Name: 열토가 마리티마 M42 아미노펩티다제 TmPep1050의 올리고메릭 상태 전환을 연구하는 엑스레이 결정학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: 배우세요 TmPep1050 M42 아미노펩티다제의 이머-도데카머 올리고메릭 상태 전환을 엑스레이 결정학으로 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 단백질 정화부터 데이터 처리까지 구조 생물학 연구에 활용됩니다.

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우리는이 논문을 교정하고 건설적인 의견을 주는 마틴 로버에게 감사드립니다. Proxima 2 빔라인(SOLEIL 싱크로트론)에 대한 액세스는 블록 할당 그룹 20151139 내에 있었습니다.

저자는 공개 할 것이 없습니다.

본 명세서에 기재된 프로토콜은 구조 수준에서 TmPep1050의 디머-도데카메르 전환을 이해할 수 있게 한다. 방법론은 TmPep1050 올리고머11의구조를 결정하기 위해 이전에 경험되었다. 가장 어려운 단계는 안정적인 디머로 도데카운더의 해리를 촉진하는 조건을 찾는 것이었습니다. 이러한 조건은 금속 이온 공동 인자가 추가 될 때 디머가 dodecamers로 재결합 할 수있을만큼 온화했다. 올리고머의 분리는 또한 구조 적인 연구 와 추가 생화학 적 특성화를 조건으로 하는 중요한 단계였다 (예를 들어,Co2+의다양한 용량에서 dodecamer 재결합을 연구). 분자 대체, 단계 측정을 위한 입증된 방법, TmPep1050 올리고머와 그 변이체의 구조를 해결하기 위하여 이용되었습니다. 제안된 프로토콜은 올리고머화 상태가 그들의 금속 공동 요소의 가용성에 의존하는 그밖 금속로 효소를 공부하기 위하여 적응될 수 있습니다.
프...

