Name: 대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 배우세요 대장암 3차원 스페로이드 배양에서 락토바실러스 세포없는 슈퍼네턴을 이용한 세포 사멸 평가 방법입니다. 이 기술은 항암 효과를 분석하고 신호전달 경로를 규명하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 한국과학기술연구원이 지원하는 '화학및 방사선측정기준 수립', 2020-GP2020-0003, '생체재료 및 의료융합측정기준 및 기술개발', '2020-GP2020-0004 프로그램 보조금'을 지원했다. 이 연구는 과학기술정보통신부(MSIT), 국립연구재단(NRF-2019M3A9F3065868), 보건복지부(MOHW), 한국보건산업진흥원(KHIDI, HI20C0558), 산업통상자원부(MOTIE), 산업통상자원부(MOTIE) 및 한국산업기술연구원(MOTIE)의 평가(MOTIE)20009350 지원했다. ORCID ID (유희민: 0000-0002-5951-2137; 강덕진: 0000-0002-5924-9674; 김세일: 0000-0003-3465-7118; 이주은: 0000-0002-2495-1439; 이진아: 0000-0002-3661-3701). 박창우에게 실험에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다.

1. 세균 세포 배양 및 유산 균 세포 없는 상체체의 준비 (LCFS)
참고: 단계 1.2 – 1.9 혐기성 챔버에서 실시됩니다.
<ol><li>L-시스테인이 들어 있는 MRS 한천 접시와 국물을 준비하고 오토클레이브를 통해 살균합니다.</li>
	<li>H2 혐기성 챔버에서 MRS 한천 플레이트를 20 ppm 산소로 37°C로 유지한 사전 배양한다.</li>
	<li>해동 유산균 세균육및 항마판을 세균배양으로 접종한다(도1A(i). </li>
	<li>단일 세균 식민지가 얻을 때까지 37 °C 및 20 ppm 산소에서 H2 혐기성 챔버에서 2 - 3 일 동안 박테리아를 배양한다.</li>
	<li>훈게이트 형 무성 배양 튜브를 세척하고 건조시십시오. 배양 튜브를 121°C에서 15분 동안 자동 클락.</li>
	<li>그런 다음 37°C 및 20 ppm 산소에서 H2 혐기성 챔버에서 튜브를 배양하여 산소를 제거합니다.</li>
	<li>튜브에 MRS 국물의 2 - 3 mL을 배치합니다. 부틸 고무 스토퍼로 튜브를 밀봉하고 캡을 나사.</li>
	<li>루프가 있는 단일 콜로니를 획득하여 1x PBS의 500 μL로 1.5mL 배양 튜브에 배치하십시오. (그림1A (ii)).</li>
	<li>1 mL 주사기를 사용하여 콜로니를 일시 중단(도 1A (iii) 이렇게 하면 튜브 뚜껑 중앙에 1mL 주사기의 바늘을 삽입하고 중단된 식민지를 흡입한 다음 MRS 국물 매체로 다시 다시 분리합니다. (그림1A (iv)).</li>
	<li>2 일 동안 셰이커 인큐베이터에서 MRS 국물 미디어를 배양 (37 °C, 5 % CO2,200 rpm).</li>
	<li>분광계를 사용하여 광학 밀도(OD)를 측정하여 OD620의 흡광도가 2.0에 도달할 때까지 세균 성장 곡선을 모니터링합니다.</li>
	<li>세균성 펠릿과 조건부 매체를 1,000 x g에서 15분 동안 원심분리하여 분리합니다. 수집된 세균성 펠릿을 1x PBS로 세척하고 10% 태아 소 혈청으로 보충된 RPMI 1640의 4mL에서 재연합니다. 배지에 항생제를 포함하지 마십시오.</li>
	<li>세균성 펠릿을 RPMI에서 유지하고 셰이커 인큐베이터에서 37°C에서 4시간 동안 5%CO2를 100rpm의 속도로 배양한다.</li>
	<li>프로바이오틱 상류제의 제조를 위해 원심분리를 통해 세균펠릿을 1000 x g에서15분 동안 제거하십시오. 멸균 필터는 0.22 μm 필터를 사용하여 회수 된 상체를 사용하고 사용전까지 -80 °C에 저장합니다.</li>
</ol>2. 스페로이드 생성
<ol><li>
대장암 세포주 준비
	<ol>
<li>DLD-1, HT-29 및 WiDr 세포주를 70-80%까지 단층층으로 성장시키고 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 플레이트를 배양합니다(성장 배지: 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-streptomycin)을 함유한 RPMI.</li>
		<li>100mm 페트리 접시로 자란 셀의 경우, 1x PBS의 4mL로 접시를 두 번 씻으시다. 0.25% 트립신-EDTA의 1mL을 추가하고 세포를 해리하기 위해 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 2분 동안 페트리 접시를 배양한다.</li>
