Name: 미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 학습하세요 미토칸드리아 기능과 무관하게 세포 생존율을 평가하는 자동화 차등 핵 염색 분석법을. Hoechst 33342와 프로피듐 요오드화물을 사용하여 고속 약물 스크리닝이 가능하며, 다양한 세포 유형에서 화합물의 세포독성을 정확하게 측정합니다.

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NVK, 암 연구에 있는 CPRIT 학자, 그들의 관대 한 지원에 대 한 텍사스의 암 예방 및 연구 연구소 (CPRIT) 감사, CPRIT 부여 RR150044. 이 작품은 또한 웰치 재단 연구 보조금 C-1930에 의해 지원되었다, 건강 R35 GM129294 NVK에 수여 국립 연구소에 의해. 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다.

1. 세포 독성 분석: 설정
<ol><li>적절한 매체에서 원하는 농도로 관심 있는 화합물의 솔루션을 준비한다(혈청 프리 또는 1, 2.5 또는 5% FBS RPMI-1640).<ol>
<li>단일 화합물의 세포 독성을 측정하려면 (예를 들어, 효과적인 복용량을 결정하기 위해), 2 배 최종 농도에서 화합물을 준비.</li>
		<li>화합물 조합의 세포 독성을 측정하려면 4배 의 최종 농도에서 화합물을 준비하십시오.</li>
		<li>동일한 양의 용매를 적절한 배지와 혼합하여 용매 전용 컨트롤을 준비합니다. 예를 들어, DMSO 및 메탄올에 용해된 화합물을 테스트하는 경우 각 용매에 대한 용매 전용 제어를 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>배양 접시에서 세포를 수집하거나 15 mL 원추형 튜브로 플라스크합니다.</li>
	<li>10 μL 0.4% 트라이팬 블루로 셀 서스펜션 10μL을 마이크로센심분리기 튜브와 얼룩으로 옮기다. 혈종계를 사용하여 각 세포 소스에 대해 실행 가능한 셀과 실행 불가능한 세포를 계산합니다.</li>
	<li>펠릿 셀은 200 g에서 5 분 동안. 흡인 또는 열상.</li>
	<li>3*105 세포/mL의 세포 밀도에서 분석에 적합한 매체(혈청 프리 또는 1, 2.5, 5% FBS RPMI-1640)에서 세포 펠릿을 재중단합니다. 참고 1: 3*105 셀/mL의 세포 밀도는 15,000개의 세포/웰의 파종 밀도를 제공합니다. 시드 밀도는 중요한 매개 변수이며 이상적으로 실험 전에 미리 정의되어야합니다. 종자 밀도는 1) 세포 크기를 고려해야합니다 - 일반적으로 더 큰 세포는 낮은 밀도로 시드됩니다; 2) 처리 기간 - 세포는 일반적으로 더 오래 지속될 실험을 위한 더 낮은 밀도에서 시드됩니다; 및 3) 세포 분열 속도 - 분열의 더 높은 비율을 가진 세포는 더 낮은 밀도로 시드됩니다. 최적화된 파종 밀도의 특정 예: K562 셀, 더 큰, 24 시간 지속 시간 – 10,000 세포/웰; MOLM-13 세포, 적당한 크기, 24 시간 처리 – 15,000/well; MOLM-13 세포, 48 h 치료 – 8,000/웰; 작은 건강한 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 24 시간 치료 – 50,000/웰; 1 차적인 AML 세포, 24 시간 처리 – 15,000-20,000/well. 참고 2: 미디어에 FBS의 존재화합물의 활동에 영향을 미칠 수 있습니다. FBS의 농도를 감소시키는 것은 분석 결과를 해석하는 것을 더 간단하게 만들 수 있습니다, 그러나 또한 생리적 정확도를 감소시킵니다.</li>
	<li>종자 50 μL의 세포 현탁액은 멀티 채널 파이펫을 사용하여 96 웰 플레이트의 각 웰로 1.5 단계에서.</li>
	<li>다음과 같이 화합물을 추가하십시오.<ol>
<li>단일 화합물 스터디의 경우 각 웰에 2배 화합물 용액50 μL을 추가합니다. 용매 제어 우물의 경우 2배 농도에서 용매를 포함하는 50 μL의 테스트 미디어를 추가합니다.</li>
		<li>조합 된 소의의 경우 각 화합물 (4x 용액)의 25 μL을 각 우물에 추가하십시오. 단일 복합 제어 우물의 경우 4배 화합물 용액 25μL과 25μL의 테스트 배지를 추가합니다. 용매 제어 우물의 경우 용매를 포함하는 테스트 배지 또는 테스트 배지의 50 μL을 추가합니다. 참고 1: DMSO의 최종 농도는 0.5%를 초과해서는 안 됩니다. 참고 2: 피펫이 각 웰의 벽을 터치하여 낮은 부피로 인해 화합물을 포함하는 미디어를 추가하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>접시를 부드럽게 탭하여 우물의 내용물을 혼합하십시오.</li>
	<li>예를 들어, 24h에 적합한 시간 동안 가습 된 5 % CO2 분위기에서 37 °C에서 플레이트를 배양합니다.</li>
</ol>2. 세포 독성 분석: Hoechst 33342 및 프로피듐 이오디드와 염색
<ol><li>10배 염색 용액을 준비합니다. 이 솔루션은 각 실험 전에 새로 준비해야하며 저장할 수 없습니다. 최종 염료 농도는 실험 전에 결정되어야 한다.<ol>