올리고머화는 많은 단백질의 생물학적 기능을 지시하는 지배적인 과정입니다. 대장균에서는단백질의 35%만이 단황1인것으로 추정됩니다. 모르피인이라고 불리는 일부 단백질은 각 올리고메릭 상태2에서뚜렷한 구조를 갖는 하위 단위를 가진 여러 올리고메릭 상태를 채택할 수도 있다. 그들의 올리고메릭 상태 사이 전환은 수시로 각 올리고머 국가가 다른 특정 활동 또는 기능을 가질 수 있기 때문에 단백질 활동을 통제하는 평균입니다. 모페에인의 몇 가지 예는 문학, 특히 포르포빌리노겐 신타제3,HPr 키나아제/포스파타제4,론 프로테아제5,락테이트 탈수소효소6,글리세랄데히드-3-인산염 탈수소효소7,피루바테 키나제8,피루바테 키나제 8, 표루바테 키나테 레카제 8, 피루바테 키나테스 8, 카테카테 키나테스10,카테카테 레테이트에이질성 에서 잘 문서화되어 있다. 최근에는 M42 아미노펩티다아제 TmPep1050을 설명했는데, 모피인과 같은 행동을 가진 효소의 또 다른 예는 그의 활동이 올리고메릭상태(11)에의존한다. 그것의 oligomeric 상태 사이 전환은 하위 단위의 몇몇 구조적인 수정을 유도하는 그것의 금속 공동 인자에 의해 중재됩니다.
M42 아미노펩티다아제 가족은 MH 클랜12,13에속하며 박테리아와고고학(14)에널리 분포되어 있다. M42 아미노펩티다스는 펩티드를 분해하는 정품 이핵 효소로, 길이15의아미노산 잔기는 최대 35개까지 이다. 12개의 서브유닛으로 만들어진 독특한 테트라헤드론 모양의 구조를 채택하고, 내부 캐비티를 지향하는 활성 부위를 가지고 있습니다. 이러한 배열은 종종 제어되지 않는 프로테오리시스를 피하기 위해 활성의 나노 구획화로 설명된다. M42 아미노펩티다스의 생리적 기능은 단백질분해(16,17)에서발생하는 프로테솜, 가수분해 펩타이드와 연관될 수 있다. 피로코커스 호리코시이는 4개의 M42 아미노펩티다아제(aminopeptidases)를 보유하고 있으며, 각각 구별되지만 보완적인특이성(18,19,20,21)을제시한다. 단수적으로, 두 가지 유형의 서브유닛으로 만든 이종복합체는 P. horikoshii에설명되어 있으며, 펩티다섬복합체(22,23)의존재를 시사한다.
M42 아미노펩티다제의 여러 구조는 문헌(11,16,18,19,20,24,25, 25,26)에기재되었다. 하위 단위는 두 개의 고유한 도메인, 촉매 도메인 및 이량화 도메인으로 구성됩니다. 촉매 도메인은 전체 MH 일족에 보존 공통 α /β 접을 채택, 고풍스러운 촉매 도메인인 아미노 펩티다아제 AP1 되는 비브리오 프로테오리틱스27. 이 분화 도메인은 PDZ와 같은 접이식16을 채택하고, 올리고머화에서의 역할 외에도, 내부캐비티(11)에서기판 접근 및 바인딩을 제어하는 역할을 가질 수 있다. 기본 빌딩 블록은 이량자이기 때문에, 도드카메르는 종종 6 개의 희미한 사람의 협회로 설명되며, 각 디머는 테트라 헤드론(16)의각 가장자리에 배치된다. M42 아미노펩티다스의 올리고머화는 금속 보조인의 가용성에 의존한다. 종종 Zn2+ 및 Co2+의희석금속 이온은 펩티드 결합 및 가수분해에 촉매적으로 관여합니다. 그들은 두 개의 별개의 바인딩 사이트에서 발견 됩니다., 즉 M1 및 M2 사이트. 두 금속 이온은 또한 PhTET2, PhTET3, PfTET3 및 TmPep105011,24,28,29에대해 입증된 바와 같이 올리고머화를 정밀하게조정한다. 금속 보조 인자가 고갈되면, 도드카메르는 PhTET2, PhTET3 및 TmPep105011,16,28,또는 단량제와 같이 디머로 분해됩니다.
여기에 TmPep1050 올리고머의 구조를 연구하는 데 사용되는 프로토콜이 여기에 제시된다. 이 프로토콜은 단백질 정제, 단백질 활성 스크리닝, 결정화, X선 회절 및 분자 대체를 포함하는 일반적인 방법의 집합입니다. 메탈로엔자임, 단백질 올리고머화, 단백질 결정화 및 분자 대체를 다루는 데 내재된 미묘함을 강조합니다. 연구의 경우 는 또한 TmPep1050 dodecamers 단량체로 더 해리 수 있는지 여부를 보여주기 위해 제시된다. 이 문제를 해결하기 위해 TmPep1050 변종 TmPep1050H60A H307A는그의-60 (M2 사이트) 및 His-307 (M1 사이트)을 Ala 잔류물으로 돌연변이하여 금속 결합 부위가 손상된 금속 결합 부위를 연구했습니다. 이 프로토콜은 다른 M42 아미노펩티다제 또는 모르피인과 같은 행동을 가진 금속로효소를 연구하기 위해 수용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>1,10-페난트롤린</td><td>시그마-알드리치</td><td>13, 137-7</td><td></td></tr><tr><td>아미콘 울트라 0.5 ml 원심 필터 울트라 30K</td><td>머크 밀리포어</td><td>UFC503096</td><td></td></tr><tr><td>아미콘 울트라 15 원심 필터 울트라 30K</td><td>머크 밀리포어</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>벤조나아제 뉴클레아제 머</td><td>크 밀리포어</td><td>70664-3</td><td></td></tr><tr><td>CCP4</td><td>해당 없음</td><td></td><td>방문 http://www.ccp4.ac.uk/</td></tr> <tr><td>cOmplete EDTA 무함유</td><td>Roche</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Coot N/A</td><td></td><td>방문 https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td></tr> <tr><td>Crystal Screen I</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen II</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-112</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1082</td><td></td></tr><tr><td>EasyXtal 15-well tool</td><td>NeXtal</td><td>132007</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli PPY strain</td><td>N/A</td><td></td><td>참조 참조 31</td></tr><tr><td>Escherichia coli XL1 blue strain</td><td>Agilent</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>Filtration Calibration Kit HMW</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-4038-42</td><td></td></tr><tr><td>Gel Filtration Calibration Kit LMW</td><td>GE 헬스케어 생명 과학</td><td>28-4038-41</td><td></td></tr><tr><td>겔 여과 표준</td><td>Biorad</td><td>1511901</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET 플라스미드 Miniprep Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Index</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td></td></tr><tr><td>Litholoops</td><td>분자 치수</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-leucine-p-nitroanilide</td><td>Bachem AG</td><td></td><td></td>40010720025</tr><tr><td>Natrix 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-116</td><td></td></tr><tr><td>Natrix 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-117</td><td></td></tr><tr><td>Neggia 플러그인</td><td>Dectris</td><td>N/A</td><td>방문 https://www.dectris.com/</td></tr> <tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite I</td><td>NeXtal</td><td>130724</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite II</td><td>NeXtal</td><td>130725</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite III</td><td>NeXtal</td><td>130726</td><td></td></tr><tr><td>NeXtal Tubes JCSG Core Suite IV</td><td>NeXtal</td><td>130727</td><td></td></tr><tr><td>pBAD-TOPO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K430001</td><td></td></tr><tr><td>Phoenix</td><td>N/A</td><td></td><td>방문 https://www.phenix-online.org/</td></tr> <tr><td>Phusion High-Fidelity DNA polymerase</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-530L</td><td></td></tr><tr><td>Salt RX 1</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td></td></tr><tr><td>Salt RX 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Dialysis Tubing, 3.5K MWCO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88242</td><td></td></tr><tr><td>출처 15Phe</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17014702</td><td></td></tr><tr><td>출처 15Q</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17094705</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Prep Grade</td><td>GE 헬스케어 생명과학</td><td>17104301</td><td></td></tr><tr><td>Thermotoga maritima MSB8 균주</td><td>미국형 배양 컬렉션</td><td>ATCC 43589</td><td></td></tr><tr><td>TmCD00089984</td><td>DNASU 플라스미드 저장소</td><td>해당 사항 xDS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>해당 사항 없음</td><td></td><td>http://xds.mpimf-heidelberg.mpg.de/</td></tr> <tr><td>xdsme</td><td>해당</td><td></td><td></td></tr></tbody> 사항 없음 방문 https://github.com/legrandp/xdsme</table>

