해마의 생체 내 해부학 및 기능적 추적

현재 프로토콜은 생체 내 신경 회로의 신경 해부학적 및 전기 생리학적 추적을 결합하기 위한 저렴하고 간단한 방법을 분석합니다. 이 기술을 사용하면 특정 뉴런 집단에서 표적 부위까지 보조 말단을 매핑할 수 있습니다. 마찬가지로, 이러한 말단에 대한 해부학적 지도는 표적 부위에서 세포 외 기록 중 광유전학적 자극에 의해 검증될 수 있습니다.

이 프로토콜은 감각, 운동 및 인지 기능과 관련된 여러 신경 회로를 연구하는 데 적용할 수 있습니다. 이 절차를 수행하려면 설치류 정위 수술 및 섬세한 신경 전극 취급에 대한 지식이 필요합니다. 녹음 시 소음을 방지하기 위한 녹음 시스템 연결입니다.

시각적 데모는 생체 내 광유전학을 위한 저렴한 LED 시스템을 설정하는 기본 단계를 강조합니다. 또한 마취된 마우스에서 동기화된 녹음 및 자극을 위해 앰프를 LED 드라이버와 연결하는 방법을 보여줍니다. 입체 프레임에 가열 패드를 놓고 마우스 본체가 그 위에 누워 절차 내내 체온을 유지하는 데 도움이 되도록 한 다음 정위 장치에 머리를 부드럽게 고정합니다.

먼저 요오드 용액으로 수술 부위를 청소한 다음 알코올로 요오드를 제거하여 수술 부위를 준비합니다. 다음으로, 국소 리도카인을 바르면 두피의 감각을 차단할 수 있습니다. 그런 다음 메스를 사용하여 전두부에서 후두부까지 정중선을 절개합니다.

복부 피개 영역 또는 VTA 주사의 경우, 브레그마를 기준으로 전방 3.08mm 전방과 0.5mm 내측 측면 좌표에서 초미세 뭉툭한 점 바늘 주사기를 배치합니다. 드릴링 도구를 사용하여 표시된 좌표의 두개골에 1mm 구멍을 뚫습니다. 제조업체의 지침에 따라 주사기 홀더를 미세 조작기에 고정하고 주사기에 이중 증류수를 채워 유체의 흐름을 청소하고 테스트하십시오.

그런 다음 주사기의 흐름을 테스트하기 위해 물을 분배합니다. 아데노 관련 바이러스 또는 AAV 칵테일의 부분 표본을 얼음에서 해동합니다. 거치된 주사통을 1개, AAV 해결책의 000 나노리터로 채우고 액체의 교류를 확인하기 위하여 해결책의 10 나노리터를 분배하십시오.

마이크로 매니퓰레이터를 사용하여 바늘을 주사 부위로 내리고 600-800 나노리터의 AAV를 VTA에 주입하여 분당 60 나노리터로 용액을 전달합니다. AAV 주사 3주 후, 앞서 설명한 대로 동물의 머리를 정위 프레임에 부착하고 경막을 노출시키기 위해 개두술을 수행합니다. 드릴링 도구를 사용하여 두정골의 일부를 제거합니다.

해부 현미경 아래에서 구부러진 27 게이지 바늘 끝을 사용하여 노출된 경막을 절제하되 이 부위의 섬세한 박리 덮개와 피질 조직이 분리되지 않도록 주의하십시오. 건조함을 방지하기 위해 개두술 부위에 인공 뇌척수액을 한 방울 떨어뜨립니다. 후두골에 구멍을 뚫어 접지 나사를 잡고 스테인리스 스틸 접지선을 연결합니다.

캐뉼러를 내리기 전에 광섬유 케이블을 광섬유 결합 LED 소스에 연결하십시오. 400마이크로미터 직경의 광섬유를 AP 네거티브 3.08mm 및 ML 0.5mm 좌표에서 VTA로 낮춥니다. micromanipulator를 사용하여 전극 접촉 부위를 CA1의 피라미드 세포층에 배치합니다.

