2D-HELS MS 염기서열분석(2D-HELS MS SEQ): 뉴클레오티드 변형이 다른 RNA 혼합물의 직접 및 새로운 염기서열분석을 위한 일반적인 LC-MS 기반 방법
2020년 7월 10일
여기에서는 cDNA 중간체 없이 짧은 RNA(실행당 <35nt)를 염기서열분석하는 직접 방법과 단일 염기 정밀도에서 단일 연구에서 다른 뉴클레오티드 변형을 염기서열분석하는 일반적인 방법으로 사용할 수 있는 LC-MS 기반 염기서열분석 방법에 대한 자세한 프로토콜에 대해 설명합니다.
이 프로토콜은 RNA 샘플이 단일 가닥, 혼합 또는 변형되었는지 여부에 관계없이 RNA를 직접 시퀀싱하기 위해 개발된 새로운 방법을 사용할 때 필요한 모든 필수 단계를 다룹니다. 이 방법은 효소 오류 또는 염기 상보성의 영향을 받지 않습니다. 한 번에 하나의 특정 변형이 아닌 여러 RNA 변형을 동시에 염기서열분석할 수 있는 직접적인 워크플로우와 일반적인 솔루션을 제공합니다.
이 기술은 시그니처 RNA 세그먼트를 결정하여 인간 질병과 관련시키는 진단 도구와 후전사체 수준에서 RNA 변형을 연구하는 정확한 도구로 개발될 수 있습니다. 이 방법은 이전의 염기서열분석 방법에 의존하지 않습니다. 대신, 이것은 완전히 새로운 접근 방식이며, 우리는 변형된 RNA를 염기서열분석하기 위한 이동 방법을 만드는 것을 목표로 합니다.
이 프로토콜의 일부분에는 RNA LC-MS 데이터 수집의 3'end 레이블 지정 및 MassHunter 소프트웨어의 데이터 분석과 같이 시각적 시연을 통해 보다 정확하게 전달할 수 있는 중요한 측면이 포함되어 있습니다. 이 절차를 시연하고 LC-MS를 설정하고 RNA 샘플을 측정하겠습니다. 1단계 라벨링 반응을 수행하려면 2마이크로리터의 150마이크로몰 AppCp-비오틴, 3마이크로리터의 10x 리가제 반응 완충액, 1.5마이크로리터의 100마이크로몰 RNA 샘플, 3마이크로리터의 무수 DMSO, 10단위의 T4 RNA 리가제, 19.5마이크로리터의 DEPC 처리된 물을 총 30마이크로리터의 부피로 결합합니다.
반응을 섭씨 16도에서 밤새 배양한 후 원고 지시에 따라 컬럼 정제를 수행합니다. RNA를 3개의 부분 표본으로 나누고 동일한 부피의 포름산을 첨가한 후 섭씨 40도에서 반응을 배양합니다. 각 반응이 완료되면 즉시 샘플을 드라이아이스에 동결하여 산 분해를 냉각합니다.
원심 진공 농축기를 사용하여 샘플을 약 30분 동안 건조시킵니다. 건조된 샘플을 DEPC 처리된 물 20마이크로리터에 재현탁하고 결합합니다. LC-MS 측정이 이루어질 때까지 시료를 섭씨 20도에서 보관합니다.
이동상을 준비한 후 RNA 샘플을 LC-MS 샘플 바이알로 옮깁니다. 각 주입에는 100-400개의 피코몰의 RNA와 20마이크로리터가 포함되어야 합니다. 데이터를 수집한 후 분자 특징 추출 워크플로우를 사용하여 질량, 머무름 시간, 부피 및 품질 점수를 포함한 화합물 정보를 추출합니다.
소분자 설정에서 중심 데이터 형식을 사용합니다. 최고 높이를 100 이상, 1, 000 미만으로 설정하고 품질 점수를 50 이상으로 설정합니다. 마지막으로 데이터를 Excel 파일로 내보냅니다.
5' 사다리 및 기타 원치 않는 단편에서 3' 사다리의 분리는 여기에 2D 질량 유지 시간 플롯에 나와 있습니다. 또한 각 RNA에서 5' 비오틴 라벨을 사용하여 길이가 다른 두 개의 RNA 가닥을 포함하는 혼합 샘플을 염기서열분석하는 것도 가능합니다. 우리딘과 슈도우리딘을 구별하기 위해, RNA는 슈도우리딘을 CMC-슈도우리딘 부가물로 변환하는 CMC로 처리되었습니다.