		<li>인큐베이션 후 현미경으로 세포 해리를 확인하고 5mL의 성장 배지로 트립신-EDTA를 중화시한다.</li>
		<li>해리된 세포를 15mL 원물 관및 원심분리기로 300 x g로 3분 간 이송한다.</li>
		<li>상체를 버리고 성장 매체의 3mL로 부드럽게 다시 중단하십시오.</li>
		<li>혈종계를 사용하여 실행 가능한 세포를 결정하기 위해 트라이팬 블루로 세포를 계산합니다. (그림1B (i))</li>
	</ol>
</li>
	<li>
스페로이드 형성
	<ol>
<li>15mL 원물 관에서 세포를 2.1.5로부터 희석하여 1- 2 x 105 세포/mL(도 1B(ii)를얻습니다.</li>
		<li>세포 현탁액에 0.6%의 메틸셀룰로오스의 최종 농도를 추가하고 희석된 세포를 멸균 저장소로 옮길 수 있습니다. 참고: 각 세포주에 대해 필요한 메틸셀룰로오스의 양은 적정화되고 그에 따라 결정되어야 합니다.</li>
		<li>멀티채널 파이펫을 사용하여 200 μL의 셀을 초저 부착 96웰 라운드 하단 마이크로플레이트의 각 웰에 분배합니다. (그림1B (iii))</li>
		<li>플레이트를 37°C에서 24-36h의 5% CO2 인큐베이터에서 배양한다.</li>
		<li>24 - 36 시간 후, 스페로이드 형성을 보장하기 위해 가벼운 현미경으로 플레이트를 관찰하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. LCFS로 3D 대장 암세포 치료
<ol><li>2단계와 3단계에서 설명된 바와 같이 스페로이드를 생성합니다.</li>
	<li>LCFS 치료를 수행하기 전에 실온(RT)에서 10-20분 동안 냉동 LCFS를 해동하십시오.</li>
	<li>LCFS 주식 솔루션을 성장 매체로 접종합니다. 연속적으로 25%, 12.5%, 성장 매체의 6%로 희석합니다(즉, 25% LCFS = 성장 매체의 150 μL + LCFS의 50 μL).</li>
	<li>인큐베이터에서 스페로이드를 함유한 세포 배양판을 꺼내 200μL 파이펫을 사용하여 각 우물에서 가능한 한 많은 성장 배지를 제거합니다.</li>
	<li>세포에 LCFS를 사용하여 성장 매체를 추가하고 24 - 48h에 대한 5 % CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 배양한다. 참고: 사용되는 부피는 다음과 같이 플레이트 크기에 따라 달라집니다: 6웰 세포 배양 판에 대한 2mL; 96웰 세포 배양판을 위한 200 μL.</li>
</ol>4. 스페로이드에 대한 세포 생존 가능성
<ol><li>8 -10 LCFS 처리 된 대장암 스페로이드를 불투명 벽다중 음판에서 준비하십시오 (세포 생존 성 소는 LCFS 치료 후 48 h로 수행됩니다).</li>
	<li>하룻밤 동안 세포 생존 능력 시약 (재료의 표참조)을 4 °C에서 해동하십시오.</li>
	<li>사용 전에 세포 생존능력 시약을 실온에 상량화합니다.</li>
	<li>분석작업을 수행하기 전에 스페로이드에서 성장 미디어의 50%를 제거합니다.</li>
	<li>각 웰에 셀 생존 능력 시약 100 μL을 추가합니다. 참고: 사용할 부피는 다음과 같이 플레이트 크기에 따라 달라집니다: 96웰 세포 배양 판에 대한 100 μL.</li>
	<li>시약을 5분 동안 격렬하게 섞어 세포 용해를 촉진합니다.</li>
	<li>37 °C에서 30 분 - 2 시간 동안 배양하십시오.</li>
	<li>발광을 기록합니다.</li>
</ol>5. 스페로이드에 대한 정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 분석
<ol><li>각 조건에 대해 2mL 튜브에 10 - 15 스페로이드를 준비하고 원심 분리기는 400 x g에서 3 분 동안 준비하십시오.</li>
	<li>상체를 버리고 얼음 차가운 1 x PBS의 1 mL에서 스페로이드를 두 번 씻으십시오. 참고: 원심분리를 피하고 스페로이드가 정착하게 하십시오.</li>
	<li>가능한 한 1x PBS의 많은 흡인및 시판 가능한 키트를 사용하여 RNA를 분리합니다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 시판 되는 키트를 사용하여 RNA 1 μg에서 cDNA를 합성합니다.</li>
	<li>마스터 믹스를 준비하여 트리플리케이트로 모든 샘플을 실행합니다(표 1 및 표 2참조).</li>
	<li>템플릿 마스터 믹스의 20 μL에서 각 qPCR 플레이트에 증폭을 잘 수행합니다.</li>
	<li>반응을 잘 혼합하고 필요한 경우 회전합니다.</li>
	<li>계측기제조업체(표 3)의권장 사항에 따라 샘플을 실행합니다.</li>
</ol>6. 스페로이드에서 서양 블로팅