광 펄스를 신경 기록과 동기화하려면 LED 드라이버와 기록 컨트롤러 디지털 가져오기를 BNC 스플리터를 사용하여 트랜지스터-트랜지스터 로직 펄서에 연결합니다. 손잡이를 조정하여 광전 아티팩트를 생성하지 않고 반응을 생성할 수 있는 유효 강도를 결정하고 두개골의 접지를 어댑터의 접지에 연결합니다. 사전 연결ampliifier 헤드 stage를 직렬 주변 장치 인터페이스 케이블을 통해 녹음 컨트롤러에 연결하고 녹음 컨트롤러 포트의 LED 색상 표시등을 확인합니다.

녹색 및 노란색 LED는 연결된 볼륨의 적절한 전압을 나타냅니다. liifier 보드와 빨간색 LED는 작동하는 소프트웨어 헤드 스테이지 컨트롤을 나타냅니다. 소프트웨어를 실행한 후 데이터 파일 형식을 선택하고 파일 이름을 변경합니다. 연결된 헤드 스테이지의 포트로 전환하고 전극의 채널이 헤드 스테이지보다 적은 경우 포트에서 모두 비활성화를 클릭합니다.

화면에 표시할 적절한 채널 수를 선택합니다. 동기화된 신경 기록 및 광 펄스 트리거 타임스탬프에 대한 TTL 타임스탬프를 캡처하려면 디지털 가져오기를 클릭하고 0 1에서 디지털을 활성화합니다. 이것은 증폭기 디지털 가져오기의 BNC 연결과 일치해야 합니다.

적절한 파형 표시를 위해 시간 척도와 전압 척도를 조정하고 샘플링 속도를 선택하되, 샘플링 속도와 채널 수가 높을수록 파일 크기가 커진다는 점을 염두에 두십시오. 다음으로, 단일 장치 녹음을 위한 증폭기 대역폭을 설정합니다. 여기에는 300-5, 000 헤르츠 차단 주파수가 사용되었습니다.

스파이크 사운드의 경우 아날로그 출력 오디오를 클릭하고 아날로그 포트를 활성화합니다. 그런 다음 최적의 사운드를 위해 게인과 소음기를 조정합니다. 증폭기 기록과 광 펄스 트레인을 동기화하려면 디스플레이 탭을 클릭하고 show marker를 활성화합니다.

BNC 연결에 해당하는 적절한 채널로 전환하고 포트를 다시 검사하여 기록 채널과 디지털 입력 채널이 신경 스파이크 및 광 펄스 타임스탬프를 캡처할 수 있는지 확인합니다. 스파이크 범위를 클릭하면 연속적으로 기록된 스파이크 트레인을 구성하는 파형을 볼 수 있습니다. 마우스를 사용하여 표시할 파형의 임계값을 설정합니다.

그런 다음 RMS를 검사하여 녹음의 노이즈 수준을 확인합니다. 아데노 관련 바이러스 발현은 주사 후 21일 후 마우스의 복부 피개 영역에서 EYFP의 면역형광 이미징에 의해 확인되었습니다. 형광 이미징은 또한 해마층 DG, CA3 및 CA1에서 시냅스 전 VTA 글루타메이트 돌기를 감지하는 데 사용되었습니다.

세포 외 전압 활동이 감지되면 원하는 주파수에서 광 펄스를 트리거하기 전에 약 10분 동안 기준선 활동을 기록했습니다. 이를 통해 VTA 글루타메이트 광자극 전후의 CA1 추정 뉴런의 발화 또는 파열 속도를 비교할 수 있었습니다. 이 결과를 뒷받침하기 위해 광자극 전후의 CA1 네트워크 발화율에 대한 통계적 비교는 자극 후 기간에 상당한 증가를 보여주었습니다.

폭발을 감지하기 위한 래스터 트레인의 후속 분석은 또한 광자극 후 CA1 추정 피라미드 뉴런의 폭발률이 증가했음을 보여주었습니다. photosimulation에 대한 반응은 자극 부위에서 AAV 리포터 표정의 형광에 의해 확인되었습니다. 또한, 에 대한 설명은 반응성 추정 단위에 대한 기록 장소와 상관되어야 합니다.

이 방법은 행동 작업을 수행하는 깨어 있는 마우스에서도 수행할 수 있습니다. 이 경우 만성 이식형 프로브와 광섬유 캐뉼러를 사용해야 합니다. 이 기술은 표적 부위의 시냅스전 말단 분포와 시냅스전 말단의 조절을 조합하여 신경회로를 강력하게 추적하여 생체 내에서 표적 부위 반응을 감지할 수 있습니다.