<li>백혈병 세포주 및 1차 백혈병 세포의 경우, 1mL의 1mL의 1mL의 10mMHoechst 33342 및 멸균 PBS의 1 mg/mL 프로피듐 요오드의 50 μL(최종 농도: Hoechst 33342 20 μM, PI 5 μg/mL)이 함유되어 있습니다.</li>
		<li>건강한 PBMC의 경우 1mL의 1mL의 10mML는 멸균 PBS의 20m Hoechst 33342 및 1mg/mL 프로피듐 요오드의 10 μL을 함유하고 있습니다(최종 농도: Hoechst 33342 20 μM, PI 1 μM/mL). 참고: 요오드의 최종 농도는 실험 전에 결정되어야 합니다. 세포는 PI 농도 범위(1, 2.5, 5 μg/mL)를 사용하여 테스트해야 하며, Hoechst/PI 계산된 생존가능성은 트라이팬 블루를 통해 측정된 생존가능성과 비교되어야 합니다. 위에 나열된 PI 농도는 미디어 제어 우물에서 표적 세포 생존가능성을 기준으로 선택되었다(백혈병 세포주 경우 ~90%, 건강한 PBMC의 경우 ~70% 이상). 주의: Hoechst 33342 및 프로피듐 요오드는 잠재적인 발암 물질입니다. 취급할 때 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인큐베이션 후 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 웰에 10배 염색 버퍼의 10μL을 추가합니다. 참고: 교차 오염을 방지하려면 파이펫 팁이 미디어에 닿지 않도록 하십시오.</li>
	<li>접시를 부드럽게 탭하여 거품을 섞고 치웁립니다. 15 분 동안 37 °C에서 얼룩.</li>
	<li>플레이트의 바닥에 모든 세포를 가져오는 4 분 동안 200g의 플레이트원심분리기. 젖은 김와이프로 플레이트 바닥을 조심스럽게 닦아 섬유 및/또는 이미징을 방해하는 이물질을 제거합니다. 참고 1: 플레이트의 원심 분리는 모든 세포가 이미지에서 캡처될 확률이 가장 높습니다. 종종 죽은 세포는 분리하고 부유하여 세포 독성의 오해의 소지가있는 값을 제공합니다. 원심 분리는 이 효과를 완화합니다. 참고 2: 원심 분리 후 15분 이내에 플레이트를 가능한 한 빨리 이미지화해야 합니다. 원심분리는 PI 염색의 선택성을 감소시킬 수 있으며 세포가 천천히 요오드를 발생시킬 수 있다. 죽은 세포를 시각화하여 얻은 정확도의 개선은 PI 염색의 약간의 증가보다 큽니다. 원심분리의 1 시간 이내에 이미징을 완료하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>3. 세포 독성 분석: 데이터 수집
<ol><li>자동 현미경/플레이트 이미저용 소프트웨어를 설정하여 Hoechst 33342(발아 최대 350nm, 방출 최대 461nm) 및 PI(발아 최대 493nm, 방출 최대 636nm)에 대한 형광을 감지합니다. 두 채널 모두에서 각 웰에 대한 이미지를 수집합니다.</li>
	<li>소프트웨어(예: CellProfiler, MatLab http://cellprofiler.org/, ImageJ 또는 Gen5와 같은 독점 소프트웨어를 기반으로 하는 무료 이미지 분석 스튜디오)를 사용하여 각 채널의 각 웰의 셀을 계산합니다. 참고: 모든 세포는 Hoechst 33342로 염색되어야 하고, 죽은 세포는 PI로 염색되어야 하기 때문에, 죽은 세포의 비율은 모두 죽은 세포의 분획을 나타냅니다. 예를 들어, 처리되지 않은 샘플에서 자동 수에 PI(죽은 세포)로 염색된 467개의 세포와 Hoechst 33342(총 세포)로 염색된 2335개의 세포를 나타내면, 분수는 0.2 또는 20%이다. 이 값은 치료가 사용된 동일한 처리된 샘플과 비교됩니다.</li>
	<li>Cytation5 셀 이미징 멀티 모드 리더 및 Gen5 대 3.00 소프트웨어를 사용하여 Hoechst/ PI 데이터 수집에 대한 자세한 설명:<ol>
<li>Cytation5 멀티 모드 플레이트 리더 /이미저를 평평한 바닥, 96 웰, 일반 검은 색 플라스틱 플레이트의 이미지 셀로 설정합니다.</li>
		<li>표준 DAPI 및 텍사스 레드 필터 세트를 활용하도록 이미징 프로토콜을 설정합니다. 4배 배율 목표를 사용하여 웰 센터에서 이미지를 가져 가라. 오프셋(X/Y 또는 Z)을 사용하지 않습니다. DAPI – LED - 10, 통합 시간 - 99, 게인 - 0; 텍사스 레드 – LED - 8, 통합 시간 - 950, 이득 - 18. DAPI 신호를 사용하여 자동 초점 작업을 수행합니다. 채널 간에 초점을 맞추는 데 오프셋이 없어야 합니다.</li>
		<li>Gen5 소프트웨어 v 3.00을 사용하여 이미지 분석을 수행합니다. 소프트웨어 설정에서 셀을 크기가 5~25μm 사이의 모양으로 정의합니다. 특수 옵션 "분할 터치 오브젝트"를 켜서 기본 모서리 개체를 제외하고 터치 오브젝트를 분할합니다.  다음으로 이미지를 처리하여 배경(어두운 배경 빼기)을 제거하고, 핵 마스크(임계값 DAPI &gt;= 6000 AU)를 적용하고 객체를 계산합니다. PI 염색(임계값 텍사스 레드 &gt;= 5000 AU)을 기반으로 하위 인구 분석을 수행하고 개체수를 계산합니다. 셀 생존율 %는 (1 - <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61295/61295eq1.jpg"> 로 정의된다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

