마이크로베식및 엑소좀의 종이 기반 전농도 및 격리

이 프로토콜에서는 세포외 소포를 분리하는 효과적인 농축을 위해 설계된 XO Pad라는 종이 기반 장치를 제조하는 간단한 방법을 설명합니다. XO 패드는 화학 물질이나 작업 기계를 사용하지 않고 세포 외 소포를 미리 농축하고 분리할 수 있는 간단한 장치이며, 기존의 방법보다 더 높은 회수율을 보이고 있습니다. 먼저 프린터 소프트웨어로 인쇄할 영역을 정의합니다.

설계에는 원형 샘플 영역의 직경이 5밀리미터에서 2밀리미터로 점차 좁아진 12개의 왁스 패턴 레이어가 있어야 합니다. 그런 다음 셀룰로오스 용지의 양쪽에 지정된 부위에 소수성 왁스를 인쇄합니다. 왁스 인쇄 용지를 실험실 오븐에 섭씨 120도에서 80초 동안 놓고 왁스 인쇄 용지를 커터로 잘라 개별 XO Pad 장치를 만듭니다.

파마 선택적 멤브레인의 5및 2 마이크로리터를 각각 왼쪽 대부분 및 오른쪽 대부분의 층의 샘플 영역에 놓습니다. 용매를 증발시키기 위해 30분 동안 온전한 플레이트에 파마 선택 멤브레인으로 코딩된 층을 30분간 섭씨 70도에 놓습니다. 그런 다음 버퍼 용액을 향하는 코팅된 층의 가장 바깥쪽 표면을 압력에 민감한 테이프로 밀봉하여 작은 구멍을 남깁니다.

XO 패드 장치를 흰색 선을 따라 앞뒤로 접어 모든 샘플 영역을 수렴합니다. 수렴 샘플 영역에서 마이크로베식 및 외식 샘플의 피펫 15 마이크로리터와 완전한 습윤을 보장하기 위해 몇 초 정도 기다립니다. XO 패드의 양쪽 끝에 두 개의 아크릴 챔버를 놓고 작은 바인더 클립으로 단단히 고정하여 전개를 방지합니다.

0.1X PBS의 110 마이크로리터로 챔버를 채우고 두 개의 은 전극을 삽입합니다. 그런 다음 전류 전압 소스 측정 시스템을 사용하여 20 분 동안 전극에 30 볼트를 적용하십시오. 농축된 마이크로베실과 외종기를 분리하기 위해 접힌 XO 패드를 아크릴 챔버에서 분리하고 장치를 전개하여 농축된 입자를 다른 층으로부터 분리한다.

마이크로베실과 엑소좀이 다운스트림 분석을 위해 농축되는 8층과 9층의 샘플 영역을 펀치합니다. 농축된 입자의 최대 회수를 위해 작동 시간을 최적화하기 위해 형광으로 표지된 마이크로베시클 및 엑소좀의 시간 경과 이동 분석이 수행되었다. 모든 샘플 영역의 형광 강도는 ImageJ 소프트웨어로 정량화되었습니다.

농축 공정 전에, 마이크로베실과 엑소좀은 강도의 점진적인 감소와 모든 견본 지역에 분산되었다. 10분간의 처리 후, 입자는 전기 키네틱으로 이동했고, 7층에는 즉각적인 사전 농도 플러그가 나타났다. 시간이 20분에 이르렀을 때, 마이크로베실과 엑소좀은 8층과 9층에 강하게 초점을 맞추고 형광 강도에 기초하여 5배 농축되었다.

농축 된 미생물및 외종의 무결성은 SEM으로 조사되었다. 농축된 미생물및 엑소좀의 크기 분포도 분석되었다.

이어서, 6층, 8층, 10층의 샘플 영역에 농축된 미생물 및 엑소좀의 실제 농도를 분석하였다. 8층에서는, 마이크로베실과 엑소좀은 5.58의 요인에 의해 미리 집중되었지만, 다른 층에서는 눈에 띄는 사전 농도가 관찰되지 않았다. 이 절차의 재현성을 보장하기 위해 최적화된 조건이므로 장치 검증 및 장치 작동 시간 동안 오븐 인큐베이션 시간과 온도에 대한 프로토콜을 정확하게 따랐습니다.

XO 패드는 탄산염 버퍼를 사용하여 혈청 이나 혈장과 같은 단백질이 풍부한 샘플에서 세포 외 소포를 분리하고 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 진단, 약물 전달, 면역 요법 및 기타 치료와 같은 임상 연구에 필요한 사전 집중 및 격리 기능을 갖춘 효율적이고 간단한 준비 도구를 제공할 수 있습니다.