참고: 스페로이드를 수집할 때 200 μL 파이펫을 사용하고 팁 끝을 잘라 구조가 방해하지 않도록 하십시오.
<ol><li>각 조건에 대해 2mL 튜브에서 30 -40 스페로이드를 준비하십시오.</li>
	<li>튜브를 얼음 위에 놓고 스페로이드가 2mL 튜브의 바닥으로 정착하게 하십시오.</li>
	<li>상체를 버리고 1 mL 얼음 차가운 1 x PBS에서 스페로이드를 두 번 씻으십시오. 참고: 원심분리를 피하고 스페로이드가 정착하게 하십시오.</li>
	<li>가능한 한 1x PBS를 흡인하고 프로테아제 억제제 칵테일 (10 스페로이드 = RIPA 버퍼의 30 μL)와 RIPA 버퍼를 추가합니다.</li>
	<li>위아래로 파이펫팅하여 세포를 lyse하고 10 사이클 동안 얼음에 30 초 의 휴식과 함께 30 s에 대한 초음파 처리를 수행합니다.</li>
	<li>원심분리단백질은 4°C에서 15분 동안 15000 x g에서 15분 동안 리자트합니다.</li>
	<li>각 세포 용액에 대한 단백질 농도를 결정합니다.</li>
	<li>로드하기 전에 각 셀을 100°C에서 10분 동안 샘플 버퍼로 끓입니다.</li>
	<li>SDS-PAGE 젤의 우물에 동일한 양의 단백질을 적재하고 100 V에서 1 - 2 시간 동안 젤을 실행합니다.</li>
	<li>젤에서 PVDF 막으로 단백질을 전달합니다.</li>
	<li>이송 후, 블로킹 버퍼(0.05% Tween-20)를 사용하여 실온에서 1h의 멤브레인을 차단하십시오.</li>
	<li>1차항체(표 4)의1:1,000 희석제로 멤브레인을 배양하여 1x TBST에서 5% BSA 버퍼를 하룻밤 사이에 4°C로 배양한다.</li>
	<li>TBST로 멤브레인을 세 번, 세척할 때마다 15분 세척합니다.</li>
	<li>2 시간 동안 실온에서 차단 버퍼에서 이차 항체의 1:2,500 희석으로 멤브레인을 배양하십시오 (재료표참조).</li>
	<li>TBST로 멤브레인을 세 번, 세척할 때마다 15분 세척합니다.</li>
	<li>화학 발광 기판으로 HRP 검출을 위한 막을 준비합니다.</li>
	<li>화학 발광 이미지를 획득합니다.</li>
</ol>7. 스페로이드의 프로피듐 이오디드 (PI) 염색
<ol><li>4.1 단계에서 설명된 바와 같이 5-10 스페로이드를 준비하고 37°C 및 5% CO2의인큐베이터에 스페로이드를 배치한다.</li>
	<li>1x PBS에서 PI 1:100의 1 mg/mL 재고를 희석시하십시오.</li>
	<li>96웰 플레이트의 각 웰에서 배지의 50%를 제거합니다.</li>
	<li>각 우물에 PI 용액의 100 μL을 추가하고 37 °C에서 인큐베이터에 우물을 넣고 10 - 15 분 동안 5 % CO2를 배치하십시오.</li>
	<li>1x PBS로 PI 용액을 씻어내라.</li>
	<li>성장 배지의 200 μL을 추가하고 형광 현미경을 사용하여 이미지를 가져 가라. 이미지 J를 사용하여 형광 강도를 분석하여 스페로이드의 생존 가능성을 가져옵니다.</li>
</ol>8. 스페로이드의 FACS 분석
<ol><li>이전에 설명한 대로 스페로이드를 생성합니다.</li>
	<li>각 조건에 대해 FACS 튜브에 30-40 스페로이드를 준비하고 원심분리기는 400 x g및 RT에서 3분 동안 준비합니다.</li>
	<li>슈퍼나탄을 흡기하고 1x PBS의 3mL로 스페로이드를 세척한 다음 4°C에서 3분 동안 400 x g에서 원심분리기를 세척합니다.</li>
	<li>수퍼네티드를 흡인하고 0.25% 트립신-EDTA의 200 μL을 추가한 다음 RT에서 2-3분 동안 배양합니다. 참고: 잠복기 시간은 스페로이드 크기와 셀 유형에 따라 다릅니다.</li>
	<li>FACS 버퍼 1mL을 추가하고 200 μL 파이펫을 사용하여 스페로이드를 부드럽게 분리합니다.</li>
	<li>3 분 동안 400 x g 및 4 °C에서 해리 된 세포를 원심 분리합니다. 참고: FACS 버퍼 = 1x PBS + 2.5% FBS, 0.22 μm 상단 필터를 사용하여 필터링.</li>
	<li>상체를 폐기하고 7-AAD/부속서 V 시약(7AAD(5μL), 부속서 V(5 μL)/시료를 추가합니다.</li>
	<li>부드럽게 세포를 소용돌이와 어둠 속에서 RT에서 13 - 30 분 동안 배양.</li>
	<li>FACS 버퍼 500 μL을 추가하고 원물 폴리스티렌 테스트 튜브를 사용하여 세포를 필터링하여 집계 셀을 제거합니다.</li>
	<li>원심분리기 400 x g및 4°C에서 3분 동안.</li>
	<li>각 튜브에 500 μL의 부속서 V 바인딩 버퍼를 추가하고 다시 일시 중지합니다.</li>
	<li>유동 세포계를 사용하여 분석합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 관련 재무 공시가 없습니다.