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Hoechst/PI 세포 독성 분석에 대한 프로토콜은 견고하고 비교적 작은 실습 시간이 필요하지만 정확한 결과를 보장하는 데 매우 중요한 몇 가지 실험 적 세부 사항이 있습니다. 첫째, DMSO의 농도가 0.5%(v/v) 이하로 유지되도록 하는 것이 필수적입니다. 일반적으로 DMSO의 저용량에도 노출되면 세포의 형태와 부착을 실질적으로 변화시키고 세포 주기 진행을 크게 지연시킬 수 있다는 데동의된다39,40.
둘째, 염색은 치료 후 가능한 한 빨리 수행되어야한다. 세척 단계가 없기 때문에 화합물은 우물에 남아 있으며 세포에 손상을 계속 가할 수 있습니다. 이전프로토콜(35)에비해, 세포는 단지 15분 동안 염색되었다. 이것은 실행 가능한 세포가 프로피듐 요오드로 실수로 얼룩질 수 있다는 가능성을 제한합니다. 이러한 이유로, 우리는 두...

효과적인 암 치료를 확인하는 첫 번째 단계는 치료의 효과를 검사하는 데 사용할 수있는 강력하고 편견없는 세포 독성 분석의 선택입니다. 낮은 처리량 실험에 대 한 일반적인 선택은 살아있는 세포에서 trypan 블루 염료의 제외. 이 방법은 세포 생존을 정량화하는 비교적 편견없는 방법을 허용하기 때문에 선호된다. trypan blue는 막이 손상된 세포로 수동적으로 확산되지만 건강한 세포1을입력하는 것이 효과적으로 차단됩니다. 살아있는 세포와 총 세포의 몫은 치료의 효험을 나타내는 백분율 생존력을 나타냅니다. trypan 파란색 분석의 가장 중요한 단점은 높은 처리량 방법론에 적합하지 않다는 것입니다. 그것은 상대적으로 낮은 신호 대 잡음 비율을 가지고 있으며, 장기간 염색으로 인해 실행 가능한 세포의 얼룩으로 인해 아티팩트를 초래할 수 있습니다. 따라서 trypan 파란색 제외는 일반적으로2이며수동 계수로 강등됩니다. 이것은 너무 느리게 하고 연구원의 주관적인 판단으로 인한 편견의 강한 가능성을 소개합니다 (눈부신 또는 독립적 인 카운트가 사용되지 않는 한 실험실 처리량을 더 줄입니다). 일반적으로, 이 분석의 처리량은 현대 약 발견을 위해 불충분합니다.
일반적으로 훨씬 더 높은 처리량을 가진 생존 가능성 분석은 연구원이 이 한계를 우회할 수 있게 하지만 중요한 주의 사항(표 1참조). 이러한 메서드는 일반적으로 두 그룹으로 나뉩니다. 한 그룹은 세포 레독스 효소의 기능에 기초한 착색 분석으로 구성됩니다. 무색 또는 비형광 기판은 분광광계를 사용하여 정량화 할 수있는 생생한 제품으로 변환됩니다. 테트라졸륨 염(MTT, WST-1, XTT 등)과 레사쥐린등이 대표적인 예입니다. 이 범주에는 또한 ATP 수준을 평가하기 위해 루시페린을 활용하는 발광 성 소사도 포함됩니다. 이 모형의 분석은 세포 대사를 측정하는 근본적인 한계가 있습니다, 이는 세포 생존성이 아닙니다. 세포가 불리한 조건하에서 정지되는 것은 매우 일반적이지만, 여전히3,4,5를분할하는 능력을 유지합니다. 예를 들어, 암줄기세포는 종종 비교적 대사적으로정지6,7,8,9,이러한 기술을 사용하여 분석하기 어려울 가능성이 있다. 대부분의 미토칸과 같은 미토콘드리아 기능을 손상시키는 치료의 효과또한 상당히 과대 평가될 가능성이 높습니다.
다른 방법론은 생물학적 막을 교차하거나 교차하지 않도록 허용하는 다양한 물질의 화학적 특성을 활용합니다. 한 가지 예는 SYTOX 또는 프로피듐 요오드 (PI)와 같은 핵 얼룩입니다. 이 범주에는 또한 개념상 유사하지만 기능상 다른 분석(LDH) 분석, 세포 괴사의 지표로서 세포외 밀리유로LDH의 방출을 측정하는분석(도 1,표 1). 이 소는 신진 대사비활성 세포와 죽은 세포를 구별할 수 있습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>분석/염료</td>
			<td>세포 사멸의 유형(들) 검출</td>
			<td>필요한 장비</td>
			<td>주요 기능</td>
		</tr>
<tr>
<td>MTT, CKK-8, 알라마 블루 (레사쥐린)</td>
			<td>아포토시스/괴사증</td>
			<td>분 광 광도 계</td>
			<td>저렴, 빠른; 끝점 분석; 효소의 활성 (MTT의 경우 독점적으로 미토콘드리아)에 의존하고 세포 사멸 의 모드를 구별하지 않습니다1,10
</td>
		</tr>
<tr>
<td>LDH 릴리스</td>
			<td>괴 사</td>
			<td>분 광 광도 계</td>
			<td>급속한, 미토콘드리아 효소의 활성과 무관; 높은 처리량 테스트에 대 한 비싼; 결합된 혈장 막11,12를 가진 괴사 세포를 검출합니다
</td>
		</tr>
<tr>
<td>트라이판 블루 (TB)</td>
			<td>아포토시스/괴사증</td>
			<td>현미경</td>
