리합니다.</li>
	<li>마취용액을 PBS(PBSTritonX)에서 트리톤 X-100의 1% 트리톤 X-100의 300 μL로 대체하고 멸균 27-G 바늘로 인슐린 주사기를 통해 최소 15배 이상 전달하여 배아를 균질화한다.</li>
	<li>희석된 균주100 μL을 멸균 PBS의 900 μL로 전송하여 멸균 PBS에서 균질화의 직렬 희석을 준비합니다.</li>
	<li>자연적으로 amp-내성 PAO1 균주를 선택하려면, LB 한천에 희석제의 100 μL을 암피실린(100 μg/mL)으로 첨가하고, 밤새 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>다음날, 콜로니수를 카운트하고, 희석계에 곱하여 CFU의 총 수를 결정하고, CFU/감염된 배아의 평균 수를 얻기 위해 균질화된 배아의 수로 나눕니다.</li>
</ol>8. PAO1 및 파지로 주입된 배아의 치사성 평가
<ol><li>PAO1 감염의 치사성을 평가하기 위해, 스테레오 현미경의 밑에 20 hpi에서 주입된 태아를 점수하고 죽은 태아를 계산합니다 (백색/ 투명하지 않음).</li>
	<li>20hpf에서 주입된 배아의 50%의 죽음을 결정하는 PAO1의 반 최대 치명적인 농도 50(LD50) 복용량을 계산합니다.</li>
</ol>9. GFP+ PAO1 감염의 스테레오 현미경 경과 이미징을위한 배아 준비
<ol><li>E3 용액 100mL에서 1.5% 낮은 녹는 아가로즈를 용해하여 살아있는 배아 이미징을 위한 금형을 준비합니다.</li>
	<li>1% 트리카인을 첨가(표 1참조)를 첨가하여 배아를 마취시합니다.</li>
	<li>4hpi에서 유리 바닥 접시에 플라스틱 파이펫으로 하나의 배아를 전달하고 따뜻한 저융 점 아가로즈 용액을 추가합니다.</li>
	<li>유리 바닥 접시를 스테레오현미경아래에 배치하고 팁 위치로 배아를 원하는 방향으로 배치합니다. 플라스틱 파이펫을 사용하여 배아에 아가로즈 한 방울을 조심스럽게 추가하십시오.</li>
	<li>아가로즈를 5-10분 동안 식히고 마취용액을 함유한 E3로 유리 바닥 접시를 부드럽게 채우어 배아를 촉촉하게 유지합니다.</li>
	<li>GFP+ 박테리아용 형광 필터(채널 488 nm)를 형광 스테레오현미경 아래에 배아와 함께 유리 바닥 접시를 놓습니다. 9, 14 및 18 마력에서 동일한 매개 변수를 추가로 수집 할 때까지 페트리 접시를 제거하지 마십시오.</li>
</ol>10. 프로 염증 성 사이토카인의 표현 분석
<ol><li>20마피에서 트리카인 1x 용액으로 배아를 마취시키고 페트리 접시에서 1.5mL 원심분리기 튜브로 옮기습니다.</li>
	<li>연기 후드 에서 마취 용액을 제거하고 과니듐 염산염 시약의 200 μL로 대체합니다.</li>
	<li>배아를 200 μL 파이펫을 통해 반복적으로 배관을 한 다음 멸균 27 G 바늘을 가진 인슐린 주사기로 적어도 15배 이상 배아를 균질화합니다.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 시판되는 가미염 시약을 사용하여 균질화된 제브라피시 배아로부터 총 RNA를 추출합니다.</li>
	<li>제조업체의 지시에 따라 DNase I(RNase-free)의 1U/μL 2μL로 각 RNA 샘플의 1 μg를 처리합니다.</li>
	<li>DNase I의 1 μg를 사용하여 제조 업체의 지시에 따라 20 μL의 총 부피에서 시판 가능한 키트 (재료 표 참조)를사용하여 역전사 반응 (RT)을 치료했습니다.</li>
	<li>RT 반응의 1:6 희석의 1.5 μL을 사용하여 1x SYBR 그린 마스터믹스를 포함하는 10 μL의 총 부피에서 RT qPCR 반응을 수행한다. 정상화를 위해, 집 유지 유전자 rpl8 및 프로 염증 성 사이토카인에 대한 프라이머를 사용, TNF-α 및 IL-1β에 대한 프라이머를 사용합니다 (표 2참조). qPCR 프로토콜은 : 사이클 1 단계 1 : 95 ° C, 2 분, 한 번 반복; 사이클 2: 단계 1 95°C, 10s, 단계 2 55°C, 30s, 40x 반복; 사이클 3: 1 단계 72 °C, 15 분.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 원고에서, 우리는 제브라피시 배아에 있는 P. aeruginosa (PAO1) 감염을 능력을 발휘하는 프로토콜을 설명하고 그것을 해결하기 위하여 PAO1를 감염시킬 수 있는 이전에 확인된 파지의 칵테일으로 파지 치료를 적용하는 방법을 기술했습니다. 항생제 치료에 대 한 대안으로 박 테리 오 파 지의 사용은 지난 몇 년 이후 증가 관심의 되었습니다. 이것은 주로 공중 보건을 위한 심각한 문제점을 구성하는 다중 약 저항하는 (MDR) 세균성 감염의 확산 때문입니다. 물론, 이 작품의 범위는 인간이 아닌 동물 모델에 파지 요법을 적용하는 것으로 제한됩니다. 그러나, 우리는 CFtr 유전자를 표적으로 하는 모르폴리노의 주입을 가진 낭포성 섬유증 제브라피시 모형을 생성했습니다, 또한 P.aeruginosa 감염에 영향을 받기 쉬운 병리 유전학 모형에서 파지 치료의 효험을 보여주는.
전작과 마찬가지로 파지 요법을 쉽게 달성할 수 있었고, ...

