Name: 시간 경과 현미경 검사를 사용하여 대장균에서 생물학적 소음의 지속적인 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: 배우세요 대장균에서 시간 경과 현미경 검사를 이용한 합성 유전자 회로의 생물학적 소음 지속 측정 방법입니다. 이 기법은 신호 변동성과 신호 대 잡음비를 계산하여 회로 성능을 평가하며, 다양한 균주와 실험실에 쉽게 적용할 수 있는 비용 효율적인 도구입니다.

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우리는 MATLAB 코드를 지원길 겔버트 (전기 공학 학부, 테크니온)에 감사드립니다. 이 기사를 증명하는 데 도움을 주신 시밍 리 박사(생명의학 공학부, 테크니온 교수)에게 감사드립니다. 이 연구는 부분적으로 노이바우어 가족 재단과 과학의 이스라엘 부에 의해 지원되었다, 보조금 2027345.

1. 미디어 및 문화 준비
<ol><li>1,000x 카베니실린(50 mg/mL) 또는 관련 항생제의 재고 용액을 준비합니다.<ol>
<li>. 스카베니실린 의 무게 0.5 g. 멸균 H2O. 완전히 용해 10 mL를 추가합니다.</li>
		<li>0.22 μm 주사기 필터를 통해 카베니실린 재고를 살균합니다. 항생제 용액을 알리쿼트하고 -20 °C에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>리소제니 국물(LB) 플레이트를 준비하려면 트립톤 5g, NaCl 5g, 효모 추출물 2.5g, 바토 아가르 7.5g을 멸균 H2O. Autoclave용 121°C에서 20분 동안 121°C로 섞는다.<ol>
<li>50°C 수조에 용융 젤 믹스를 부분적으로 담급니다. 카베니실린 1,000 μL(50 mg/mL)을 추가합니다.</li>
		<li>멸균 환경에서 페트리 요리를 준비합니다. 냉장고에 보관하기 전에 접시를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>M9 최소 매체의 경우 5x M9 염(56.4g/L), 2M 포도당 및 2% 비오틴 프리 카산산과 같은 별도의 스톡 솔루션을 준비하십시오. 20 분 동안 121 °C에서 솔루션을 오토 클레이브합니다.</li>
	<li>5 페트리 플레이트를 준비하려면 1125 mg의 저용 한천과 400 mg의 한고를 89.2 mL의 최소 미디어 (1x M9)로 섞습니다. 250mL 에렌마이어 플라스크에 2% 카산산(2% [vol/vol])의 10mL를 추가합니다. 참고: 플라스크의 안쪽 입술에 미디어를 부어야 합니다.</li>
	<li>3~4초의 짧은 버스트에서 솔루션을 전자레인지에 연결합니다. 솔루션이 명확해질 때까지 반복합니다. 참고: 비등점에 도달하지 않도록 하십시오.</li>
	<li>250mL 에를렌마이어 플라스크를 온수 욕조(60°C)에 놓고 확산에 의해 더 섞어 온도가 약 45-50°C까지 떨어질 때까지 식힙니다.</li>
	<li>접시가 쏟아지는 벤치에서 불꽃을 밝아보며 불을 붙인다.</li>
	<li>다음 순서로 모든 솔루션을 신속하게 추가합니다. 글리세롤 800 μL (0.4% [vol/vol]) 티아민 100 μL (B1) 포도당 1100 μL (2M) 카베니실린 100 μL (50 mg/mL).</li>
	<li>에를렌마이어 플라스크를 소용돌이치며 모든 재료가 한천 전체에 분포되도록 합니다.</li>
	<li>화염 옆에 한 번에 한 접시를 열고 붓기 시작합니다.<ol>
<li>초기 응고될 때까지 몇 분 동안 접시를 벤치에 둡니다.</li>
		<li>물 응축이 젤에 떨어지는 것을 방지하기 위해 접시를 거꾸로 설정합니다.</li>
		<li>플레이트를 실온에서 약 2시간 동안 고화시도록 둡니다.</li>
		<li>플레이트가 고화되고 건조되면 약 3 개월 동안 4 °C에서 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세균 균주와 플라스미드 건설
참고: 유전 회로는 한 부분을 포함; PtetO 프로모터에 의해 구동되는 녹색 형광 단백질(GFP)은 구성식 발현을 초래합니다. 이 작업의 모든 플라스미드는 기본 분자 복제 기술을 사용하여 시공되었고 표준 열 충격프로토콜(24)을사용하여 대장균 10β로 변형되었다. 최종 구조는 시험을 위한 대장균 MG1655 야생형 변형으로 변형되었다.
<ol><li>표준 열 충격프로토콜(24)으로원하는 플라스미드를 대장균 MG1655 세포로 변환한다.</li>
	<li>37°C에서 하룻밤 사이에 LB 한천 플레이트에서 변형된 세포를 성장시키면 됩니다. 참고: 페트리 요리를 현미경 사용시 최대 2.2일에서 3일까지 유지할 수 있습니다.</li>
	<li>유리 튜브에 관련 항생제로 보충 된 LB 국물의 5 mL로 단일 식민지를 접종.</li>
	<li>액체가 흐릴 때까지 2 시간 동안 인큐베이터에서 250 rpm 흔들림 속도로 37 °C에서 세포를 성장시킵니다.</li>