			<td>세포 불굴의; 세포 사멸의 모드를 구별하지 않습니다; 고처리량 스크리닝에 적합하지 않은 고공처리량 스크리닝; 부착 셀과 함께 사용하기가 더 어렵다; 사용자의 주관적인 판단에 취약하지만 표준 셀 생존성 측정방법(13)으로 간주됩니다.
</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">아크리딘 오렌지 (AO)</td>
			<td>아포토시스/괴사/</td>
			<td rowspan="2">형광 현미경</td>
			<td rowspan="2">독특한 스펙트럼 특성을 가진 핵산 염료는 세포석증과 괴사/necroptosis14를 구별할 수 있습니다.
</td>
		</tr>
<tr>
<td>네크로토시스</td>
		</tr>
<tr>
<td>호흐트스트 33342, DAPI</td>
			<td>Apoptosis</td>
			<td>형광 현미경 또는 유동 세포계</td>
			<td>세포 투과성; 세포 사멸을 모니터링하는 것은 그 자체로 부적절합니다. 공동 염색에 유용합니다. 초기 세포사멸에서 크로마틴 응축 및 핵 단편화를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 요오드제와 페어링하여 사멸을 괴사15,16과 구별할 수 있습니다.
</td>
		</tr>
<tr>
<td>프로피듐 이오드 (PI)</td>
			<td>늦은 자멸/괴사</td>
			<td>형광 현미경 또는 유동 세포계</td>
			<td>세포 불굴의 인터칼레이터; 세포사멸의 후기 세포사멸 및 괴사 모드를 모두검출한다(17). 긴 잠복 시간18 후 독성 및 투과성
</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. 세포 독성 검사 목록. 세포 독성 연구, 일부는이 연구에서 사용 되었다, 그들의 주요 기능에 대 한 간단한 설명과 함께 나열.
최근 연구에 따르면 미토콘드리아 대사가 일부 암19,20,21,22,23,24,25에서변경된다는 것을입증했습니다. 예를 들어, 급성 골수성 백혈병(AML)은 그들의 에너지 요구를 충족시키기 위하여 그들의 미토콘드리아 질량, mtDNA 함량 및 미토콘드리아 호흡을 강화시키는 것으로 나타났습니다19,26,27. 한편, 일부 고형종양은 OXPHOS에 관여하는 미토콘드리아 단백질의 다운조절또는 mtDNA 함량 감소와 같은 미토콘드리아 기능 장애 또는 오히려 "대사 재프로그래밍"을 특징으로 하며, 이는 종양 침습성, 전이성 전위 및 세포멸 유발 약물에 대한 내성과 관련이 있다28,29. 더욱이, 최근에는 특정 암에 대한 잠재적 치료법으로 미토콘드리아 기능(일반적으로 미토칸30이라고함)에 영향을 미치는 기계적으로 다양한 화합물을 사용하는 것에 대한 관심이 증가하고 있다. 이들 약물은 ATP 합성, 미토콘드리아 DNA, OXPHOS 및 ROS 생산을 대상으로 하며, 미토콘드리아(30,31)와관련된 세포세포 및 세포세포 단백질을 표적으로 한다. 몇몇 연구 결과는 이 접근이 중요한 약속19,32,33,34가있다는 것을 보여주었습니다. 그러나, 암 세포 생물학 또는 미토콘드리아 표적화 처리에 있는 이 신진 대사 편차는 미토콘드리아 기능에 근거를 둔 전통적인 생존가능성 소사에 현저하게 영향을 미칠 수 있습니다.
여기서, 차동 핵 염색 분석에 대한 최적화된 프로토콜이 설명된다. 이 프로토콜은 미토칸의 세포 독성 또는 다른 화합물과의 조합의 빠르고 정확한 측정을 허용합니다. Hoechst 33342는 세포막을 쉽게 교차시켜 DNA를 얼룩지게 하는 세포 침투 핵 염료로, 총 세포 수를 얻을 수 있게 한다. 죽은 세포의 핵만으로 들어가는 PI와 공동 염색함으로써, 살아있는 비율(Hoechst 만) 및 죽은(둘 다염색) 세포가 정확하게 결정될 수 있다. 이 프로토콜은 공표된분석법(35)을 단계별 염료 농도 최적화를 위한 단계(직교 트라이팬 블루 방법을 이용한 교차 참조 결과)와 이미징 전에 플레이트의 원심분리를 정제한다. 많은 세포주반 부착 또는 일시 중단되기 때문에 원심분리는 이미지화되어 정확도를 강하게 향상시키는 세포의 비율을 증가시킵니다. 분석법은 스테인링이 미디어 또는 세척을 제거할 필요가 없다는 것을 포함하여 몇 가지 장점이 있습니다. 염료 혼합물은 또한 저렴하고, 준비하기 쉬우며, 멀티채널/로봇 파이펫팅 시스템과 호환됩니다.