파지 요법은 세균 감염과 싸우기 위해 박테리아의 자연적인 적의 사용으로 항생제에 대한 세균 저항이 널리 퍼지면서 새로운 관심을 얻고 있다1,,2. 동유럽에서 수십 년 동안 사용되는 이 치료법은 CF 를 사용한 환자에서 폐 감염을 경화시키는 항생제에 대한 보완적 치료법으로 간주될 수 있으며 현재 사용 중인 모든 항생제에 내성이 있는 박테리아에 감염된 환자에 대한 가능한 치료 대안으로 간주될 수 있다2,,3. 항생제 치료의 장점은 세균세포가 감염 부위에서 증식하는 반면 항생제는 대사되고4신체4,5에서제거된다는 것이다. 실제로, 다른 실험실에서 분리된 악성 파지의 칵테일의 투여는 곤충과 포유류6,67,7,8과다른 동물 모델의 슈도모나스 아루기노사 감염을 치료하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다. 파지 요법은 또한 P. aeruginosa 및 Escherichia 대장균에 감염된 화상 상처에 있는 세균성 부담을 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다 9 무작위 임상 시험9.
Zebrafish(Danio rerio)는최근 P. aeruginosa10,,11, Mycobacterium 농양 및 버콜데리아 세파시아,12,13을포함하여 여러 병원균으로 감염을 연구하는 귀중한 모델로 부상했습니다. 배아 혈액 순환에 직접 박테리아를 마이크로 주입함으로써제브라피시 선천적 면역 계통에 의해 상쇄되는 전신 감염을 확립하기 쉬우며, 이는 인간과 유사한 호중구 및 대식세포 생성과 함께 진화적으로 보존된다. 더욱이, 생활의 첫번째 달 도중, 제브라피시 태아는 적응성 면역 반응이 결여되어, 인간 폐 감염에 있는 중요한 방어 기계장치인 선천적인 면역을 공부하기 위한 이상적인 모형을 만들기(15). Zebrafish는 최근에 CF 개시를 더 잘 이해하고 새로운 약리학적 치료를 개발하기 위해 강력한 유전 모델 시스템으로 등장10,,16,,17. 제브라피시에서 모르폴리노 주입으로 생성된, CFTR 노크다운CF제브라시 모델은 호흡 버스트 반응과 호중구 이동감소(10)를제시했으며, cftr 녹아웃은 내부 장기 위치및 외신 췌장의 파괴로 이어지며, 인간 질환을 반영하는 표현형인 외신 췌장의 파괴로 이어진다.1617 가장 큰 관심사는 P. aeruginosa 세균성 부담이 마우스와 인간 기관지 상피 세포2,,18로얻은 결과를 평행하게 하는 8시간 후 감염(hpi)에서 대조군에서 보다 cftr-손실-기능배아에서 현저히 높았다는 것을 발견하였다.
이 작품에서, 우리는 파지 치료가 제브라피시 배아에 있는 P. aeruginosa 감염에 대하여 효과적이다는 것을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td>, <td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr>, <tr><td>염화칼슘</td>, <td>시그마 -알드리치</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td>, <td>시그마 - 알드리치</td><td>289329</td><td></td></tr><tr><td>둘베코의 인산 완충 식염수 PBS</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>에틸 3- 아미노 벤조 에이트 메탄 설포 네이</td><td>트 시그마 -알드리치</td><td>886-86-2</td><td>일반 이름 : 트리카인</td></tr><tr><td>Femtojet Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>5247</td><td></td></tr><tr><td>Fleming/brown P-97</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>LE-Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11685660001</td><td></td></tr><tr><td>저용융 아가로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>CAS 9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>메틸 블루</td><td>시그마 알드리치</td><td>28983-56-4</td><td></td></tr><tr><td>미세 주사 바늘</td><td>하버드 장치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea > = 98%</td> <td>Aldrich-P7629</td><td>103-85-5</td><td></td></tr><tr><td>연구원이 설계한</td>올리<td>고 모르폴리노</td><td>유전자 도구</td><td></td></tr><tr><td>PEG6000</td><td>Calbiochem</td><td>528877</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드 솔루션</td><td>시그마-알드리치</td><td>CAS 143-74-B</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-06-0</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 ACS 시약, &ge; 99.0%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Leica</td><td>S9I</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>옥소이</td><td>드 LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Oxoid</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>Z-MOLDS Microinjection</td><td>Word 정밀 기기</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