인접한 세포및 세포외 매트릭스(ECM)를 포함하는 조직 미세환경은 조직 생성에 근본적이며 세포 성장 및 조직개발(13)의제어에 결정적인 역할을 한다. 그러나, 2D 배양은 세포 상호 작용의 중단과 같은 몇몇 단점이 있습니다, 세포 형태에 있는 변경, 세포 외 환경 및 분열 의 접근14. 3D 세포 배양 시스템은 생체 내 효과를 더 잘 재현하기 위해 엄격하게 연구되었으며, 체외암 검사15,16을위한 보다 정밀한 시스템으로 입증되었다. 화학요법17에대한 개인화된 반응을 보다 정확하게 예측하기 위한 모델 시스템이 필요하다.
3D 비계는 조직 공학을 위해 개발되었습니다. 그것은 종양 세포의 사용 가능한 공간을 나타내는 ECM의 대리 손실로 작용한다. 또한,...

프로바이오틱스는 면역 항상성을 개선하고 에너지 대사를 주최하는 장내 가장 유리한 미생물입니다1. 유산균과 비피도박테리움의 프로바이오틱스는장2,3에서발견되는 가장 진보된 프로바이오틱스입니다. 이전 조사는 유산 균이 여러 암에 억제 및 항증식 효과가 있음을 보여 주었다, 대장암을 포함4. 또한, 프로바이오틱스는 염증성 장질환, 크론병, 궤양성 대장염5,6을예방한다. 그러나, probiotics와 대부분의 연구 2 차원에서 수행 되었다 (2D) 단층 고체 표면에 성장.
인공 배양 시스템은 암세포에 자연적이지 않은 환경 적 특징이 부족합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 3차원(3D) 배양 시스템이7,8을개발하였다. 3D내암세포는 세포 생존가능성, 증식, 형태학, 세포통신, 약물 민감도, 생체내 관련성9,10과 같은 기본적인 생물학적 메커니즘의 측면에서 개선을 보여준다. 더욱이, 스페로이드는 대장암의 다세포형으로 만들어지며 세포 세포 상호작용 및 세포외 매트릭스(ECM)11에의존한다. 우리의 이전 연구는 유산 균 발효를 사용 하 여 생산 하는 probiotic 세포 무료 supernatant (CFS) 대장암의 3D 배양에 항 암 효과 보여 보고 (CRC) 세포12. 우리는 CFS가 3D 스페로이드12에프로바이오틱 효과를 테스트하기위한 적절한 대체 전략이라고 제안했다.
여기서, 우리는 몇몇 3D 대장암 모방 시스템에 probiotic 세포 없는 supernatant (CFS)의 치료 효과의 분석을 위해 3D 대장암의 다세포 모형을 수용할 수 있는 접근법을 제시합니다. 이 방법은 체외에서 관련 프로바이오틱 및 항암 효과의 분석을 위한 수단을 제공한다.