	<li>다음과 같이 희석 솔루션 1mL을 준비하십시오. 최소 용지 892 μL (1x M9) 글리세롤 8μL (0.4% [vol/vol]) 100 μL 2% 카산산 (0.2% [wt/vol]) 티아민 1μL (B1) 포도당 11 μL (2M) 관련 항생제의 1 μL<ol>
<li>혼합하고 아래로 회전.</li>
	</ol>
</li>
	<li>에셀리치아 대장균의 30 μL을 희석용액의 1000 μL로 추가하여 2.4단계에서 세포 배양(1:30)을 희석한다(단계 2.5).</li>
	<li>37°C에서 흔들림(250rpm)으로 튜브를 1시간 동안 배양한다.</li>
	<li>1.10 단계에서 준비된 M9 플레이트에 40 μL - 60 μL을 성장시다. 하룻밤 사이에 37 °C에서 플레이트를 배양하십시오. 참고: 도금용 광학 밀도(OD600nm)는약 0.1이어야 합니다.</li>
	<li>벤치에 최대 35mm 유리 바닥 플레이트를 놓습니다. 참고: 플레이트의 유리에 사용되는 현미경 렌즈에 대한 정확한 두께가 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>젤 플레이트에 파종에 대한 배양을 준비하고, 2.9 단계 현미경 측정에서 제조 된 플레이트에서 콜로니에 대한 2.3 에서 2.6 단계를 반복합니다.</li>
	<li>다음 솔루션을 준비하여 세 개의 현미경 플레이트를 만듭니다.<ol>
<li>수조를 60°C로 예열합니다.</li>
		<li>112.5 mg의 저용 한천과 40 mg의 한고를 최소 미디어(1x M9)로 혼합하고 25mL 에렌마이어 플라스크에 2% 카산산(0.2% [vol/vol])의 1mL를 추가합니다. 참고: 플라스크의 안쪽 입술에 미디어를 부어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2~3초의 짧은 버스트에서 솔루션을 전자레인지에 연결합니다. 솔루션이 명확해질 때까지 반복합니다. 참고: 비등점에 도달하지 않도록 하십시오.</li>
	<li>25mL 에렌마이어 플라스크를 온수 욕조(60°C)에 놓고 확산에 의한 혼합을 더 하고, 온도가 약 45-50°C까지 떨어질 때까지 벤치에 식힙니다.</li>
</ol>3. 아가로즈 패드 준비
<ol><li>70%의 에탄올로 깨끗한 벤치. 청소 된 벤치에 스트레치 테이프. 테이프가 매끄럽고 수평이 있는지 확인합니다.</li>
	<li>테이프에 하나, 두 번째 커버립을 준비합니다. 커버리드를 준비합니다.</li>
	<li>물 목욕에서 플라스크 (2.14 단계에서 준비)를 제거하고 플라스크의 외부를 깨끗하게 닦고 온도가 약 45-50 °C로 떨어질 때까지 식힙니다.</li>
	<li>젤 용액을 만들려면 다음 순서로 모든 솔루션을 빠르게 혼합하십시오. 글리세롤 80μL (0.4% [vol/vol]) 2% 카산산 1mL (0.2% [wt/vol]) 티아민 10 μL (B1) 포도당 110 μL (2M) 관련 항생제의 10 μL.</li>
	<li>커버슬립에 젤 1.5mL를 붓고 두 번째 조각으로 덮어 "샌드위치"를 만듭니다.</li>
	<li>에를렌마이어를 온수 욕조로 되돌려 보시면 됩니다. 뚜껑으로 샌드위치를 덮고 타이머를 20분 동안 설정합니다.</li>
	<li>동시에, 튜브를 흔들림으로 37°C에서 1h로 2.11단계로부터 배양(250rpm)</li>
	<li>20 분 후 샌드위치 (단계 3.5)를 뒤집고 덮고 1 시간 동안 그대로 둡니다. 참고: 더 나은 결과를 위해 "샌드위치"는 단계 3.8의 기간 동안 4 °C에서 휴식을 둡니다.</li>
	<li>35mm 접시에 샘플을 배관하여 3.7 단계에서 종자 대장균 배양. 참고: 별도의 작은 방울로 셀의 6 μL을 파이프팅하면 최상의 결과를 제공합니다.</li>
	<li>방울이 건조되도록 허용하여 최소 15분, 최대 30분 간 건조시다.</li>
	<li>커버슬립을 멀리 밀어 3.8 단계에서 샌드위치의 고화 된 젤을 노출.</li>
	<li>생검 펀치 또는 팁으로 작은 개별 패드로 샌드위치를 잘라.</li>
	<li>샘플(3.9단계)에 부드럽게 기대어 두십시오. 벤치에 20 분 동안 접시를 둡니다.</li>
</ol>4. 현미경 이미징샘플 준비
<ol><li>3.6 단계에서 수조에서 플라스크를 제거합니다. 플라스크의 바깥쪽을 깨끗하게 닦고 실온(25°C)으로 식힙니다. 참고: 타이머가 끝나기 약 3분 전에 4.1 단계에서 플라스크를 제거합니다.</li>
	<li>젤의 3mL를 원형 운동으로 플레이트 둘레에 지속적으로 붓습니다. 몇 분 동안 굳어 둡니다.</li>
	<li>테이프로 플레이트를 밀봉하고 25G 바늘로 여러 구멍을 관통하십시오. 모든 접시를 뒤집어 서 물 응축이 젤에 떨어지는 것을 방지합니다.</li>
	<li>모든 접시를 4°C에서 30분 동안 배양하여 세포 미토시스를 방지하면서 완전한 고형화를 허용합니다. 참고: 샘플을 4°C로 남겨 서 연속측정을 위해 하루이상 방치하십시오.</li>
	<li>제조업체 지침당 현미경을 시작합니다.</li>
	<li>가장 낮은 증폭 렌즈를 사용하여 초기 포커스를 찾고 자동 초점 시스템(AFS)을 참여시다.</li>