부가물은 우리딘에서 다른 질량을 가지며 2D-HELS MS 염기서열에서 구별될 수 있습니다. 슈도우리딘을 CMC-부가물로 전환하는 반응의 조질 생성물의 HPLC 프로파일을 사용하여 변환 비율을 계산했으며, 이는 42%5개의 서로 다른 RNA 가닥의 혼합물을 3'말단 라벨링을 사용한 2D-HELS MS 염기서열 분석 접근법에 의해 염기서열분석되고 여러 RNA 염기서열의 더 나은 시각화를 위해 정규화되었습니다. 정규화가 없으면 5개의 RNA 염기서열에 대한 문자 코드가 함께 붐빌 것입니다.
이 절차를 시도하는 동안 라벨링된 RNA 샘플의 높은 수율을 얻을 수 있도록 라벨링 반응을 신중하게 설정하십시오. 또한 분해 시간을 주의 깊게 모니터링하여 신뢰할 수 있는 질량 래더를 만들고 20마이크로리터의 물로 최대한의 건조 샘플을 수집합니다. 이 프로토콜을 수행한 후 질문할 수 있는 질문은 시퀀싱 방법의 너비, 길이 및 처리량을 늘리는 방법입니다.
더 나은 알고리즘과 더 높은 해상도와 감도를 가진 더 발전된 기기가 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜이 개발된 후, CDA 기반 RNA 염기서열분석과 관련된 오류 없이 표준 뉴클레오티드와 변형된 뉴클레오티드를 모두 포함하는 더 넓은 범위의 RNA 샘플을 직접 염기서열분석하는 것이 가능해졌습니다.
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개요
본 논문은 cDNA 중간체 단계가 필요 없는 짧은 RNA를 위한 새로운 LC-MS 기반 시퀀싱 방법을 제시합니다. 이 프로토콜을 통해 단일 염기 정밀도로 다양한 RNA 수식화를 동시에 시퀀싱할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- RNA 시퀀싱
- 에피트랜스크립토믹스
- 생명공학
배경
- 현재의 RNA 시퀀싱 방법은 종종 cDNA 중간체에 의존합니다.
- 효소 오류는 시퀀싱 정확도에 영향을 미칠 수 있습니다.
- RNA 수식화를 동시에 시퀀싱하는 것은 어렵습니다.
- RNA 수식화를 이해하는 것은 인간 질병 연구에 매우 중요합니다.
연구 목적
- RNA 직접 시퀀싱 방법을 소개합니다.
- 한 번의 분석으로 여러 RNA 수식화를 연구할 수 있도록 합니다.
- 에피트랜스크립토믹스 연구를 위한 신뢰할 수 있는 도구를 제공합니다.
사용된 방법
- LC-MS 기반 시퀀싱 기술.
- 단일 가닥, 혼합 또는 변형된 RNA의 직접 시퀀싱.
- cDNA 합성 단계의 제거.
- 높은 정밀도와 정확도를 위해 설계된 워크플로우.
주요 결과
- 이 방법은 cDNA 없이 짧은 RNA(<35 nt)를 성공적으로 시퀀싱합니다.
- 다양한 RNA 수식의 동시 검출을 달성하였습니다.
- 이 기술은 효소 오류에 대한 회복력을 입증하였습니다.
- 인체 질병 진단 분야에서의 잠재적 응용 가능성이 확인되었습니다.
결론
- 이 새로운 시퀀싱 방법은 변형 RNA 분석의 표준이 될 수 있습니다.
- 이는 RNA 변형을 연구하는 포괄적인 접근 방식을 제공합니다.
- 이 프로토콜은 향후 RNA 생물학 연구에 시사하는 바가 큽니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
이 LC-MS 기반 RNA 시퀀싱 방법은 cDNA 합성 없이 변형된 RNA 혼합물의 직접적인 de novo 시퀀싱을 가능하게 하여, 에피트랜스크립토믹스(epitranscriptomic) 표적 검증의 핵심 병목 구간을 해결합니다. 정량적이고 변형이 분석된 시퀀싱 데이터를 제공함으로써, RNA 기반 바이오마커의 조기 발견과 치료용 올리고뉴클레오타이드의 기전적 리스크 감소를 지원합니다. 또한, 스크리닝 및 분석법 개발 워크플로우에 직접 적용 가능한 서열 확인 및 변형 특이적 결과물을 제공함으로써 리드 물질 식별의 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: pseudouridine 및 5-methylcytosine과 같은 RNA 수정을 천연 상태의 컨텍스트에서 직접 시퀀싱함으로써 치료 가설의 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 표준 뉴클레오타이드와 수정된 뉴클레오타이드를 동시에 검출할 수 있는 일반적인 솔루션을 제공하여, 순차적인 수정 특이적 분석의 필요성을 줄여줍니다.
- 예측적 가치: 수정된 뉴클레오베이스의 질량-머무름 시간 상관관계를 직접 확인함으로써 타겟 신뢰도를 높이고, 정확한 부위 특이적 수정 매핑을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 최대 12종의 서로 다른 올리고뉴클레오타이드 혼합물 내에서 RNA 서열을 안정적으로 구별할 수 있는 정량적 질량 및 머무름 시간 출력값을 생성합니다.
