Name: 2D-HELS MS 염기서열분석(2D-HELS MS SEQ): 뉴클레오티드 변형이 다른 RNA 혼합물의 직접 및 새로운 염기서열분석을 위한 일반적인 LC-MS 기반 방법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 41 s
Description: 배우세요 2D-HELS MS SEQ 방법으로 cDNA 없이 직접 RNA 염기서열을 분석하는 기술입니다. 단일가닥 및 변형 RNA를 동시에 정밀하게 분석하여 후성전사체학 연구와 질병 진단에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Addepalli, B., Venus, S., Thakur, P., Limbach, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+ribonuclease+activity+of+cusativin+from+Cucumis+sativus+for+mapping+nucleoside+modifications+in+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Novel ribonuclease activity of cusativin from Cucumis sativus for mapping nucleoside modifications in RNA.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (24), 5645-5654 (2017).</li>
<li>Gao, H., Liu, Y., Rumley, M., Yuan, H., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+confirmation+of+chemically+modified+RNAs+using+exonuclease+digestion+and+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization+time-of-flight+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Sequence confirmation of chemically modified RNAs using exonuclease digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 23 (21), 3423-3430 (2009).</li>
<li>McLuckey, S. A., Van Berkel, G. J., Glish, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tandem+mass+spectrometry+of+small%2C+multiply+charged+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+The+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Tandem mass spectrometry of small, multiply charged oligonucleotides.</a> Journal of The American Society for Mass Spectrometry. 3 (1), 60-70 (1992).</li>
<li>Fountain, K. J., Gilar, M., Gebler, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+native+and+chemically+modified+oligonucleotides+by+tandem+ion-pair+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Communications+in+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Analysis of native and chemically modified oligonucleotides by tandem ion-pair reversed-phase high-performance liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 17 (7), 646-653 (2003).</li>
<li>Taucher, M., Breuker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+modified+RNA+by+top-down+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+in+English%22%5BJournal%5D)">Characterization of modified RNA by top-down mass spectrometry.</a> Angewandte Chemie International Edition in English. 51 (45), 11289-11292 (2012).</li>
<li>Kellner, S., Burhenne, J., Helm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+RNA+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of RNA modifications.</a> RNA Biology. 7 (2), 237-247 (2010).</li>
<li>Thomas, B., Akoulitchev, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+of+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry of RNA.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31 (3), 173-181 (2006).</li>
<li>Bjorkbom, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+direct+sequencing+of+noncanonical+RNA+by+two-dimensional+analysis+of+mass+chromatograms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Bidirectional direct sequencing of noncanonical RNA by two-dimensional analysis of mass chromatograms.</a> Journal of the American Chemical Society. 137 (45), 14430-14438 (2015).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+LC-MS-based+RNA+sequencing+method+for+direct+analysis+of+multiple-base+modifications+in+RNA+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A general LC-MS-based RNA sequencing method for direct analysis of multiple-base modifications in RNA mixtures.</a> Nucleic Acids Research. 47 (20), 125(2019).</li>
<li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+sequencing+of+tRNA+by+2D-HELS-AA+MS+Seq+reveals+its+different+isoforms+and+dynamic+base+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct sequencing of tRNA by 2D-HELS-AA MS Seq reveals its different isoforms and dynamic base modifications.</a> ACS Chemical Biology. 15 (6), 1464-1472 (2020).</li>