세포가 염색된 후에, 그(것)들은 자동화한 현미경으로 심상입니다. 이는 나중에 다시 분석할 수 있는 이미지의 영구 기록을 만드는 장점이 있으며, 특정 화합물의 효과는 캡처된 이미지의 육안 검사에 의해 재평가될 수 있다. 이미지를 획득하면 셀을 수동으로 또는 무료(예: ImageJ, CellProfiler 등) 및 상용 소프트웨어(예: 변형, Gen5 등)를 포함한 여러 소프트웨어 패키지를 사용하여 셀을 계산할 수 있습니다. 자동화된 셀 카운팅은 일반적으로 수동 셀 계산보다 더 정확하고 편향이 적기 때문에 일반적으로 바람직합니다. 또한 세포 파편이나 용해성 복합체를 보다 효과적으로 무시합니다. 이러한 파이프라인의 개발은 일반적으로 간단하며 사용되는 얼룩의 효율성에 의해 단순화됩니다. 출력은 실제 죽은 세포의 수가 총 세포 수에 대하여 자동으로 계산되기 때문에 정량적이며, 다른 임계값은검출(35)의스트링성을 증가 또는 감소시키기 위하여 적용될 수 있다. 편의를 위해 Gen5 대 3.00 소프트웨어 호환 Cytation 5 셀 이미징 멀티 모드 리더를 사용하여 셀 을 계산하기 위한 최적화된 매개 변수가 포함되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2-Deoxy-D-glucose/2-DG</td><td>Chem-Impex</td><td>50-519-067</td><td></td></tr><tr><td>3-bromo-pyruvate</td><td>Alfa Aesar</td><td>1113-59-3</td><td></td></tr><tr><td>96-Well plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655090</td><td>검은색 또는 투명한 평평한 바닥 96-well plates </td></tr><tr><td>Alamar blue HS cell viability reagent (100mL)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A50101</td><td></td></tr><tr><td>Countess II 자동 세포 계수기</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytation 5 세포 이미징 다중 모드 리더</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>62249</td><td>20 mM 용액; 최종 농도 1:1,000 </td></tr><tr><td>HyClone 소 태아 혈청</td><td>GE Healthcare</td><td>#25-514</td><td></td></tr><tr><td>m-chlorophenylhydrazone/CCCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2759</td><td></td></tr><tr><td>PBS 정제</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP2944100</td><td>1정 + 멸균수 200mL = PBS 용액 1개 </td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신-글루타민(100X)</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Pierce LDH 분석 키트</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-103-5952</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>Thermo Fisher</td><td>50-596-072</td><td>건조 분말; PBS에 1 mg/mL 저장; 최종 농도 5 &마이크로; g/mL (백혈병 세포), 1 & 마이크로; g/mL(일반 PBMC) </td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Ark Pharm</td><td>AK115691</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 ><L-글루타민 및 중탄산나트륨 포함, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합</td><td>시그마 Aldrich</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드</td><td>ACROS Organics</td><td>AC158990010</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>세포주</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td>CML 세포주 </td></tr><tr><td>MOLM-13</td><td>ATCC</td><td></td><td>AML 세포주 </td></tr><tr><td>MOLT-4</td><td>ATCC</td><td>CRL-1582</td><td>ALL 세포주 </td></tr><tr><td>OCI-AML2</td><td>ATCC</td><td></td><td>AML 세포주 </td></tr></tbody></table>