	<li>필요한 경우 오일을 사용하고, 렌즈를 오일로 익사시키고 플랫폼 컨트롤러(수동으로 는 아님)로 플레이트를 이동하여 조심스럽게 확산시키고 AFS는 다시 참여할 수 있습니다.</li>
	<li>Z 단계 단면에 대한 기본 제안에 따라 Z 방향으로 상대 단면을 사용합니다. 참고: 5분마다 밝은 필드 이미지와 20분마다 형광 이미지를 찍었습니다. 때로는 처음 30 분 동안 초점을 조정해야합니다. 현미경 인큐베이터 상자와 오일을 예열하면서 샘플을 냉장보관하면서 초기 초점 손실을 줄이는 경향이 있습니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
참고: 현미경 데이터를 처리하기 위해 MATLAB에서 컴퓨터 기반 소프트웨어를 설계했습니다. 이 소프트웨어는 밝은 필드 티프 이미지와 세그먼트에서 셀 경계를 식별하고 영역별로 셀을 정렬합니다. 이 영상 분석의 출력은 현미경 해상도 한계로 인해 세포 후광과 같은 형광 영역에서 세포 강도 수준을 도출하고 유물을 취소하기 위해 형광 티프 이미지에 대한 마스크로 사용될 수 있다. 개발된 이 소프트웨어는7,25,26,27,28,29,30과 유사한 작품에서 영감을 받았으며 실험실에 맞는 우아한 솔루션을 제공합니다.
<ol><li>먼저 main_code.m다음 매개 변수를 정의합니다.<ol>
<li>획득 이미지의 폴더를 정의합니다.</li>
		<li>이미지 기간 - 몇 분 만에 밝은 필드 채널 시간 단계를 정의합니다.</li>
		<li>GFP 주파수 - GFP 이미지의 수집 속도를 정의합니다.</li>
		<li>현미경 해상도(즉, 픽셀 수가 1 μm와 같음)를 정의합니다.</li>
		<li>히스토그램 빈 범위 - 셀 영역 범위를 정의합니다. 참고: 세포 영역에 따라 데이터를 분류하는 프로세스는 유동 세포 측정 데이터 분석에서 게이팅의 원리와 유사합니다. 게이트는 공통의 특성을 가진 세포의 인구 주위에 배치됩니다, 일반적으로 앞으로 흩어져 측면 흩어져, 분리하고 관심의 이 인구를 정량화하기 위해. 현미경 검사는 여러 세포 그룹을 게이트, 조사 및 정량화 할 수 있습니다.</li>
		<li>컨볼루션 커널(3,3) 정의 -이 매개 변수는 전역임계값(count_cells.m)에의해 셀 경계를 감지합니다. 참고: 이 설정은 실험실 또는 현미경을 변경할 때만 필요합니다. 소프트웨어는 입력 밝은 필드 채널이 인덱스 c1, 형광 채널로 c2로 레이블을 지정해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다른 모든 스크립트를 자동으로 실행하는 main_code.m실행합니다(count_cells.m,cell_growth_rate.m).<ol>
<li>프로그램은 자동으로 밝은 필드 이미지를 세그먼트(보충 그림 2-4참조).</li>
		<li>분할 영상을 형광 영상(GFP)과 결합하여 셀당 강도 수준을 추출합니다.</li>
		<li>시간별 셀의 양 그래프를 계산하고 기하급수적 성장에 따라 적합합니다.</li>
		<li>각 셀 영역 범위에 대한 평균 및 표준 편차(STD)를 계산합니다.</li>
		<li>각 셀 영역 범위에 대한 신호 대 노이즈 비율(SNR)을 계산합니다.</li>
		<li>강도에 의해 셀의 양을 플롯하고 맞춥시다.</li>
		<li>분산(CV)의 계수를 계산하고 흐름 분석기 데이터와 비교합니다. 참고: 소프트웨어는 새로운 폴더 "폴더/분할"에서 conv_kernel 조정하기 위한 최종 세분화 이미지를 출력으로 제공합니다. 소프트웨어는 새로운 폴더 "당신의 폴더 / 그래프의 출력으로 표시됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험 을 비교하려면 compare_experiments.m사용하십시오.<ol>
<li>저장된 그래프에 대한 디렉토리와 \Compare결과 디렉터리에 대한 주소를 정의합니다.</li>
		<li>파일을 실행합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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이 작업에서, 우리는 시간의 기간 동안 분할 및 형광 수준에 따라, 대장균 라이브 세포의 컴퓨터 추적을 가능하게하는 프로토콜을 개발했다. 이 프로토콜을 통해 우리는 CV와 SNR을 실시간으로 측정하여 대장균의 유전 회로의 궤적 역학을 정량화할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 도 10에표시된 두 개의 서로 다른 회로의 스토세스 동작을 비교했습니다. 그것은 낮은 복사 번호를 가진 플라스미드는 금세 효과 경향이 있고 세포 분열에 의해 더 적은 영향을 받는 것으로 나타났습니다. 제1 회로는 GFP(도10a)를구성하고, 제2 회로는 ssrA 분해태그(도 10b)에융합된 sfGFP를 구성적으로 표현하였다. 형광 단백질의 황변 적 행동을 정량화하기 위해 밝은 필드 이미지도 기록했습니다. 결과는 GFP의 발현, 특히성숙39에서지배적인 소음원임을 보여준다. <stro...