<li>Bakin, A., Ofengand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+newly+located+pseudouridylate+residues+in+Escherichia+coli+23S+ribosomal+RNA+are+all+at+the+peptidyltransferase+center%3A+analysis+by+the+application+of+a+new+sequencing+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Four newly located pseudouridylate residues in Escherichia coli 23S ribosomal RNA are all at the peptidyltransferase center: analysis by the application of a new sequencing technique.</a> Biochemistry. 32 (37), 9754-9762 (1993).</li>
<li>Cantara, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+Modification+Database%2C+RNAMDB%3A+2011+update%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The RNA Modification Database, RNAMDB: 2011 update.</a> Nucleic Acids Research. 39 (Database issue), D195-D201 (2011).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>5' DNA 아데닐화 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>E2610S</td><td>50uM 농도</td></tr><tr><td>6550 Q-TOF 질량 분석기</td><td>Agilent Technologies</td><td>5991-2116EN</td><td>1290 Infinity LC 시스템</td></tr><tr><td>A(5&acute;)에 결합됨PP (5 &급성;)Cp-TEG-비오틴-3&급성;</td><td>ChemGenes</td><td>91718</td><td>HPLC 정제</td></tr><tr><td>ATP&gamma; S</td><td>시그마-알드리치</td><td>11162306001</td><td>리튬염</td></tr><tr><td>비신</td><td>시그마-알드리치</td><td>B8660</td><td>BioXtra, &ge; 99% (적정)</td></tr><tr><td>비오틴 말레이미드</td><td>Vector Laboratories</td><td>SP-1501</td><td>Long arm</td></tr><tr><td>C18 column</td><td>Waters</td><td>186003532</td><td>50 mm &times; 2.1 mm Xbridge C18 column with a particle size of 1.7 &mu; m</td></tr><tr><td>원심 진공 농축기</td><td>Labconco</td><td>Refrig 115V/60HZ 7310022</td><td>Labconco CentriVap</td></tr><tr><td>ChemBioDraw</td><td>PerkinElmer</td><td>ChemDraw Prime</td><td>구조 및 단편의 화학 구조 및 특성 데이터 생성</td></tr><tr><td>CMC (N-cyclohexyl-N?-(2-morpholinoethyl)-carbodiimide metho-p-toluenesulfonate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2491-17-0</td><td>95% Purifiy</td></tr><tr><td>Cyanine3 maleimide (Cy3)</td><td>Lumiprobe</td><td>11080</td><td>수불용성</td></tr><tr><td>DEPC 처리수</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9906</td><td>오토클레이브, 인증된 뉴클레아제 무함유</td></tr><tr><td>디이소프로필아민(DIPA)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>108-18-9</td><td>99% Alfa Aesar</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td>무수 디메틸 설폭사이드, 99.9%</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6758</td><td>무수, 결정성, BioReagent, 세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>포름산</td><td>Merck</td><td>64-18-6</td><td>98-100%, ACS reag, Ph Eur</td></tr><tr><td>Hexafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>920-66-1</td><td>99% Acros Organics</td></tr><tr><td>LC-MS 시료 바이알</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C4000-11</td><td>플라스틱 나사산 바이알</td></tr><tr><td>LC-MS 바이알 캡</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C5000-54A</td><td>자동시료주입기 바이알 나사산 캡</td></tr><tr><td>Na2CO3 완충액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>88975</td><td>BioUltra, >0.1 M Na2CO3, >0.2 M NaHCO3</td></tr><tr><td>Oligo Clean & 농축기</td><td>Zymo Research</td><td>D4060</td><td>스핀 컬럼</td></tr><tr><td>OriginLab</td><td></td><td>OriginLab OriginPro</td><td>데이터 분석 및 그래프 작성 소프트웨어</td></tr><tr><td>pCp-biotin</td><td>TriLink BioTechnologies</td><td>NU-1706-BIO</td><td>20 ul (1 mM)</td></tr><tr><td>RNA #1--#6</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>맞춤형 RNA 올리고</td><td>19nt-21nt 단일 가닥 RNA, 추가 정제 없이 사용</td></tr><tr><td>Rocking 플랫폼 셰이커</td><td>VWR</td><td>오비탈 셰이커 표준 1000</td><td>속도 범위 40 - 300 rpm</td></tr><tr><td>Streptavidin 마그네틱 비드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88816</td><td>바인딩 약. 비드 mg 당 55ug biotinylated rabbit lgG</td></tr><tr><td>Sulfonated Cyanine3 maleimide</td><td>Lumiprobe</td><td>11380</td><td>수용성</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제 1</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>400 units/uL</td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>시그마-알드리치</td><td>T4PNK-RO</td><td>파지 T4 am N81 pse T1 감염 대장균 BB</td></tr><tr><td>Tris-HCl 완충액</td><td>시그마-알드리치</td><td>T6455</td><td>트리스-HCl 완충액, pH 10, 10&times;, 항원 회수</td></tr><tr><td>기 우레아</td><td>시그마-알드리치</td> 합성용 우레아 <td>81871</td><td>우레아. CAS 번호 57-13-6, EC 번호 200-315-5.</td></tr></tbody></table>