<table><tbody><tr><td> 10% Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 단백질 겔, 15-well, 15 &micro; l</td><td>Biorad</td><td>4561036</td><td>10</td></tr><tr><td>Applied Biosystems MicroAmp 광학 접착 필름</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>100 커버</td></tr><tr><td>10x 전송 버퍼</td><td>Intron</td><td>IBS-BT031A</td><td>1 L</td></tr><tr><td>10X Tris-Glycine (W/SDS)</td><td>Intron</td><td>IBS-BT014</td><td>1 L</td></tr><tr><td>Axygen 2.0 mL MaxyClear Snaplock 마이크로 원심분리기 튜브, 폴리프로필렌, 투명, 비멸균, 500 튜브/팩, 10 팩 / 케이스</td><td>Corning</td><td>SCT-200-C</td><td>500 튜브 / 팩, 10 팩 / 케이스</td></tr><tr><td>BD Difco Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>500 g</td></tr><tr><td>BD Difco Lactobacilli MRS Broth</td><td>BD</td><td>DF0881-17-5</td><td>500 g</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D 세포 생존력 분석</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>100&mu; 96웰 플레이트의 l/분석</td></tr><tr><td>완전한 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>시그마-알드리치</td><td>11697498001</td><td>20</td></tr>정 <tr><td>코닝 인산염 완충 식염수, 칼슘과 마그네슘이 없는 1X, PH 7.4 & 0.1</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon-P PVDF 전사 멤브레인</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>IPVH00010</td><td>26.5cm x 3.75m 롤; 기공 크기: 0.45um</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL 라운드 바닥 폴리스티렌 시험관, 셀 스트레이너 포함 Snap Cap</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>25/Pack, 500/Case</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, 인증, 미국 원산지</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>iScript cDNA 합성 키트, 25 x 20 &micro; l rxns #1708890</td><td>Biorad</td><td>1708890</td><td>25 x 20 &마이크로; L rxns</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Biorad</td><td>1725121</td><td>5 x 1 mL</td></tr><tr><td>락토바실러스 퍼멘텀</td><td>유형 배양을 위한 한국 컬렉션</td><td>KCTC 3112</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine hydrochloride monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6852-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Methyl Cellulose (3500-5600mPa&middot; s, 20°C에서 물에 2%; C)</td> <td>TCI</td><td>M0185</td><td>500g</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Optical 96-Well 반응 플레이트(바코드 포함), 0.1mL</td><td>Applied Biosystems</td><td>4346906</td><td>20 플레이트</td></tr><tr><td>Millex-GS 주사기 필터 장치, 0.22 &마이크로; m, 혼합 셀룰로오스 에스테르, 33mm, 에틸렌 옥사이드 멸균</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>250</td></tr><tr><td>PE Annexin V Apoptosis Detection Kit with 7-AAD</td><td>Biolegend</td><td>640934</td><td>100 tests</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Introgen</td><td>P1304MP</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>RIPA 용해 및 추출 버퍼</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89901</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>250</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875-119</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>재료/장비/소프트웨어 이름</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments/Description</td></tr><tr><td>anti - p-I&kappa; B&알파; (나-9)</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-8404</td><td>200 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>안티-BclxL (H-5)</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-8392</td><td>200 &마이크로; g/mL</td></tr><tr><td>안티-PARP 1 (C2-10)</td><td>산타 크루즈</td><td>sc-53643</td><td>50 &마이크로; l 복수</td></tr><tr><td>항 -> - actin (C4)</td> <td>산타 크루즈</td><td>sc-47778</td><td>200 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>BD FACSVerse</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>샌디에이고, 캘리포니아, 미국</td></tr><tr><td>Synergy HTX 다중 모드 마이크로플레이트 리더</td><td>BioT</td><td>S1LFA</td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo fisher</td><td>HERAcell 150i</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 15ml</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 50ml</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 초저 부착 다중 웰 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7007</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 초저 부착 다중 웰 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3471</td><td></td></tr><tr><td>Costar 50mL 시약 저장용기, 5/백, 멸균</td><td>Costar</td><td>4870</td><td></td></tr><tr><td>Countess 세포 계수 챔버 슬라이드</td><td>Thermofisher</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II FL 자동 세포 계수기</td><td>invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AMQAF1000 EnSpire 멀티모드 리더</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Enspire 2300</td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 멀티 채널 피펫, 8채널</td><td>Eppendorf</td><td>3122000051</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 소프트웨어</td><td>TreeStar</td><td></td><td>미국 오리건주 애쉬랜드</td></tr>, 염소 <tr><td>안티 마우스 IgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>115-035-062</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>염소 안티 래빗 IgG (H+L)</td><td>Jackson immunoresearch</td><td>111-035-144</td><td>2.0 mL</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5</td><td>GraphPad Software</td><td></td><td>Inc., San Diego, CA, USA</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000 mini</td><td>Fujifilm</td><td></td><td>Tokyo, Japan</td></tr><tr><td>인큐베이션 쉐이커</td><td>랩 컴패니언</td><td>SIF-6000R</td><td></td></tr><tr><td>멀티 게이지 Ver. 3.0,</td> <td>후지필름</td><td></td><td>일본 도쿄</td></tr><tr><td>광학 밀도 (OD)LAMBDA UV/Vis 분광 광도계</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Waltham, MA, USA</td></tr><tr><td>위상차 현미경</td><td>Olympus</td><td></td><td>일본 도쿄</td></tr><tr><td>SPL 마이크로 원심분리기 튜브 1.5mL</td><td>SPL</td><td>60015</td><td></td></tr><tr><td>SPL 다중 채널 저장소, 12-Chs, PS, 멸균</td><td>SPL</td><td>21012</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus Real-Time PCR 시스템</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>미국 매사추세츠주 월섬</td></tr><tr><td>Vibra-Cell 초음파 액체 프로세서</td><td>SONICS-vibra cell</td><td>VC 505</td><td>500W 초음파 프로세서</td></tr><tr><td>비닐 혐기성 챔버</td><td>COY LAB PRODUCTS</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