합성 생물학은 지난 10년 동안 등장한 다분야 분야로, 기초과학4,5,진단, 치료 및 생명공학적 응용 분야6,7,8,9,10을이해하기 위해 살아있는 세포에서 다중 신호 통합 및 처리를 달성하기 위한 노력의 일환으로 엔지니어링 설계 원리를 합리적 생물학적 설계1,2,3으로변환하는 것을 목표로 하고 있다. 합성 유전자 회로의 입력 출력 반응을 정량화하는 당사의 능력은 자동화된 시간 경과 현미경검사법(11)을이용한 유량 분석기 및 라이브 세포 이미징을 포함한 단일 세포 기술의 최근 발전에 의해 혁명을 일으켰습니다. 유량 분석기는 종종 정상 상태1,12에서이러한 회로의 반응을 측정하는 데 사용되며, 반전된 현미경 검사는 단일 세포3의수준에서 합성 유전자 회로의 동적 반응을 측정하는 데 사용된다. 예를 들어, 합성 생물학의 초기 작업 중 하나는 지연3와부정적인 피드백 루프를 사용하여 살아있는 세포에서 유전 발진기 네트워크의 건설을 포함했다. 나중에, 유전 발진기 회로는 살아있는 세포의 동적 환경에서 대사 조절을 이해하기 위해 적용되었다4. 자동 시간 경과 현미경 검사는 이러한 회로를 특성화하는 하나의 방법입니다. 우리는 숙주 세포, 대장균이미세 식민지를 형성 할 때 동기화되어 정확한 어머니 - 딸 관계를 추적하지 않고 신호 및 소음 계산을 허용한다고 가설합니다.
소음은 종종 여러 소스에서 발생하는 생물학적 시스템의 근본적이고 내재된 측면입니다. 예를 들어,단백질(13)의확산과 같은 임의의 임의 운반선의 수송에서 비롯된 신호를 포함하는 생화학반응을 고려한다. 이러한 신호는 임의변동(14)으로전파됩니다. 다른 소음원은 온도, 습도 및 압력과 같은 환경 조건의 자원 가용성, 세포 분열 및 변화입니다. 합성 유전자 회로에서 전파되는 생물학적 신호는 종종 이러한 회로의 성능을 방해하는 매우 낮은 신호 대 잡음 비(SNR)를 가지고 있습니다. 따라서 유전 회로 설계는 유전 공학15의가장 어려운 측면 중 하나입니다. 예를 들어, 평균 유전자 발현(전체 세포 집단에 걸쳐 측정됨)만 계산하는 대부분의 접근법과는 달리, 측정된 신호의 분산은 합성 유전자네트워크(12)를통해 예측 가능한 동작을 설계하기 위해 고려된다. 이와 같이, 단백질 발현에서의 가변성 또는 노이즈의 수준은 아날로그 및 디지털 유전자 회로1,16,17의설계 및 성능에 지배적인 역할을 한다.
 에체리치아 대장균3,7,18을포함한 세포 간 가변성을 정량화하기 위한 많은 접근법이 개발되었다. 이러한 방법은 종종 유전자 활성화 및 대사 경로를 연구하는 데 사용되지만, 특히 이것이 근본적인 도전인 살아있는 세포에서 유전 회로를 측정하고 분열시키는 것과 같은 스토샤스 잡음 역학연구에 덜 초점을 맞추고 있다19,20,21. 회로 자체에 상속된 몇몇 요인(본질적인) 및 숙주 세포(외수성)에서 파생된 몇몇 요인은 유전 회로의 지속적인 성능을 방해할 수 있습니다. 본 논문에서는 내재및 외장소음원을 포함한 대장균 세포의 총 소음을 정량화하는 것을 목표로 하는 프로토콜을개발하였다 6,22. 총 노이즈를 정량화한 다음 SNR23을평가함으로써 유전자 회로의 설계를 개선할 수 있다. 이 방법은 여러 형광 단백질6,20을모니터링하여 독립적인 소음원을 별도로 측정하도록 수정할 수 있다. 여기에 설명된 프로토콜의 경우, 외부 요인의 영향 없이 환경 조건을 잘 제어하고 지속적으로 세포의 활성을 측정합니다. 우리는 시간이 지남에 따라 단일 세포에서 형광 단백질에서 신호를 측정하고 동시에 아가로즈 기판 에서 그들을 이미지. 결과 이미지는 실험실의 사용자 지정 MATLAB을 사용하여 분석됩니다.
이상적으로, 세포 내부의 형광 단백질의 실시간 활성을 지속적으로 측정하면 세포의 성장과 분열을 통해 정확한 데이터를 생성할 것이다. 그러나 이러한 데이터를 획득하는 것은 어렵습니다. 이것은 광 표백7로알려진 형광 단백질의 저하로 인해 흥분 과정에서 방사선에 노출됩니다. 더욱이, 대장균 세포는 또한 광독성7로이어질 수 있는 여기에 민감하다. 두 문제 모두 획득할 수 있는 사진 프레임의 양과 인수 사이의 시간을 제한합니다. 이미징 중에 세포를 성장시키는 데 사용되는 기판 및 중간 유형 (예를 들어, 리소제니 국물)은 또한 중요한 역할을 합니다. 비형광 배경을 최소화하고 세포 분할 시간을 연장하는 최소한의 매체를 사용하는 것이 좋습니다.