열토가 마리티마 m42 아미노펩티다제 tmpep1050의 올리고메릭 상태 전환을 연구하는 엑스레이 결정학

X-Ray Crystallography to Study the Oligomeric State Transition of the Thermotoga maritima M42 Aminopeptidase TmPep1050

M42 아미노펩티다스는 12개의 서브유닛으로 이루어진 기능활성 복합체를 형성한다. 그들의 조립 과정은 이머 도데카메르 전환을 유발하는 금속 이온 공동 인자에 의해 규제되는 것으로 보입니다. 금속 이온 바인딩시 활성 부위및 상호 작용 인터페이스에서 여러 가지 구조적 수정이 발생하여 자체 조립을 촉진하기 위해 희미한 모양을 형성합니다. 이러한 수정을 관찰하려면 구조 연구 전에 안정적인 올리고머를 분리해야 합니다. 여기에 보고된 TmPep1050의 안정적인 도데카머와 디머, T. 마리티마의M42 아미노펩티다아제, X선 결정학에 의한 구조 결정의 정화를 허용하는 방법이다. 디머는 킬링 에이전트로 금속 이온을 제거하여 도데카머로부터 제조되었습니다. 그들의 보조 인자가 없으면, dodecamers는 덜 안정되고 가열시 완전히 해리되었다. oligomeric 구조는 간단한 분자 대체 접근에 의해 해결되었습니다. 방법론을 설명하기 위해 금속 이온 결합에 완전히 손상된 TmPep1050 변종의 구조는 단량체에 대한 희미한 기조의 더 이상 분해를 보여주지 않는 것으로 제시된다.