낭포성 섬유증 얼룩말 피시 태아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염을 중화하는 파지 치료 응용 프로그램

Phage Therapy Application to Counteract Pseudomonas aeruginosa Infection in Cystic Fibrosis Zebrafish Embryos

항균 저항, 진단 불확실성및 항균 과처방의 주요 결과, 우리 사회와 건강 시스템에 큰 영향을 미치는 전 세계적으로 심각한 감염, 합병증 및 사망의 점점 인식되는 원인입니다. 특히, 면역 체계가 손상되거나 낭포성 섬유증(CF)과 같은 기존 및 만성 병리를 가진 환자는 다약물 내성 분리물의 출현 및 확산으로 감염을 제어하는 빈번한 항생제 치료를 받게 된다. 따라서 세균 감염에 대처하기 위한 대체 요법을 해결해야 할 긴급한 필요성이 있습니다. 박테리아의 자연적인 적인 박테리오파지의 사용은 가능한 해결책이 될 수 있습니다. 이 작품에 자세히 설명 된 프로토콜은 CF 제브라피시 배아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염에 대한 파지 치료의 적용을 설명합니다. Zebrafish 배아는 CF 배아에서 치사성, 세균성 부담 및 염증성 면역 반응을 감소시키기 때문에 파지 치료가 P. aeruginosa 감염에 효과적이라는 것을 증명하기 위해 P. aeruginosa에 감염되었습니다.

여기에 제시된 결과 및 수치는이전에 설명된 바와 같이 cftr 모르폴리노스의 주입을 통해 생성된 CF 배아를 참조하고 5단계에서. CF 표현형을 검증하기 위해, 이전에 설명된바와 같이 심장, 간 및 췌장과 같은 내부 장기의 손상된 위치(도1)가고려되었다. 이전간행물(19)에보고된 바와 같이 WT 배아의 경우 유사한 결과를 얻었다.
PAO1에 감염된 CF 배아에서 파지 요법에 의해 세균부담이 감소하였다. 더욱이, 15개의 배아의 군을 균질화시킴으로써 8마피에서 세균부담을 평가하였다: PAO1 감염배아에 존재하는 박테리아(cfu/embryo)의 평균 수는 파지 투여 후 약 20%로 감소하여 파지 칵테일의 존재시보다 덜 심각한 감염을 확인하였다(도2)....