더욱이, 샘플은 다음과 같은 요구 사항(1) 낮은 세포 분열율을 고려하여 세분화 주기를 밀접하게 이미징하고 광독성 및 광표백 의 가능성을 감소시키기 위해 덜 빈번한 노출을 허용한다. 우리는 실험의 시작 부분에서 예측 된 미토시스 시간 (2)의 약 절반으로 획득 시간을 설정하여 분열의 균일성과 추적성을 향상시합니다. 세포 밀도는 이 프로토콜의 성공을 위한 중요한 매개변수이며 모든 실험실에 대해 결정되어야 하는 대장균 세포의 희석 비율에 의해 영향을 받습니다. 비율을 확립하기 위해, 사용되는 각 새로운 대장균 균주 또는 매체에는 성장률그래프(보충 도 1)가장착되어야 한다. 약600nm = 0.1의 초기 밀도로부터 짧은 배양 후 세포가 추가 흔들림 없이 성장할 수 있다면 적절한 비율이 달성되었습니다. 이 단계에서세포는 환경 온도에 따라 분할됩니다 (3) 세포 운동의 제한: 세포 운동은 기판에 크게 의존 (아가로즈 패드) 탄력. 기판 의 견고함은 총 아가로즈의 양과 겔 응고 시간에 따라 달라집니다. 에체리치아 대장균은 미토시스를 앓기 때문에 젤은 실온에서 하룻밤 동안 고화하도록 방치할 수 없습니다. 기판 안정성에 영향을 미치는 다른 요인은 시료 및 습도의 물의 양을 포함한다. 추가 문제는 대표 결과에대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 많은 세부 정보를 제공하고 점차적으로 한 단계에서 다른 단계로 이동합니다. 이 프로토콜은 이미징 실험에 대한 긴 안정성을 제공하며 기본 이미지 처리 도구를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>현미경 렌즈에 해당하는</td> <td>35mm 유리 접시</td><td>mattek</td><td>P35G-0.170-14-C</td> 두께.</tr><tr><td>아가로스&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>5004</td><td>LB 준비</td></tr><tr><td>AHL&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3007</td><td>유도제</td></tr><tr><td>Bacto 트립톤&nbsp;</td><td>BD - Becton, Dickinson and Company&nbsp;</td><td>211705</td><td>LB 준비</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Invitrogen</td><td>10177-012</td><td>항생제</td></tr><tr><td>Carb</td><td>Formedium</td><td>CAR0025</td><td>항생제</td></tr><tr><td>Casamino acids&nbsp;</td><td>BD - Becton, Dickinson and Company&nbsp;</td><td>223050</td><td>최소 미디어 솔루션</td></tr><tr><td>eclipse Ti</td><td>nikon</td><td></td><td>반전 현미경</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>최소 미디어 솔루션</td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Bio-Lab</td><td>000712050100</td><td>최소 미디어 기판</td></tr><tr><td>Immersol 518F</td><td>zeiss</td><td>4449600000000</td><td>침수 오일</td></tr><tr><td>M9 소금 용액&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td>최소 미디어 솔루션</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Bio-Lab</td><td>214010</td><td>LB 준비</td></tr><tr><td>Noble 한천</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5431</td><td>최소 미디어 기판</td></tr><tr><td>파라필름 테이프</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>텍스트의 테이프로 참조</td></tr><tr><td>Seaplaque GTG Agarose</td><td>Lonza</td><td>50111</td><td>최소 미디어 기판</td></tr><tr><td>thaymine B1</td><td>시그마-알드리치</td><td>T0376&nbsp;</td><td>미니멀 미디어 솔루션</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD - Becton, Dickinson and Company&nbsp;</td><td>212750</td><td>LB 준비</td></tr></tbody></table>