미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

미토콘드리아가 온코겐성 변화에 기여하는 것은 광범위한 관심과 적극적인 연구의 대상입니다. 암 대사 분야가 더욱 복잡해짐에 따라 미토콘드리아 손상(소위 미토칸)을 가하는 다양한 화합물을 이용한 미토콘드리아를 표적으로 하는 것이 매우 인기를 끌고 있습니다. 불행히도, 테트라졸륨 염이나 레사쥐린을 기반으로 하는 것과 같은 많은 기존 세포 독성 작용제는 그들의 성능을 위해 기능적인 미토콘드리아 효소가 필요합니다. 미토콘드리아를 표적으로 하는 화합물에 의해 가해진 손상은 수시로 이 심세의 정확도를 손상합니다. 여기서는 두 개의 형광 염료를 가진 차동 염색에 기초하여 변형된 프로토콜을 설명하고, 그 중 하나는 세포 분산(Hoechst 33342)이고 다른 하나는 그렇지 않다(예의 요오드). 염색의 차이는 살아있는 세포와 죽은 세포를 차별할 수 있게 합니다. 분석법은 처리량을 증가시키고 편견을 감소시키는 자동화된 현미경 검사법과 이미지 분석에 사용가능합니다. 이것은 또한 96 웰 플레이트를 사용하여 고처리량 방식으로 분석방법을 사용할 수 있게 해주며, 특히 문제의 약물이 어느 정도의 미토독성을 가지고 있을 때 약물 발견 노력을 위한 실행 가능한 옵션입니다. 중요하게도, Hoechst/PI 염색 분석체에 의해 얻은 결과는 분석이 다른 방법에 비교될 때 트라이판 블루 배제 결과 및 생물학적 복제 사이에 모두 증가된 일관성을 보여줍니다.

전술한 프로토콜은 대표적인 급성 골수성 백혈병 세포주로서 취해진 OCI-AML2 세포를 사용하여 개발되었다. AML은골수(26)에서미분화 및 비기능성 조혈 세포의 비정상적인 증식을 특징으로 한다. AML 표적 치료의 최근 발달에도 불구하고, 배려의 표준은 수십 년 동안 변경되지 않은 남아 있고, 유도 치료로 구성됩니다 (전형적으로 탄트라시클라인의 3 일, 예를 들면, daunorubicin, 이다루비신, 또는 탄트라네디온 미톡산 왕좌, 그리고 7 일간의 사이타라빈 의 다음) 그 다음에 통합 (전형적으로 사이타라빈 의 라운드의 라운드로구성)다음 통합 (전형적으로 사이타라빈 의 라운드의 라운드로 구성) 다음 .
도 1A에설명된 프로토콜에 따라, OCI-AML2 세포는 96웰 플레이트에서 종자되어 미토콘드리아 단자 탄산마그네닐 시안화 m-클로로페닐...

이 프로토콜은 세포 생존 가능성을 효율적으로 결정하기 위한 신속하고 높은 처리량, 신뢰할 수 있고 저렴하며 편견없는 분석서를 설명합니다. 이 분석은 세포의 미토콘드리아가 손상되어 다른 분석과 방해가 되는 경우에 특히 유용합니다. 분석은 두 개의 핵 염료로 염색 된 세포의 자동 계수를 사용합니다 - Hoechst 33342 및 프로피듐 요오드.