이 원고는 프로바이오틱스배양으로 간주되는 유산균 발효 세포 배양에서 수퍼나티를 사용하여 암세포의 다세포 유형의 3차원(3D) 스페로이드에서 암세포 사망을 평가하는 프로토콜을 설명합니다. 유산균 세포 없는 상퍼나탄(LCFS)을 테스트하기 위해 3D 배양을 사용하는 것은 특히 L. 발효가 장 내항암 효과를 생성할 수 있기 때문에 2D 단층에서 테스트하는 것보다 더 나은 옵션입니다. L. 발효 상체는 3D 배양 조건에서 여러 대장암(CRC) 세포에 대한 증식 효과를 보유한 것으로 확인되었다. 흥미롭게도, 이러한 효과는 암세포 사망을 유도하는 L. 발효의 주목할 만한 능력을 입증하는 배양 모델과 강하게 관련이 있었다. 안정스페로이드는 아래에 제시된 프로토콜을 사용하여 다양한 CRC(대장암세포)로부터 생성되었다. 3D 스페로이드를 생성하는 이 프로토콜은 시간 절약및 비용 효율적입니다. 이 시스템은 여러 유형의 CRC 스페로이드에서 LCFS의 항암 효과를 쉽게 조사하기 위해 개발되었습니다. 예상대로, 실험 중 LCFS로 치료된 CRC 스페로이드는 qRT-PCR, 서부 블로팅 및 FACS 분석에 의해 분석된 특정 세포사멸 분자 마커를 발현하였다. 따라서, 이 방법은 세포 생존가능성을 탐구하고 항암제의 효능을 평가하는 데 유용하다.

우리는 다양한 대장암 세포주로부터 스페로이드를 얻는 프로토콜을 설명합니다. 메틸셀룰로오스를 보충하셔야 스페로이드를 생성해야 했습니다. 우리는 또한 LCFS 준비의 방법을 제시하고 프로바이오틱스와 대장암 사이의 상관 관계를 연구하는 모델을 제시한다. 스페로이드 형성 및 LCFS 준비 프로토콜은 도 1A,B에괄호로 도시된다. 도 2A에도시된 바와 같이, 메틸셀룰로오스 농도는 0.6%로 암세포를 소형 스페로이드로 변환합니다. 이 결과는 스페로이드가 우리의 메틸셀룰로오스 프로토콜을 사용하여 대장암의 여러 모형에서 생성될 수 있다는 것을 표시합니다. 다음으로, 스페로이드는 25% LCFS로 처리되었고 형태는 48시간 후에 가벼운 현미경을 사용하여 연구하였다. 그림 3A에도시된 바와 같이, LCFS로 처리된 그룹의 스페로이드는 중단된 표면을 나타낸다....