시간 경과 현미경 검사를 사용하여 대장균에서 생물학적 소음의 지속적인 측정

Continuous Measurement of Biological Noise in Escherichia Coli Using Time-lapse Microscopy

여기에서 개발된 프로토콜은 몇 시간 동안 에샤리치아 대장균 분열 및 형광 농도의 컴퓨터 추적을 가능하게 하는 도구를 제공합니다. 이 과정은 최소한의 미디어에서 살아남은 식민지를 선별하여 시작되며, 정확한 플라스미드를 품고 있는 대장균만이 특정 조건에서 번창할 수 있을 것이라고 가정합니다. 많은 DNA 부품의 조립을 요구하는 대형 유전 회로를 구축하는 과정이 어렵기 때문에 회로 구성 요소는 종종 여러 항생제의 사용을 요구하는 다른 복사 번호로 여러 플라스미드 사이에 분포됩니다. 플라스미드의 돌연변이는 항생제 내성 유전자의 전사를 파괴하고 괴사로 이어지는 세포내 자원 관리와 교차할 수 있다. 선택한 식민지는 유리 바닥 페트리 접시에 설정되며 밝은 필드와 형광 도메인 모두에서 현미경 추적을 위해 몇 가지 초점 평면이 선택됩니다. 이 프로토콜은 규제할 수 없는 초기 조건에서 12시간 이상 이미지 포커스를 유지하여 몇 가지 어려움을 초래합니다. 예를 들어, 죽은 세포는 몇 시간 동안 이미징을 한 후 렌즈의 초점 분야에 축적되기 시작하여 독소가 축적되고 신호가 흐리고 부패합니다. 영양소의 고갈은 새로운 신진 대사 과정을 소개하고 회로의 원하는 반응을 방해합니다. 실험의 온도는 유도제와 항생제의 효과성을 낮춥니다, 이는 신호의 신뢰성을 더욱 손상시킬 수 있습니다. 최소한의 미디어 젤은 수축되고 건조되며, 그 결과 시간이 지남에 따라 광학 초점이 변경됩니다. 우리는 다른 미생물을 위한 유사한 방법을 개발하는 이전 작품과 유사한 대장균에있는 이 도전을 극복하기 위하여 이 방법을 개발했습니다. 또한, 이 방법은 변경되지 않은 변경되지 않은 세포에서 총 금세 노이즈를 정량화하는 알고리즘을 제공하여, 결과가 유사한 변동 계수(CV)에 의해 도시된 바와 같이 유량 분석기 예측과 일치한다는 것을 발견한다.

이 소프트웨어는 흰색과 검은색이 아닌 밝은 필드 도메인 이미지를 분석합니다. 대장균은 오프 화이트 배경에 검은 직사각형 모양처럼 보일 것이며, 휘도의 동적 범위는 중앙(그림 1)에스파이크를 표시해야합니다. 형광 이미지에서 세포는 작은 후광을 가질 수 있지만 직사각형 모양을 가진 개별 세포는 여전히 해결 될 수 있습니다. 미토시스 이벤트는 30분 후에 먼저 검출되어야 합니다. 현미경 초점 시간이 지남에 따라 안정적으로 유지되어야하며 세포가 30 분 동안 천천히 움직일 수 있지만 시야를 떠날 가능성은 낮습니다. 이러한 실험은 좋은 것으로 간주되며 그림 2에서볼 수 있습니다. 셀은 낮은 배율에서 밝은 필드 도메인에서 감지하기 어려울 수 있습니다. 낮은 배율로 쉽게 알 수 있기 때문에 높은 복사 번호(HCN) 플라스미드로 평균 초점 거리를 설정하는 것이 좋습니다. 높은 배율에서 낮은 복사 번호(LCN) 플라스미드를...

이 연구는 합성 유전자 회로의 스토카시 거동을 분석하고 정량화하기 위해 대장균의 단일 세포의 라이브 이미징을 허용하는 현미경 방법을 제시합니다.

The protocol developed here offers a tool to enable computer tracking of Escherichia coli division and fluorescent levels over several hours. The process ...