2d-hels ms 염기서열분석(2d-hels ms seq): 뉴클레오티드 변형이 다른 rna 혼합물의 직접 및 새로운 염기서열분석을 위한 일반적인 lc-ms 기반 방법

2D-HELS MS Seq: A General LC-MS-Based Method for Direct and de novo Sequencing of RNA Mixtures with Different Nucleotide Modifications

RNA의 3'-말단에 비오틴 태그를 도입하여 쉽게 식별할 수 있는 mass-tR ladder를 생성합니다. 2D-HELS MS Seq 접근 방식의 워크플로우는 그림 1a에 나와 있습니다. RNA의 3'-말단에 도입된 소수성 비오틴 표지(섹션 2 참조)는 표지되지 않은 사다리 성분과 비교할 때 3' 표지된 사다리 성분의 질량과 tR을 증가시킵니다. 따라서 3'-래더 곡선은 2Dmass-t R 플롯에서 더 큰 y축 값(tRs의 증가로 인해)으로 이동하고 더 큰 x축 값(질량 증가로 인해)으로 이동합니다. 그림 1b는 2D-HELS MS 염기서열(Seq)에 대해 RNA의 3'-말단에 비오틴 태그를 도입하는 것을 포함한 시료 전처리 프로토콜을 보여줍니다. 그림 1c는 R...

2D-HELS MS 염기서열분석(2D-HELS MS SEQ): 뉴클레오티드 변형이 다른 RNA 혼합물의 직접 및 새로운 염기서열분석을 위한 일반적인 LC-MS 기반 방법

Mass spectrometry (MS)-based sequencing approaches have been shown to be useful in&#160;direct&#160;sequencing&#160;RNA without the need for a ...

