대장암세포의 3차원 스페로이드 배양에서 프로바이오틱스의 세포없는 슈퍼네탄을 사용하여 세포 사멸 평가

이 프로토콜은 여러 유형의 대장암 세포 스페로이드에서 락토바실러스 무세포 상등액의 항암 효과를 보다 쉽게 조사할 수 있도록 최적화되었습니다. 이 기술은 in vivo 모방 조건에서 대장암 스페로이드에 대한 LCFS의 항암 효과를 조사하는 최초의 접근 방식입니다. 먼저 오토클레이브 멸균 MRS 한천 플레이트를 섭씨 37도의 수소 혐기성 챔버에 20ppm의 산소가 함유된 상태로 배치하고 갓 해동된 락토바실러스 박테리아 스톡을 플레이트에 접종합니다.

L-시스테인이 보충된 MRS 육수 2-3ml를 튜브에 넣고 부틸 고무 마개와 튜브 캡으로 튜브를 밀봉합니다. 다음으로, 루프를 사용하여 단일 콜로니를 수집하고 콜로니를 500마이크로리터의 PBS가 들어 있는 1.5ml 배양 튜브에 넣습니다. 식염수 내에서 균질하게 군체를 재현탁하고 전체 박테리아 현탁액을 1ml 주사기에 로드합니다.

바늘을 배양 튜브 뚜껑 중앙에 삽입하고 콜로니를 배지에 전달합니다. 배양물을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 분당 200회전의 진탕 인큐베이터에 넣습니다. 이틀 후 분광 광도계에서 배양의 OD620을 측정합니다.

OD620이 2와 같을 때 원심분리로 박테리아를 침전하고 박테리아 펠릿을 PBS로 세척합니다. 두 번째 원심분리 후, 항생제 없이 10%의 소 태아 혈청을 보충한 RPMI 1640 4ml에 박테리아를 재현탁시키고 박테리아를 분당 100회전으로 4시간 동안 진탕 인큐베이터에 넣습니다. 배양이 끝나면 원심 분리로 박테리아를 펠릿화하고 멸균 필터로 회수된 상등액을 0.22미크론 스트레이너를 통해 섭씨 영하 80도의 보관을 합니다.

스페로이드 형성을 위해 결장직장암 세포주를 준비하려면 세포 배양 인큐베이터에서 100mm 페트리 접시에서 관심 세포를 단층으로 배양합니다. 세포가 70-80% 밀도에 도달하면 세척당 4ml의 PBS로 배양액을 두 번 세척한 후 접시당 1ml의 0.25%트립신-EDTA로 세포를 분리합니다. 2분 후 광학 현미경으로 해리를 확인합니다.

세포가 분리된 경우 5ml의 성장 배지로 효소 반응을 중화합니다. 세포 배양당 15ml 원추형 튜브 1개에서 원심분리를 통해 세포를 수집하고 튜브당 3ml의 성장 배지로 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 그런 다음 trypan blue exclusion을 통해 생존 가능한 세포의 수를 계산합니다.

계산 후에, 신선한 매체에 있는 밀리리터 농도당 5번째 세포에 10에 1개에서 2개의 곱셈으로 세포를 묽게 하고 마지막 0.6% 농도에 세포에 메틸셀룰로오스를 추가하십시오. 세포를 멸균 저장소로 옮기고 멀티채널 피펫을 사용하여 200마이크로리터의 세포를 초저 부착 96웰 원형 바닥 마이크로플레이트의 각 웰에 분주합니다. 그런 다음 광학 현미경으로 스페로이드 형성을 확인하기 전에 24-36시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다.

LCFS 처리를 위해 제조된 해동된 LCFS 원액을 신선 성장 배지에서 25, 12.5 및 6% 농도로 연속적으로 희석하고 200마이크로리터 피펫을 사용하여 도금된 대장암 세포주 배양의 각 웰에서 가능한 한 많은 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 LCFS 보충 성장 배지를 각 암세포 세트에 3회씩 부드럽게 첨가하고 추가로 24-48시간 동안 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 메틸셀룰로오스 농도 0.6%는 테스트된 암 세포주 세포를 소형 스페로이드로 변환하며, 이는 이 프로토콜을 사용하여 여러 유형의 결장직장암에서 스페로이드를 생성할 수 있음을 나타냅니다.

25%LCFS로 배양된 스페로이드는 용량 의존적 방식으로 표면이 파쇄되고 세포 생존율이 감소합니다. 실제로, LCFS 공동 배양 세포는 생존 가능한 대조 세포에 비해 더 높은 수준의 프로피듐 요오드화물 발현을 보여줍니다. 역전사효소 PCR 분석, 웨스턴 블로팅 및 유세포 분석 Annexin V/7-AAD 분석을 수행하여 암세포 사멸에 대한 LCFS의 효과를 평가할 수도 있습니다.

성장 배지를 제거할 때는 스페로이드가 쉽게 파괴되어 LCFS 처리의 효과를 관찰할 수 없으므로 스페로이드를 부드럽게 다루십시오. 이 절차에 따라 세포 생존율 분석, 정량적 real-time PCR, 웨스턴 블로팅 및 FACS 분석을 수행하여 LCFS의 항암 효과를 보다 자세히 특성화할 수 있습니다.