TmPep1050에서 단량체로 가능한 dodecamer 해리를 연구하기 위해, His-60 및 His-307 코돈은 합성 유전자를 사용하여 알라닌 코돈으로 대체되었다. 이 유전자는 TmPep1050 이체의 발현 및 정제를 위한 pBAD 벡터로 복제된 후 TmPep1050H60A H307A라는이름의 이체이다. 크기 배제 크로마토그래피(도3B)는정제된 단백질이 56kDa(단량체의 분자량36.0 kDa)의 명백한 분자량을 가졌다는 것을 보여주었다. 비슷한 명백한 분자량, 52 kDa, TmPep1050 디머11에대 한 보고 되었습니다. 따라서 TmPep1050H60A H307A의 올리고메릭 상태는 희미하게 유추될 수 있습니다. 그것의 특정 활동에 관하여, TmPep1050H60A H307A는 코발트이온의 존재에도, 기판으로 L-Leu-p NA에 완전히 비활성이었습니...

이 프로토콜은 구조 수준에서 M42 아미노펩티다아제인 TmPep1050의 디머-도데카메르 전환을 연구하기 위해 개발되었다. 단백질 정제에서 X선 데이터 처리에 이르기까지 간단한 파이프라인입니다. 결정발생, 데이터 세트 인덱싱 및 분자 교체는 연구의 경우, TmPep1050H60A H307A 변이체를 통해 강조되었다.

열토가 마리티마 M42 아미노펩티다제 TmPep1050의 올리고메릭 상태 전환을 연구하는 엑스레이 결정학

The M42 aminopeptidases form functionally active complexes made of 12 subunits. Their assembly process appears to be regulated by their metal ion ...

이 프로토콜은 비활성 디머와 활성 도데카메르 사이의 균형을 이루는 다른 올리고머화 의존적 활동과 아미노펩티다제의 연구를 용이하게 한다. 이 기존의 기술은 모든 실험실에서 쉽게 수행 할 수 있습니다. 빔라인 또는 엑스레이 결정화 시설에 대한 접근이 필요한 것 외에도 특수 장치가 필요하지 않습니다.일부 적응을 통해, 이 방법은 올리고머화의 정도에 의존하는 활동 또는 기능을 가진 다른 단백질에 적용될 수 있다. 엑스레이 데이터를 처리하려면 사용자는 결정예 학적에 대한 최소한의 이해가 있어야합니다. 우리는 교육을 따르고 XDS 위키를 방문하고 Phenix 자습서를 시청하도록 사용자를 초대합니다.활동 분석기를 수행하려면 100mM L-류신 p-니트로아닐드 25마이크로리터를 50밀리알러 MOPS965마이크로리터, 250 마이크로몰라 코발트 2염화 2개, 메탄올 Pre를 75도 의 건조 목욕으로 배양한 후, 효소를 1mmmops로 희석하기 전에 50밀리아플루에틸라를 첨가한다. 다음으로, 반응 혼합물에 10개의 마이크로리터를 추가하고 1시간 이상 섭씨 75도 건조 목욕에 반응을 되돌리기 전에 생성된 용액을 소용돌이시다. 용액이 노랗게 변하면 20%의 산산으로 반응을 멈추고 혼합물을 소용돌이로 처리한 후 실온으로 냉각하십시오.그런 다음 반응 믹스의 알리쿼트를 분광광계 세포로 옮기고 410 나노미터에서 흡수체를 효소 없이 배양된 반응 믹스에 대하여 부정적인 대조군으로 읽습니다. 아포엔자임 제제를 위해, 50 밀리머 걸레 MOPS 의 890 마이크로리터, 0.5 어어 암모늄 황산염 및 정제 된 TmPep1050의 100 마이크로 리터에 1, 10 페난트로인 스톡 솔루션10 마이크로 리터를 추가합니다. 코발트 2염화물을 첨가하지 않고 입증된 바와 같이 활성 분석체를 사용하여 활동 손실을 확인한다.분석 후, 투석 튜브로 샘플을 전송하고 섭씨 4도에서 50 밀리리터 의 200 밀리리터와 0.5 해저 황산염에 대해 샘플을 투석한다. 투석48시간 투석을 3회 신선한 버퍼로 교환하고 투석관에서 샘플을 채취한다. 30킬로톤 컷오프가 있는 울트라 여과 장치를 사용하여 샘플을 다시 100 마이크로리터로 농축하고 280나노미터의 나노 체피 분광계에 대한 농도를 확인합니다.디머를 준비하려면 아포엔자를 50 밀리머 MOPS와 0.5 의 어금니 암모늄 황산염으로 1마이크로몰라 농도로 희석시키고, 75°C의 건조 목욕에서 2시간 동안 반응을 배양한다. 그

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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