이 프로토콜은 RNA 샘플이 단일 가닥, 혼합 또는 변형되었는지 여부에 관계없이 RNA를 직접 시퀀싱하기 위해 개발된 새로운 방법을 사용할 때 필요한 모든 필수 단계를 다룹니다. 이 방법은 효소 오류 또는 염기 상보성의 영향을 받지 않습니다. 한 번에 하나의 특정 변형이 아닌 여러 RNA 변형을 동시에 염기서열분석할 수 있는 직접적인 워크플로우와 일반적인 솔루션을 제공합니다.이 기술은 시그니처 RNA 세그먼트를 결정하여 인간 질병과 관련시키는 진단 도구와 후전사체 수준에서 RNA 변형을 연구하는 정확한 도구로 개발될 수 있습니다. 이 방법은 이전의 염기서열분석 방법에 의존하지 않습니다. 대신, 이것은 완전히 새로운 접근 방식이며, 우리는 변형된 RNA를 염기서열분석하기 위한 이동 방법을 만드는 것을 목표로 합니다.이 프로토콜의 일부분에는 RNA LC-MS 데이터 수집의 3'end 레이블 지정 및 MassHunter 소프트웨어의 데이터 분석과 같이 시각적 시연을 통해 보다 정확하게 전달할 수 있는 중요한 측면이 포함되어 있습니다. 이 절차를 시연하고 LC-MS를 설정하고 RNA 샘플을 측정하겠습니다. 1단계 라벨링 반응을 수행하려면 2마이크로리터의 150마이크로몰 AppCp-비오틴, 3마이크로리터의 10x 리가제 반응 완충액, 1.5마이크로리터의 100마이크로몰 RNA 샘플, 3마이크로리터의 무수 DMSO, 10단위의 T4 RNA 리가제, 19.5마이크로리터의 DEPC 처리된 물을 총 30마이크로리터의 부피로 결합합니다.반응을 섭씨 16도에서 밤새 배양한 후 원고 지시에 따라 컬럼 정제를 수행합니다. RNA를 3개의 부분 표본으로 나누고 동일한 부피의 포름산을 첨가한 후 섭씨 40도에서 반응을 배양합니다. 각 반응이 완료되면 즉시 샘플을 드라이아이스에 동결하여 산 분해를 냉각합니다.원심 진공 농축기를 사용하여 샘플을 약 30분 동안 건조시킵니다. 건조된 샘플을 DEPC 처리된 물 20마이크로리터에 재현탁하고 결합합니다. LC-MS 측정이 이루어질 때까지 시료를 섭씨 20도에서 보관합니다.이동상을 준비한 후 RNA 샘플을 LC-MS 샘플 바이알로 옮깁니다. 각 주입에는 100-400개의 피코몰의 RNA와 20마이크로리터가 포함되어야 합니다. 데이터를 수집한 후 분자 특징 추출 워크플로우를 사용하여 질량, 머무름 시간, 부피 및 품질 점수를 포함한 화합물 정보를 추출합니다.소분자 설정에서 중심 데이터 형식을 사용합니다. 최고 높이를 100 이상, 1, 000 미만으로 설정하고 품질 점수를 50 이상으로 설정합니다. 마지막으로 데이터를 Excel 파일로 내보냅니다.5' 사다리 및 기타 원치 않는 단편에서 3' 사다리의 분리는 여기에 2D 질량 유지 시간 플롯에 나와 있습니다. 또한 각 RNA에서 5' 비오틴 라벨을 사용하여 길이가 다른 두 개의 RNA 가닥을 포함하는 혼합 샘플을 염기서열분석하는 것도 가능합니다. 우리딘과 슈도우리딘을 구별하기 위해, RNA는 슈도우리딘을 CMC-슈도우리딘 부가물로 변환하는 CMC로 처리되었습니다.부가물은 우리딘에서 다른 질량을 가지며 2D-HELS MS 염기서열에서 구별될 수 있습니다. 슈도우리딘을 CMC-부가물로 전환하는 반응의 조질 생성물의 HPLC 프로파일을 사용하여 변환 비율을 계산했으며, 이는 42%5개의 서로 다른 RNA 가닥의 혼합물을 3'말단 라벨링을 사용한 2D-HELS MS 염기서열 분석 접근법에 의해 염기서열분석되고 여러 RNA 염기서열의 더 나은 시각화를 위해 정규화되었습니다. 정규화가 없으면 5개의 RNA 염기서열에 대한 문자 코드가 함께 붐빌 것입니다.이 절차를 시도하는 동안 라벨링된 RNA 샘플의 높은 수율을 얻을 수 있도록 라벨링 반응을 신중하게 설정하십시오. 또한 분해 시간을 주의 깊게 모니터링하여 신뢰할 수 있는 질량 래더를 만들고 20마이크로리터의 물로 최대한의 건조 샘플을 수집합니다. 이 프로토콜을 수행한 후 질문할 수 있는 질문은 시퀀싱 방법의 너비, 길이 및 처리량을 늘리는 방법입니다.더 나은 알고리즘과 더 높은 해상도와 감도를 가진 더 발전된 기기가 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜이 개발된 후, CDA 기반 RNA 염기서열분석과 관련된 오류 없이 표준 뉴클레오티드와 변형된 뉴클레오티드를 모두 포함하는 더 넓은 범위의 RNA 샘플을 직접 염기서열분석하는 것이 가능해졌습니다.

2d-hels-ms-seq-general-lc-ms-based-method-for-direct-de-novo

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

MicroRNA(miRNA)는 널리 보존된 조절 분자 부류입니다. 여기에서는 두 가지 강력한 ligation 단계와 high-throughput sequencing에 의존하는 miRNA 클로닝 방법에 대해 설명합니다. 당사의 방법은 miRNA의 정확한 게놈 전체 정량을 가능하게 합니다.