여기에 제출된 것은 낭포성 섬유증(CF) 제브라피시 배아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염 및 파지 치료 응용 프로그램에 대한 프로토콜이다.

Antimicrobial resistance, a major consequence of diagnostic uncertainty and antimicrobial overprescription, is an increasingly recognized cause of severe ...

이 프로토콜은 제브라피시 배아의 슈도모나스 아에루기노사에 대한 바이러스 및 파지 칵테일의 준비 및 투여를 용이하게합니다. 이 기술의 주요 장점은 세균 감염에 중화되는 파지 효능의 생체 내 평가를 허용한다는 것입니다. 파지 칵테일은 야생 유형과 낭포성 섬유증 제브라피시 모델 모두에서 효율적입니다.낭포성 섬유증 환자의 세균 감염에 파지 요법을 적용 할 수있는 가능성을 열어. 파지 치료는 또한 그밖 모형 시스템에서 특정 세균성 감염을 중화하기 위하여 적용될 수 있습니다. 실험을 위한 파지 스톡을 준비합니다.1.25배 10번을 0.05 P.aeruginosa 배양의 OD 600에 첨가하여 10배의 감염의 복합성에 10배의 감염성을 부정3로 나누고 OD 600이 0.1에서 0.3으로 떨어질 때까지 흔들어 서 3~4시간 동안 배양한다. 인큐베이션의 끝에서 37섭씨에서 30분 동안 DNAse및 RNA의 밀리리터당 1마이크로그램으로 용액을 배양합니다. 그리고 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.원심분리의 끝에서 0.8 마이크로 미터 모공 직경을 통해 상피필터를 걸러내고 염화나트륨 리터당 58그램, PEG 6000 리터당 105그램을 추가합니다. 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 솔루션을 배양하십시오. 다음 아침, 원심분리로 파지를 침전시합니다.센트로푸게이션의 끝에서 상체를 제거하고 조심스럽게 트리스 나트륨 염화 나트륨 버퍼의 15 밀리리터에 파지 펠릿을 용해. 세슘 염화물 밀도 그라데이션에 의해 파지를 정화하기 위해 먼저 SW 41 로터용 폴리알로머 초센트리슈에지 튜브에 4개의 다른 세슘 염화제 용액의 2밀리리터를 계층화하고 각 튜브에 파지 서스펜션3.5 밀리리터를 추가합니다. 염화물 세슘은 독성이 있습니다.이 화합물을 취급하고 폐기할 때 항상 적절한 안전 절차를 채택하십시오. 모든 튜브가 로드되면 튜브가 균형을 이루는 것을 주의하여 튜브를 로터에 넣습니다. 그리고 100, 000 배 g 및 섭씨 4도에서 2 시간 동안 샘플을 원심 분리합니다.원심분리의 끝에서, D와 같고 D는 1.4 밀도 영역과 같을 사이의 백색 층을 흡인하기 위해 19 게이지 바늘을 가진 주사기를 사용한다. 그리고 새로운 SW 60 크기의 폴리 알로머 튜브로 서스펜션을 전송합니다. 150, 000배, 섭씨 4도에서 최소 16시간 동안 서스펜션을 원심분리합니다.그리고 6, 000 달튼 컷오프와 투석 튜브로 보이는 밴드를 전송합니다. 그런 다음 수집된 샘플을 투석당 20분 동안 500밀리리터의 물에 대해 두 번, 트리스 나트륨 염화물 버퍼 500밀리리터에 대해 하룻밤 동안 투석을 합니다. 다음 아침, 0.22 마이크로 미터 모공 필터로 생성 된 파지 스톡을 필터링하고 섭씨 4도에 재고를 저장합니다.마이크로 주입당일에는 멸균수에 있는 2개의 마이크로몰라 모르폴리노스 스톡 용액을 배아당 0.25 피코몰라의 최종 농도로 희석하여 5개의 마이크로리터 모르폴리노 주입 용액을 얻었다. 그리고 각 솔루션에 페놀 레드의 0.5 마이크로 리터를 추가합니다. 다음으로 미세겔 로딩 팁이 있는 20마이크로리터 마이크로파이프를 사용하여 모폴리노 혼합 용액의 전체 부피와 함께 마이크로 사출 바늘을 적재하고 스테레오 현미경 아래 스탠드에 연결된 마이크로 조작기로 바늘을 고정시킵니다.그런 다음 하나 또는 두 개의 세포로, 얼룩말 물고기 배아는 96 밀리미터 직경 페트리 접시 내에 배치 유리 슬라이드에 배치, 마이크로 주입 바늘 팁으로 초리온과 노른자를 관통하고 배아에 모르플리노 혼합물의 두 나노 리터를 주입. 