여기에서 방법은 유산균 세포 없는 상체 (LCFS)의 항암 효과를 이해하기 위하여 제시됩니다. 대장암 세포선은 3D 배양에서 LCFS로 치료할 때 세포 사망을 보여줍니다. 스퍼로이드를 생성하는 과정은 스캐폴드와 제시된 분석 방법에 따라 최적화될 수 있으며 관련 시그널링 경로를 평가하는 데 유용하다.

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

이 프로토콜은 여러 유형의 대장암 세포 스페로이드에서 락토바실러스 무세포 상등액의 항암 효과를 보다 쉽게 조사할 수 있도록 최적화되었습니다. 이 기술은 in vivo 모방 조건에서 대장암 스페로이드에 대한 LCFS의 항암 효과를 조사하는 최초의 접근 방식입니다. 먼저 오토클레이브 멸균 MRS 한천 플레이트를 섭씨 37도의 수소 혐기성 챔버에 20ppm의 산소가 함유된 상태로 배치하고 갓 해동된 락토바실러스 박테리아 스톡을 플레이트에 접종합니다.L-시스테인이 보충된 MRS 육수 2-3ml를 튜브에 넣고 부틸 고무 마개와 튜브 캡으로 튜브를 밀봉합니다. 다음으로, 루프를 사용하여 단일 콜로니를 수집하고 콜로니를 500마이크로리터의 PBS가 들어 있는 1.5ml 배양 튜브에 넣습니다. 식염수 내에서 균질하게 군체를 재현탁하고 전체 박테리아 현탁액을 1ml 주사기에 로드합니다.바늘을 배양 튜브 뚜껑 중앙에 삽입하고 콜로니를 배지에 전달합니다. 배양물을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 분당 200회전의 진탕 인큐베이터에 넣습니다. 이틀 후 분광 광도계에서 배양의 OD620을 측정합니다.OD620이 2와 같을 때 원심분리로 박테리아를 침전하고 박테리아 펠릿을 PBS로 세척합니다. 두 번째 원심분리 후, 항생제 없이 10%의 소 태아 혈청을 보충한 RPMI 1640 4ml에 박테리아를 재현탁시키고 박테리아를 분당 100회전으로 4시간 동안 진탕 인큐베이터에 넣습니다. 배양이 끝나면 원심 분리로 박테리아를 펠릿화하고 멸균 필터로 회수된 상등액을 0.22미크론 스트레이너를 통해 섭씨 영하 80도의 보관을 합니다.스페로이드 형성을 위해 결장직장암 세포주를 준비하려면 세포 배양 인큐베이터에서 100mm 페트리 접시에서 관심 세포를 단층으로 배양합니다. 세포가 70-80% 밀도에 도달하면 세척당 4ml의 PBS로 배양액을 두 번 세척한 후 접시당 1ml의 0.25%트립신-EDTA로 세포를 분리합니다. 2분 후 광학 현미경으로 해리를 확인합니다.세포가 분리된 경우 5ml의 성장 배지로 효소 반응을 중화합니다. 세포 배양당 15ml 원추형 튜브 1개에서 원심분리를 통해 세포를 수집하고 튜브당 3ml의 성장 배지로 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음 trypan blue exclusion을 통해 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다.계산 후에, 신선한 매체에 있는 밀리리터 농도당 5번째 세포에 10에 1개에서 2개의 곱셈으로 세포를 묽게 하고 마지막 0.6% 농도에 세포에 메틸셀룰로오스를 추가하십시오. 세포를 멸균 저장소로 옮기고 멀티채널 피펫을 사용하여 200마이크로리터의 세포를 초저 부착 96웰 원형 바닥 마이크로플레이트의 각 웰에 분주합니다. 그런 다음 광학 현미경으로 스페로이드 형성을 확인하기 전에 24-36시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다.LCFS 처리를 위해 제조된 해동된 LCFS 원액을 신선 성장 배지에서 25, 12.5 및 6% 농도로 연속적으로 희석하고 200마이크로리터 피펫을 사용하여 도금된 대장암 세포주 배양의 각 웰에서 가능한 한 많은 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 LCFS 보충 성장 배지를 각 암세포 세트에 3회씩 부드럽게 첨가하고 추가로 24-48시간 동안 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 메틸셀룰로오스 농도 0.6%는 테스트된 암 세포주 세포를 소형 스페로이드로 변환하며, 이는 이 프로토콜을 사용하여 여러 유형의 결장직장암에서 스페로이드를 생성할 수 있음을 나타냅니다.25%LCFS로 배양된 스페로이드는 용량 의존적 방식으로 표면이 파쇄되고 세포 생존율이 감소합니다. 실제로, LCFS 공동 배양 세포는 생존 가능한 대조 세포에 비해 더 높은 수준의 프로피듐 요오드화물 발현을 보여줍니다. 역전사효소 PCR 분석, 웨스턴 블로팅 및 유세포 분석 Annexin V/7-AAD 분석을 수행하여 암세포 사멸에 대한 LCFS의 효과를 평가할 수도 있습니다.성장 배지를 제거할 때는 스페로이드가 쉽게 파괴되어 LCFS 처리의 효과를 관찰할 수 없으므로 스페로이드를 부드럽게 다루십시오. 이 절차에 따라 세포 생존율 분석, 정량적 real-time PCR, 웨스턴 블로팅 및 FACS 분석을 수행하여 LCFS의 항암 효과를 보다 자세히 특성화할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