- 운용적 가치: 표준 고해상도 LC-MS 시스템과 호환되며 정규화가 가능한 재현성 있는 데이터를 제공하여, 짧은 RNA 패널 전체에 걸친 분석 표준화를 지원합니다.
- 확장성: 정의된 변형 패턴을 가진 서열 검증 RNA 표준품을 생성함으로써, 하위 스크리닝을 위한 검증된 생물학적 시스템의 준비를 용이하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연구의 연속성: 변형된 치료용 RNA 올리고뉴클레오타이드의 서열 검증을 지원하여, 발굴 단계의 변형을 전임상 후보 물질 평가와 연결합니다.
- 기전적 리스크 제거: 변형으로 인한 질량 변화(예: CMC-pseudouridine adduct)를 검출할 수 있어, 복잡한 샘플 내의 실제 신호를 분해 산물로 인한 아티팩트와 구별할 수 있게 합니다.
- 리스크 조정 기반의 진행: 효소적 편향 없는 서열 확인을 제공함으로써 변형 스크리닝 시의 위음성을 줄이고, go/no-go 결정의 신뢰도를 높입니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
본 방법은 가설 기반의 RNA 분석을 위한 전단부 시퀀싱 도구로서 초기 발견 워크플로우에 통합되며, 기능적 스크리닝에 앞서 합성 또는 내인성 RNA 타겟의 서열 및 변형 상태를 확인함으로써 리드 물질 발굴 단계에 기여합니다.
- 발견 생물학: 천연 또는 합성 혼합물 내에서 RNA 서열과 수식의 공존에 대한 직접적인 증거를 제공함으로써 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 화합물로 유도된 RNA 수식 또는 분해 프로파일링의 정량적 참조 역할을 하는 질량-머무름 시간 사다리를 생성하여 분석 준비 상태를 가능하게 합니다.
- 분석: Excel로 내보낼 수 있는 중심점 기반 분자 특성 데이터(질량, 머무름 시간, 부피, 품질 점수)를 생성하여 조건 간 비교 및 수식 안정성의 통계적 평가를 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 바이오마커 정렬 및 질병 관련 시스템에서의 기능 검증에 적합한 서열 검증된 수식 RNA 표준물을 제공함으로써 전임상 연속성을 연결합니다.
- 기업 내 재사용: 짧은 RNA 변이체(<35 nt)의 신속한 서열 분석을 위한 재사용 가능한 LC-MS 기반 역량으로 기능하여, 외부 서열 분석 의존도를 낮추고 내부 수식 스크리닝 주기를 가속화합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: cDNA 매개 오류를 제거하고 변형 특이적 질량 시그니처의 직접 관찰을 가능하게 함으로써 타겟 검증에 대한 예측 신뢰도를 제공합니다.
- 운영적 가치: 표준화된 라벨링, 산 퀜칭(acid quenching) 및 정규화 단계를 통해 복잡한 RNA 혼합물 내의 실행 간 변동성을 최소화하여 재현성을 보장합니다.
- 전략적 가치: 변형된 RNA의 내부 시퀀싱을 가능하게 하여 외부 벤더에 대한 의존도를 낮추고 리드 최적화의 반복 주기를 가속화함으로써 자본 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 명확한 서열 및 변형 데이터를 제공하여 리스크 조정 우선순위 설정을 지원하며, 감지되지 않은 RNA 이질성 또는 잘못된 주석으로 인한 후기 단계의 중단율을 감소시킵니다.
실행 시 고려 사항
- 정확한 데이터 해석을 위해 RNA 취급, LC-MS 운용 및 MassHunter 기반의 분자 특성 추출에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 정해진 피크 높이(100–1000) 및 품질 점수(≥50) 임계값으로 센트로이드 데이터 수집이 가능한 고해상도 LC-MS 시스템에 대한 접근이 필요합니다.
- 사용자와 플랫폼 전반에 걸쳐 일관된 질량 래더(mass ladder) 생성을 보장하기 위해 라벨링 효율, 분해 시점 및 정규화 프로토콜에 대한 팀 간 표준화가 필수적입니다.
- 향후 알고리즘 및 장비 개선 전까지는 짧은 RNA(<35 nt) 범위를 벗어나거나 복잡한 생물학적 샘플로 확장할 때 적응 고려 사항이 수반됩니다.
- 현재의 처리량 제한과 수율 및 래더 해상도를 극대화하기 위한 라벨링 반응(예: AppCp-biotin, T4 ligase, DMSO)의 수동 최적화 의존성을 포함한 실질적인 제한 사항이 있습니다.