이 프로토콜은 대장균에서 유전 회로의 연속 측정과 회로 성능을 평가하기 위해 개별 세균 세포에서 신호 가변성 및 신호 대 잡음 비율의 계산이다. 이 기술의 주요 장점은 다른 균주와 실험실에 쉽게 적응할 수 있고 최소한의 훈련과 특수 장비가 필요하며 상대적으로 저렴하다는 것입니다. 노이즈는 생물학적 시스템의 기능을 결정하는 데 중요한 역할을 합니다.현재, 대규모 유전자 회로 를 구축에 관심이 있다. 이러한 시스템은 소음에 의해 억제 될 수 있습니다 잘 샘플을 건조, 가능한 한 오랫동안 섭씨 4도에서 그 냉각 패드를 유지하고, 잘라 내고 환자를 부드럽게 부품을 분할. 분석을 위해 박테리아를 준비하기 위해 감염된 대장균 배양으로부터 단일 식민지를 접종한다.예를 들어 GFP 리포터가 있는 회로입니다. LB 국물의 5 밀리 리터를 포함 하는 유리 튜브에서 관련 항생제와 보충. 국물이 흐릴 때까지 2 시간 동안 흔들리는 인큐베이터에서 섭씨 37도 및 분당 250 회전에서 세포를 성장시면 됩니다.인큐베이션의 끝에서, 2 밀리리터 미니 마이크로 원심분리기에서 희석 용액의 1 밀리리터를 스핀다운하고, 30 마이크로리터의 박테리아와 희석 용액의 전체 부피를 새로운 2밀리리터 튜브로 옮겨넣습니다. 그런 다음 이 서스펜션의 40~60마이크로리터를 M9 배양판에 시드하기 전에 흔들림으로 1시간 동안 배양합니다. 분석을 위해 박테리아를 준비하려면, 전염된 대장균 배양에서 단일 식민지를 접종한다.예를 들어, 관련 항생제로 보충된 LB 국물의 5밀리리터를 포함하는 유리 튜브에서 GFP 기자를 가진 회로. 국물이 흐릴 때까지 2 시간 동안 흔들리는 인큐베이터에서 섭씨 37도 및 분당 250 회전에서 세포를 성장시면 됩니다. 인큐베이션의 끝에서, 2 밀리리터 미니 마이크로 원심 분리기 튜브에 희석 용액의 1 밀리리터를 스핀 다운하고 새로운 2 밀리리터 튜브로 30 마이크로 리터의 박테리아와 희석 용액의 전체 볼륨을 전송합니다.그런 다음 흔들어 1 시간 동안 문화를 배양. 현미경 플레이트를 준비하려면 112.5 밀리그램의 저용 한천과 40 밀리그램의 천, 25 밀리리터 에를렌마이어 플라스크에 2%카산산 1밀리리터를 섞습니다. 다음으로, 25 밀리리터 에를렌마이어 플라스크의 안쪽 입술에 8.92 밀리리터를 추가하고 그 결과 용액을 2~3초 의 짧은 버스트로 전자레인지에 넣습니다.그런 다음 수조를 섭씨 55도로 설정합니다. 용액이 명확할 때, 25 밀리리터 에를렌마이어 플라스크를 섭씨 60도의 수조에 놓고 온도가 섭씨 45~50도까지 떨어질 때까지 한천 용액이 식을 수 있도록 합니다. 한천이 냉각되는 동안 실험실 벤치를 70%에탄올로 청소하고 실험실 테이프를 청소된 벤치에 부드럽게 발라줍니다.유리 커버 1개를 테이프에 놓고 두 번째 커버 슬립을 가까이 놓습니다. 적절한 항생제와 용액에 냉각 된 한천 용액을 추가하십시오. 1.5 밀리리터를 테이프 위에 놓은 커버 슬립에 젤 용액을 젤로 넣고 두 번째 커버 슬립을 젤에 올려 거품을 피하십시오.에를렌마이어를 온수 욕조로 돌려보내 커버 슬립을 20분 간 덮습니다. 덮개 전표를 섭씨 4도에서 1시간 동안 잠식합니다. 인큐베이션의 끝에서, 마른 젤에서 커버 슬립을 제거하고 아가로즈에서 작은 패드를 잘라.인큐베이션 하는 동안, 35 밀리 미터 접시에 준비 된 세균 현탁액의 6 개의 마이크로 리터 방울을 추가 하 고 적어도 15 받는 르 30 분 동안 건조 방울을 허용. 그런 다음 조심스럽게 박테리아의 한 방울에 한 번에 패드를 배치하고 샘플이 실온에서 20 분 동안 설정할 수 있습니다. 샘플을 얼룩지게하지 않고 한천 침대를 배치하려면 부드러운 탭으로 시원한 패드를 물방울에 조심스럽게 놓습니다.샘플을 이미지화하려면 물에서 플라스크를 제거하고 젤 용액이 체온으로 냉각되도록 하십시오. 3밀리미터의 젤을 샘플 플레이트 둘레에 붓습니다. 아가로즈가 고화되면 테이프로 플레이트를 밀봉하고 25 게이지 바늘을 사용하여 테이프에 여러 개의 구멍을 부수습니다.그런 다음 아가로즈가 완전히 응고할 수 있도록 최대 30분 동안 4°C의 거꾸로 판을 거꾸로 놓으면서 세포 미토시스를 방지합니다. 24시간 이내에 형광 공초점 현미경을 사용하여 가장 낮은 배율에서 샘플을 찾고 현미경의 자동 초점 시스템을 참여시다. 적절한 목표에 오일을 적용하고 플랫폼 컨트롤러를 사용하여 플레이트를 이동하여 오일을 조심스럽게 확산시다.그런 다음 자동 초점을 다시 참여시키고 Z 단계 단면에 대한 기본 제안을 따라 샘플을 이미지화합니다. 대장균은 흰색 배경이 떨어져 있는 검은 색 직사각형 모양으로 나타나야 합니다. 그리고 휘도의 동적 범위는 중앙에 스파이크를 보여야한다.미토시스 이벤트는 30분 후에 형광 현미경 검사법에 의해 먼저 검출될 수 있습니다. 개별 세포는 낮은 배율에서 검출하기 어려울 수 있더라도. 잘못된 희석 비로 제조된 세균성 세포 배양은 변하지 않는 수의 세포를 입증할 수 있으며, 플레이트 밀봉 없이 제조된 시료는 과도한 수축을 나타낼 수 있어 집중력상실을 초래할 수 있다.세포는 또한 영양소를 검색하는 데 젤을 들여주어 세균 세포가 서로 겹쳐서 세포 단층을 손상시키며 세포 감지 및 신뢰할 수 있는 형광 신호 측정을 효과적으로 방지할 수 있습니다. 이러한 데이터에 의해 제안된 바와 같이, 분할 주기의 셀 스테이지는 다양한 영역 범위가 동일한 추세를 나타내므로 노이즈 레벨에 영향을 미치지 않습니다. 또한 이러한 대표적인 데이터에 의해 설명된 바와 같이 GFP와 초폴드 GFP 간에는 신호 대 잡음 비율의 실질적인 변화가 관찰되지 않는다.이 절차를 수행할 때, 실험에 사용되는 세균 균주에 대한 올바른 희석 비율을 결정하기 위해 주의하십시오. 각 조절 회로의 신호 대 잡음 비율을 이 베이스 라인과 비교하면 최고의 성능 회로를 선택할 수 있으며 흥미로운 현상을 드러낼 수 있습니다.