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

이 방법은 연구원이 미토콘드리아 기능의 독립적으로 세포 생존가능성을 평가할 수 있게 합니다. 그리고 높은 처리량 약물 검사 노력에 순종적이다. 이 기술은 빠르고 정확하며 저렴하며 대부분의 세포 유형에서 미토콘드리아 기능을 손상시키는 화합물 세포 독성을 측정할 수 있습니다.이 프로토콜은 수행하기 쉽습니다. 실험적 정확성과 유효성을 보장하기 위해 약물 제제, 치료 조건 및 세포 밀도에주의를 기울이는 것이 중요합니다. 특히 Gen5 Software에 대한 경험이 거의 없는 연구자의 경우 이미지 수집 및 이미지 분석 단계를 재현하기 어려울 수 있기 때문에 이 방법의 시각적 데모가 중요합니다.원하는 농도에서 관심 있는 화합물의 솔루션을 준비 하 여 시작. 항상 철저하게 소용돌이하여 화합물을 혼합해야합니다. 단일 화합물의 세포 독성을 측정하려면 2배 최종 농도에서 화합물을 준비하십시오.화합물 조합의 세포 독성을 측정하는 경우 4배 의 최종 농도로 준비하십시오. 동일한 양의 용매를 적절한 배지와 혼합하여 용매 전용 컨트롤을 준비합니다. 세포 현탁액의 15 밀리리터 원내 튜브와 알리쿼트 10 마이크로리터로 세포를 수집합니다.트라이판 블루 염색의 경우, 알리쿼트에 0.4%의 트라이판 블루 10마이크로리터를 추가하고 혈전계 또는 셀 카운터를 사용하여 실행 가능한 세포와 실행 불가능한 세포를 계산합니다. 15 밀리리터 튜브의 펠릿 세포는 5 분 동안 200 회 G에서, 다음 흡인 또는 슈퍼 나탄을 배출. 우리는 밀리리터 당 다섯 번째 세포에 3 배 10의 세포 밀도에서 에세이 적절한 매체에서 세포 펠릿을 일시 중단합니다.멀티 채널 파이펫을 사용하여 50 마이크로리터의 셀 서스펜션을 96웰 플레이트의 각 웰에 시드합니다. 단일 화합물 어필의 경우 각 웰에 2X 화합물 용액 50 마이크로리터를 추가하십시오. 용매 제어 우물의 경우 용매를 2배 농도로 포함하는 테스트 매체 15마이크로리터를 추가합니다.조합 된 소의를 위해 각 4X 화합물의 25 마이크로 리터를 각 우물에 추가합니다. 단일 복합 제어 웰의 경우 각각 25마이크로리터를 4X 화합물 용액과 테스트 배지를 추가합니다. DMSO의 최종 농도가 0.5%를 초과하지 않도록 재현성을 보장하고, 우물의 측면을 만지는 파이펫 팁으로 약물을 추가하십시오.다른 위치에 약물을 추가 하는 신중. 이 찌르기는 바람직하게는 플레이트 당 30 분 이상 복용, 매우 빠르게 수행해야합니다. 접시를 부드럽게 탭하여 우물의 내용을 섞어 섭씨 37도와 이산화탄소 5%로 배양합니다.Hoechst 33342및 propidium 요오드로 세포를 염색할 준비가 되면 신선한 10X 염색 용액을 준비하고 각 웰에 10 마이크로리터를 추가합니다. 접시를 부드럽게 누르고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양합니다. 플레이트의 바닥에 모든 세포를 가져오기 위해 4 분 동안 200 배 G에서 플레이트를 원심 분리합니다.그런 다음 젖은 실험실 닦아서 플레이트 바닥을 조심스럽게 닦아 이미징을 방해 할 수있는 파편을 제거하십시오. 원심분리 후 15분 이내에 플레이트를 이미지화합니다. Gen5 소프트웨어를 열고 새 표준 프로토콜을 만들고 절차를 클릭하고 사용할 플레이트 유형을 선택합니다.보통, 96 잘 검은 플라스틱 접시. 다음으로 읽기 메서드를 이미지로 설정하고 Okay를 클릭하고 4배 배율 목표를 가진 DAPI 및 텍사스 레드 필터 세트를 선택합니다. 웰 센터가 이미지화되므로 오프셋이 필요하지 않습니다.DAPI 필터의 경우 LED를 10으로 설정하고 통합 시간을 99로 설정하고 0으로 가져옵니다. 텍사스 레드의 경우 LED를 8로 설정하고 통합 시간을 950으로 설정하고 18로 증가합니다. 옵션을 클릭하여 DAPI 채널에서 자동 포커스가 수행되고 채널 간에 초점을 맞추는 데 오프셋이 없는지 확인합니다.좋아요를 클릭하여 프로토콜을 저장합니다. 이제 새 읽기 단추를 사용하여 이미지를 기록할 수 있습니다. 이미지가 녹화되면 데이터 감소를 클릭하고 이미지 전처리를 선택합니다.DAPI 신호를 기반으로 자동 병합 크기를 사용하여 어두운 배경 빼기로 이미지 전처리를 적용합니다. 텍사스 레드의 경우 채널 1과 동일한 옵션을 사용합니다. 완료되면 확인을 클릭합니다.그런 다음 셀룰러 분석 패널로 이동하여 6, 000 단위의 임계 값, 최소 물체 크기 5 마이크로미터 및 25 마이크로미터의 최대 물체 크기로 변형된 DAPI 신호를 기반으로 핵 마스크를 적용합니다. 전체 이미지를 분석하고 이미지 테두리의 기본 가장자리 개체를 배제하고 터치 오브젝트를 분할합니다. 고급 감지 옵션에서는 롤링 볼 직경을 30 마이크로미터로 설정하고 가장 낮은 픽셀의 5%를 기준으로 배경을 평가합니다.셀 수를 계산된 메트릭에만 유지합니다. 그 후, 죽은 세포를 계산하기 위해 5, 000 단위의 임계 값으로 변형 된 텍사스 적 신호 평균에 기초하여 하위 집단 분석을 수행합니다. 마지막으로 결과 셀 수에 액세스합니다.Hoechst, 프로피듐 요오드로 염색 된 세포의 대표적인 이미지가 여기에 표시됩니다. 세포의 총 수는 합리적으로 높고 죽은 세포의 수보다 큽습니다. 세포 독성 분석의 패널이 트라이판 블루 배제와 비교되었을 때, MTT와 알라마르 블루 분석이 셀룰러 생존가능성을 부정확하게 측정한 것으로 나타났습니다.이러한 미토콘드리아 효소 기반 분석제는 트라이판 블루 제외에 비해 생존가능성이 현저히 낮았다. Hoechst 33342 및 PI를 이용한 이중 염색은 CCP 또는 2-DG 처리 후 트라이판 블루 스테인링과 트라이판 블루 배제 방법에서 가장 작은 중앙 편차와 견고성, 감도 및 일관성의 최상의 조합을 가졌다. Hoechst PI 에세이는 또한 분자 로테네네와 3개의 브로모피라바테를 표적으로 하는 미토콘드리아를 대상으로 처리 후에 세포 생존가능성을 결정하는 데 효과적이었습니다.그것은 백혈병 세포주 패널로 더 검증되었다. 이 세포는 저항 세포에 아주 과민한에서 구역수색하는 로테네감에서 변화했습니다. 분석의 부적절한 성능은 정확도를 손상시킬 수 있습니다.몇 가지 손상된 결과가 여기에 표시됩니다. PI로 과도하게 스태킹하거나 원심분리 단계를 무시하거나 Hoechst 채널의 과다 노출로 인해 최적이 아닌 결과가 발생합니다. 이 프로토콜의 타이밍동안 각 세포주에 대한 염료 농도 및 염색 시간을 최적화해야합니다.또한, 샘플 플레이트에 대한 중심화는 이미징 품질을 보장하기 위해 필요합니다. 암세포에 대한 세포 독성 효과의 화합물을 식별 한 후, 연구원은 그들의 관련 목표를 식별 하기 위해 기계적인 연구와 함께 진행할 수 있습니다. 기존의 MTT assays와 병행하여 이 기술을 가진 소분자 라이브러리를 스크리닝하면 미토콘드리아 기능을 표적으로 하는 분자가 빠르게 식별될 수 있습니다.