수정 후 26시간, P.aeruginosa inoculum의 약 5개의 마이크로리터를 가진 마이크로 사출 바늘을 적재하고 덕트가 노른자 낭 위로 퍼지기 시작하는 쿠비에의 덕트의 시작지점에 바늘을 등갈기로 삽입한다. PAO1 접종의 1~3나노리터를 배아에 주입하여 부피가 덕트 내에서 직접 확장되어 순환으로 진입하도록 합니다.주사 후 배아는 28°C에서 30분 또는 3시간 동안 페닐티우레아로 보충된 신선한 E3 배지를 함유한 두 개의 새로운 페트리 요리 중 하나로 배아를 전달한다. 다음으로, 파지 칵테일의 약 5 마이크로 리터와 마이크로 주입 바늘을로드하고 마이크로 인젝터에 바늘을 고정. 그런 다음 이전에 박테리아를 주입한 각 배아의 Cuvier 덕트에 파지 칵테일 1~3나노리터를 주입하고 28°C에서 페닐티우레아로 보충된 신선한 E3 배지를 함유한 두 개의 새로운 페트리 요리 중 하나에 배아를 배치합니다.감염 후 4시간 동안 플라스틱 파이펫을 사용하여 마취된 배아를 유리 바닥 접시에 옮기습니다. 그리고 따뜻한 낮은 융점 아가로즈 용액으로 접시를 채웁니다. 아가로즈가 차가워지면 마취용액으로 보충된 E3 배지로 접시를 부드럽게 채웁니다.스테레오 현미경 아래에 접시를 놓고 파이펫 팁을 사용하여 배아를 원하는 방향으로 배치합니다. 그런 다음 GFP 양성 박테리아에 대한 형광 필터를 사용하여 형광 스테레오 현미경으로 접시를 감염 후 최대 18시간 동안 배치하고 감염 후 9시간, 14 시간 및 18시간 후GFP 발현의 진행을 위한 배아를 이미지화한다. 감염 후 8시간에서 세균 부담을 결정하기 위해 15개의 마취된 미세 주입 배아를 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 PBS에서 1%트리톤 X-100의 300마이크로리터로 마취용액을 대체한다.인슐린 주사기의 멸균 27 게이지 바늘을 통해 바늘을 통과하여 배아를 균질화합니다. 그리고 희석당 멸균 PBS의 900 마이크로리터로 생성된 혼합물의 100 마이크로리터를 이송하여 동형화의 직렬 희석을 준비한다. 자연암피실린 내성 P.aeruginosa 균주를 선택하려면, 암피실린으로 보충된 LB 한루에 희석제 10 마이크로리터를 플레이트하고 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날은 식민지 의 수를 계산합니다. 감염된 배아당 식민지 형성 단위의 총 수와 평균 식민지 형성 단위수를 계산할 수 있도록 한다. P.aeruginosa 감염의 치사성을 평가하기 위해 죽은 백색 불투명 배아의 수를 계산하여 스테레오 현미경의 밑에 20 시간 감염 후 감염에서 주입된 배아점수.그런 다음 감염 후 20시간 동안 주입된 배아의 50%가 사망한 P.aeruginosa의 절반 최대 치명적인 농도 50회 투여량을 계산합니다. 낭포성 섬유증 표현형을 검증하기 위해 심장 간 및 췌장과 같은 내부 장기의 손상된 위치를 평가할 수 있다. 세균성 부담은 P.Aeruginosa에 감염된 낭포성 섬유증 태아에 있는 파지 치료에 의해 감소됩니다.GFP 양성 P.Aeroginosa 박테리아에 감염된 48 시간 후 수정 낭포성 섬유증 배아배는 배아 복용량 당 30 식민지 형성 단위는 감염 후 20 시간에서 50 %의 치사성을 보여줍니다. 파지 치료는 세균 주사 후 30 분 또는 7 시간을 전달할 때 감염 후 20 시간에서 동등하게 효과적입니다. 여기서, 낭포성 섬유증 및 GFP 양성 P.Aeruginosa는 4, 9, 14 및 18 시간 후 감염에서 배아를 주입하는 것을 보여 주었다.대조적으로 낭포성 섬유증 플러스 P.Aeruginosa 플러스 파지 주입 태아는 박테리아에 대하여 파지 작용 때문에 감소된 형광을 보여줍니다. 낭포성 섬유증 배아에서 P.aeruginosa 감염에 의해 생성된 염증 반응은 프로 염증성 사이토카인, TNF 알파 및 인터류킨 1 베타 다음의 발현에 의해 밝혀지면서 현저히 증가하며 P.aeruginosa 주사에 비해 주사된 제브라피시 대조군에 비해. 그러나 파지 칵테일공동 주입 동물에서 두 염증성 사이토카인의 발현이 감소된다.파지는 준비 중에 유지될 수 있는 오염된 내독신을 제거하기 위해 신중하게 정제되어야 합니다. 파지 제제는 전자 현미경 검사법에 의해 분석되어 비리온 형태를 평가할 수 있다. 가짜 아에루기노사 이외의 박테리아에 의한 인간 환자의 감염이 낭포성 섬유증 얼룩말피 모델에서 파지 요법으로 치료될 수 있는지 여부를 테스트하는 것은 흥미로할 것입니다.