높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고

유전자 발현, 돌연변이 및 유전자 융합에 대해 선택된 전사체를 조사하기 위한 데이터 분석을 사용한 색인화된 cDNA 라이브러리 준비, 혼성화 및 캡처를 포함하는 표적 RNA 염기서열분석 기반 방법을 설명합니다. Targeted RNAseq를 사용하면 데스크톱 염기서열분석기에서 선택된 전사체를 비용 효율적이고 신속하게 평가할 수 있습니다.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

우리는 RNA 의무적인 단백질을 확인 하 고 중재 하는 UV photocrosslinking 및 질량 분석을 사용 하 여 라이브 셀에서 그들의 RNA 바인딩 영역 지도를 프로토콜을 설명 합니다.

질량 분석 기반 식별 RNA 바인딩 영역에 대 한 샘플 준비

이 프로토콜 매핑 사전 mRNA 3' 최종 사이트를 처리 하는 방법을 설명 합니다.

3' 끝 시퀀싱 A seq2 라이브러리 준비

우리는 표준 방법 보다는 더 적은 편견을 가진 상세한 작은 RNA 라이브러리 배상 프로토콜 및 2'-O-메틸 RNA를 위한 증가한 감도를 제시합니다. 이 프로토콜은 비용을 절감하기 위해 수제 시약을 사용하거나 편의를 위해 키트를 사용하여 따를 수 있습니다.

작은 RNA-seq 개선: 2'-O-메틸 RNA의 더 적은 편견 및 더 나은 검출

우리는 13C/ 15N 라벨 및 1 H R1θ  이완 분산 핵 자기 공명 (NMR) 분광기로 표시되지 않은 RNA에 마이크로 밀리초 역학을 측정하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 초점은 NMR 실험의 고순도 샘플 준비 및 설정에 있습니다.

RNA의 1 H R 1θ 이완 분산 실험의 샘플 준비 및 설치의 실제적인 양상

RNA의 전사 후 변형은 최근에 중추 신경계 가소성과 관련이있는 번역 조절의 과소 연구 된 층을 나타냅니다. 여기에서, 샘플 준비 및 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분광법 접근법은 단일 뉴런에서 수많은 RNA 변형의 동시 특성화를 위해 기술된다.

질량 분광법을 사용하여 단일 뉴런의 RNA 변형 특성화

이 프로토콜은 돌연변이 프로파일링 실험을 위해 디메틸 설페이트로 RNA를 변형하기 위한 지침을 제공합니다. 여기에는 두 가지 대체 라이브러리 준비 방법을 사용한 시험관 내 및 생체 내 프로빙이 포함됩니다.

디메틸 설페이트를 사용한 RNA 구조 프로빙 시험관 내 및 세포에서 시퀀싱을 사용한 돌연변이 프로파일링

절대 정량 RNA 염기서열분석(AQRNA-seq)은 생물학적 혼합물에서 모든 소형 RNA의 환경을 정량화하기 위해 개발된 기술입니다. 여기에서는 AQRNA-seq의 라이브러리 준비 및 데이터 처리 단계를 모두 시연하여 기아 유발 휴면 기간 동안 Mycobacterium bovis BCG의 전달 RNA(tRNA) 풀의 변화를 정량화합니다.

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

이 프로토콜은 초보 생물정보학자를 위한 comparative de novo transcriptome assembly and annotation workflow를 간략하게 설명합니다. 워크플로우는 CyVerse를 통해 완전히 무료로 사용할 수 있으며 데이터 스토어로 연결됩니다. 명령줄 및 그래픽 사용자 인터페이스가 사용되지만 필요한 모든 코드를 복사하여 붙여넣을 수 있습니다.

CyVerse 리소스 활용<em&gt; 드 노보</em&gt; 비포장 (비 모델) 생물의 비교 전이학

배우세요 2D-HELS MS SEQ 방법으로 cDNA 없이 직접 RNA 염기서열을 분석하는 기술입니다. 단일가닥 및 변형 RNA를 동시에 정밀하게 분석하여 후성전사체학 연구와 질병 진단에 활용할 수 있습니다.

2D-HELS MS 염기서열분석(2D-HELS MS SEQ): 뉴클레오티드 변형이 다른 RNA 혼합물의 직접 및 새로운 염기서열분석을 위한 일반적인 LC-MS 기반 방법

더 많은 동영상 탐색