an-automated-differential-nuclear-staining-assay-for-accurate

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 동영상은 약물에 민감한 암세포와 건강한 변이에 대한 미토칸의 세포독성 효과를 검출하는 핵 염색 방법을 보여줍니다. 프로피듐 요오드화물 및 Hoechst 염료와 같은 DNA 결합 염료를 사용한 이중 염색은 죽은 세포와 살아있는 세포를 명확하게 구분하여 약물의 세포 독성을 평가하는 데 도움이 됩니다.

Differential Nuclear Staining Assay: Propidium Iodide 및 Hoechst Double Staining에 의한 미토칸 세포 독성을 측정하기 위한 분석

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

공기에 민감한 티탄 및 바나듐 항암제의 합성 방법은 MTT 분석에 의해 인간의 암 세포주를 향해 자신의 세포 상해 활성의 평가와 함께 설명한다.

MTT의 분석에 의해 합성 및 세포 독성 평가 : 항암 금속 합성물

전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 형광 현미경 및 자동화 된 화상 처리와 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발 된 세포 독성 분석이다. 여기서, 우리는 항 CD20 항체로 처리 림프종 세포가 세포 독성 정량적 분석을 제공하는 인간 전혈에서 실시간 분석 할 수있는 방법을 설명한다.

인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

T-림프구 유사분열은 배반생성 변형을 동반하며, 이에 따라 세포 분열 전에 세포 부피가 커집니다. 여기에서는 세포 직경을 측정할 수 있는 기능이 있는 자동 세포 계수기를 사용하여 T 림프구의 모세포 형성을 정량화하는 방법을 설명합니다.

면역 마약 식별을위한 T 림프구에서 미토 겐 유도 블라스의 신속한 정량

우리의 목표는 암 환자의 피로와 관련 된 미토 콘 드 리아 기능 장애를 평가 하는 실용적인 프로토콜을 개발 했다. 이 혁신적인 프로토콜 임상 사용 관련 표준 정 및 기본적인 실험실 절차에 최적화 되어 있습니다.

암 관련 피로에 미토 콘 드리 아 기능의 역할 평가

시험관 내 미세핵 분석은 유전체 독성 및 세포 독성을 평가하기 위한 잘 확립된 방법이지만 수동 현미경 을 사용하여 분석법을 채점하는 것은 힘들고 주관성 및 득점자 간 가변성으로 고통받고 있습니다. 이 논문은 다중 스펙트럼 화상 진찰 유동 세포측정을 사용하여 분석의 완전 자동화된 버전을 능력을 발휘하기 위하여 개발된 프로토콜을 기술합니다.

다중 스펙트럼 화상 진찰 교류 세포측정을 사용하여 시험관 내 미세핵 분석기를 능력을 발휘하는 자동화된 방법

이 프로토콜은 치료용 항-HER-2 항체가 있는 상태에서 자연 살해 세포 매개 유방암 세포 사멸을 조절하는 화합물을 식별하기 위한 자동화된 이미지 기반 고처리량 기술을 제시합니다.

항체 의존성 세포 독성 변형 화합물의 식별을 위한 High-content screening assay

소핵(MN) 분석은 DNA 손상을 정량화하기 위한 잘 확립된 검사입니다. 그러나 수동 현미경 또는 특징 기반 이미지 분석과 같은 기존 기술을 사용하여 분석에 점수를 매기는 것은 힘들고 어렵습니다. 이 논문은 이미징 유세포 분석 데이터를 사용하여 MN 분석의 점수를 매기는 인공 지능 모델을 개발하는 방법론을 설명합니다.

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Naive 및 Effector CD8 T 세포의 미토콘드리아 기능 측정

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단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 T 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석

학습하세요 미토칸드리아 기능과 무관하게 세포 생존율을 평가하는 자동화 차등 핵 염색 분석법을. Hoechst 33342와 프로피듐 요오드화물을 사용하여 고속 약물 스크리닝이 가능하며, 다양한 세포 유형에서 화합물의 세포독성을 정확하게 측정합니다.

미토칸 세포 독성의 정확한 측정을 위한 자동화된 차동 핵 염색 분석

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