phage-therapy-application-to-counteract-pseudomonas-aeruginosa

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

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이 프로토콜에는 기름 통 면봉의 사용 및 Aeromonas hydrophila, 진 균 종, 및 와 같은 병원 체를 검출 하기 위하여 센 티 넬의 단독 사용에 비해 증가 탐지에 이르게 zebrafish 시스템의 슬러지 분석 설명 합니다. Pseudocapillaria tomentosa. 검역에 P. tomentosa 계란을 모니터링 하는 시스템도 제안 했다.

Aeromonas hydrophila, 진 균 종, 및 Pseudocapillaria tomentosa Zebrafish 시스템에서의 환경 심사

여기 우리 성인 zebrafish (Danio rerio) DNA 기반 백신의 예방 접종에 대 한 프로토콜 설명 및 성공적인 예방 접종 이벤트의 유효성 검사를 보여 줍니다. 이 메서드는 다양 한 감염 모델 백신 후보자의 전 임상 검사에 적합 합니다.

DNA 기반 백신의 임상 검사에 대 한 성인 Zebrafish의 예방접종

이 프로토콜은 유세포 분석을 사용한 약물 반응 평가 지침과 함께 일시적 면역 억제 제브라피시 배아의 세포주 및 신선한 환자 물질에서 인간 급성 림프구 백혈병(ALL) 이종이식편을 생성하고 문제를 해결하기 위한 단계별 지침을 제공합니다. 실험 파이프라인은 고형 종양에도 적용할 수 있습니다.

제브라피시 배아에서 백혈병 세포 이식을 사용한 신속한 생체 내 약물 반응 예측

현재 만성 세균 감염에 대한 약물 스크리닝에 적합한 생체 내 모델이 부족합니다. 여기에서는 제브라피시 유충에서 지속적인 감염을 일으키기 위해 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 임상 격리 물질에 의한 상처 감염에 대한 프로토콜을 설명합니다.

Wounded Zebrafish 유충에서 지속적인 녹농 균 감염 모델링

배우세요 낭포성 섬유증 얼룩말 피시 태아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염을 중화하는 파지 칵테일 준비 및 투여 방법을. 이 기술은 생체 내 파지 효능 평가에 활용됩니다.

낭포성 섬유증 얼룩말 피시 태아에서 슈도모나스 아에루기노사 감염을 중화하는 파지 치료 응용 프로그램

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