continuous-measurement-biological-noise-escherichia-coli-using-time

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

에서 다세포 행동을 기록 Myxococcus 산투스</em시간 저속 Microcinematography를 사용하여> Biofilms

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생물발광을 사용한 마우스의 박테리아 감염 역학 추적

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박테리아의 항생제 지속성을 연구하기 위한 미세유체 타임랩스 현미경

출처: 케이빈, M. T. 외 Bacillus subtilis의 단세포 미세유체 분석. J. Vis. Exp. (2018)이 영상은 단일 세포 수준에서 박테리아 성장을 관찰하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 이 연구는 미세한 도랑 내에 갇힌 비운동성 박테리아 세포가 형광 현미경 아래에서 지속적으로 영양을 공급받고 영상화되는 과정을 보여줍니다. 이 장치는 여러 세대에 걸친 세포 분열 및 계통 추적의 실시간 시각화를 가능하게 합니다.

마이크로플루이딕 시스템에서 단일 세포 해상도로 박테리아 성장 추적

출처: 차이모비츠, E. A. 외 타임랩스 현미경을 이용한 대장 균의 생물학적 잡음 연속 측정. J. Vis. 경험 (2021)이 영상은 타임랩스 현미경을 이용해 박테리아의 성장 및 분열 과정에서 GFP 형광의 변동을 추적하여 대장균 의 생물학적 잡음을 실시간으로 시각화하는 과정을 보여줍니다.

타임랩스 현미경을 이용한 박테리아의 생물학적 잡음 연속 모니터링

출처: Schumacher, D., 그리고 Sogaard-Andersen, L. 느리게 성장하는 사회성 박테리아 Myxococcus xanthus 의 완전한 영양 세포 주기의 형광 생세포 영상. J. Vis. Exp. (2018)이 영상은 박테리아 세포 분열 중 형광 태그된 염색체 기원을 추적하기 위해 생세포 영상을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 타임랩스, 위상 차이 현미경 및 형광 현미경을 사용하여 염색체 분리 역학을 포착합니다.

형광 표지 박테리아의 염색체 분리 타임랩스 영상

출처: Makowski, Ł. 외 타임랩스 형광 현미경을 이용한 박테리아 포식자 Bdellovibrio bacteriovorus 의 생세포 영상. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 아가로스 패드 아래 고정된 대장균을 포식하는 Bdellovibrio bacteriovorus의 타임랩스 형광 영상을 시연하여, 박테리아 포식 및 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 데 있어 세포 내 복제와 자손 방출을 실시간으로 시각화할 수 있게 합니다.

Bdellovibrio bacteriovorus의 생세포 타임랩스 영상 대장균에 대한 포식

이 문서에서는 사용자 지정 미세 장치를 채용 하는 개별 벌레의 라이브 이미징을 설명 합니다. 장치에서 여러 벌레는 개별적으로 별도 챔버, 다양 한 생물 학적 과정의 다중화 경도 감시 허용에 국한 됩니다.

꼬마 선 충 에 경도 이미징을 위한 미세 플랫폼

이 프로토콜은 mRNA 합성 및 분해의 생체 내 운동학을 측정하기 위해 시상 혼성화(smFISH)에서 단일 분자 형광의 적용을 설명합니다.

시투 혼성화에서 2색 단일 분자 형광을 사용하여 에샤리치아 대장균의 공간과 시간에서 mRNA 운동학을 프로빙

효모 성장 표현형은 마이크로콜로 성장하는 고정 된 세포의 매우 병렬 시간 경과 이미징을 통해 정확하게 측정됩니다. 동시에, 스트레스 내성, 단백질 발현 및 단백질 국소화를 모니터링할 수 있고, 통합된 데이터 세트를 생성하여 환경 및 유전적 차이뿐만 아니라 동종 세포 간의 유전자 발현 이질성, 변조 성장을 연구할 수 있습니다.

성장과 유전자 발현의 이질성을 측정하는 마이크로콜로니의 높은 처리량 라이브 이미징

항생제 지속성은 민감한 동종 집단 내의 작은 하위 집단이 고용량의 살균 항생제를 일시적으로 견딜 수 있는 능력을 설명합니다. 현재 프로토콜은 대장균 을 치사량의 오플록사신에 노출시킨 후 분자 및 세포 수준에서 항생제 지속성 표현형을 특성화하기 위한 접근 방식을 결합합니다.

대장균의 항생제 지속성에 대한 개체군 및 단일 세포 분석

배우세요 대장균에서 시간 경과 현미경 검사를 이용한 합성 유전자 회로의 생물학적 소음 지속 측정 방법입니다. 이 기법은 신호 변동성과 신호 대 잡음비를 계산하여 회로 성능을 평가하며, 다양한 균주와 실험실에 쉽게 적용할 수 있는 비용 효율적인 도구입니다.

시간 경과 현미경 검사를 사용하여 대장균에서 생물학적 소음의 지속적인 측정

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