스페로이드는 2D 세포 배양 단층 모델에 비해 세포의 환경을 보다 정확하게 표현하는 데 사용되는 3D 세포 배양 모델의 한 유형입니다. 예시 프로토콜에서는 과학자들이 결장직장암 세포주에서 스페로이드를 생성하고 라이브 셀 이미징을 적용하여 스페로이드의 성장을 추적하는 것을 볼 수 있습니다.

세포주에서 스페로이드 생성: 3차원(3D) 세포 배양 방법

이 비디오는 락토바실러스 무세포 상등액(LCFS)의 항암 효과를 연구하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. 결장직장암 스페로이드를 다양한 용량의 LCFS에 노출시키면 LCFS의 박테리아 대사 산물과의 상호 작용은 암세포의 세포사멸을 유도하여 스페로이드 구조를 파괴하고 용량 의존적 방식으로 세포 사멸을 초래합니다.

락토바실러스 무세포 상등액의 항암 효과를 평가하기 위한 분석

여기, 췌장암 세포 및 섬유 아 세포, 세포 외 유출 분석기를 사용 하 여 대사 기능을 측정 하 여 다음의 3 차원 (3D) 회전 타원 체 공동 문화의 준비에 대 한 메서드를 설명 합니다.

준비 및 췌장암 세포 및 섬유 아 세포의 3 차원 회전 타원 체 공동 문화의 변화 분석 결과

이 프로토콜에 대 한 3 차원 구조적된 암 세포 (spheroids)에서 실시간으로 immunotherapeutic 리디렉션된 T-셀 (자동차 T-세포) 세포 독성을 평가 하기 위해 설계 되었습니다.

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

이 프로토콜은 Caco2 결장 아데노암종 세포에서 3차원 스페로이드를 생성하고 성장시키는 새로운 견고하고 재현 가능한 배양 시스템을 제공합니다. 결과는 화학요법에 대한 반응을 포함하여 암 줄기 세포 생물학을 공부하는 이 접근의 적합성을 위한 개념증명을 제공합니다.

대장암 줄기세포를 연구하는 스페로이드의 3차원 모델

유방 상피 세포와 내피 세포 사이 교차 토크는 중요한 유방암 진행에 기여, 종양 성장, 및 전이. 이 연구에서는, 스페로이드는 혈관 및/또는 림프 성 내피 세포와 함께 유방암 세포에서 만들어졌으며 유방암 연구를위한 체외 시스템으로서 자신의 적용성을 입증했습니다.

유방암 연구를 위한 잠재적인 기능적인 시험관 내 모형으로 유방 상피 및 내피 세포 스페로이드

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

여기에서는 항종양 항체의 중요한 암세포 사멸 기전인 ADCC 기전을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제시합니다. NK 세포의 세포독성 효과는 트라스투주맙이 있는 유방암 세포 스페로이드에서 측정됩니다. 이미지 분석은 스페로이드에서 살아있는 킬러와 죽은 킬러와 표적 세포를 식별합니다.

종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

이 프로토콜은 사이토카인(cytokine)과 같은 세포독성 섭동(cytotoxic perturbagens)에 반응하여 인간 결장 오가노이드에서 세포 사멸을 조사하고 정량화하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 설명합니다. 이 접근법은 형광 세포 사멸 염료(SYTOX Green Nucleic Acid Stain), 생 형광 현미경 및 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 세포독성 자극에 대한 단일 오가노이드 반응을 정량화합니다.

Live Fluorescence Microscopy를 사용한 인간 결장 오가노이드의 Cytokine 유도 세포 사멸 정량화

배우세요 대장암 3차원 스페로이드 배양에서 락토바실러스 세포없는 슈퍼네턴을 이용한 세포 사멸 평가 방법입니다. 이 기술은 항암 효과를 분석하고 신호전달 경로를 규명하는 데 활용됩니다.

대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가

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