Name: 살아있는 열에 있는 화상 진찰 내 핵 액틴 막대는 Drosophila 배아를 강조했습니다 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 배우세요 Drosophila 배아에 미세주사를 통해 열 스트레스 하에서 액틴 막대 조립을 연구하는 방법을. 이 기술은 세포 스트레스 반응 메커니즘을 조사하는 데 활용됩니다.

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저자는 소카크 연구소에서 이 기술을 개척하는 데 도움을 준 류류 정과 젠기이 쉬의 작품과 분석을 도운 하산 시데의 작품을 감사하게 인정합니다. 이 연구를 위한 일은 NIH (R01 GM15111)의 보조금에 의해 투자됩니다.

<ol><li>Figard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-mediated+Actin+Stress+Response+is+maladaptive+in+heat-stressed+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cofilin-mediated Actin Stress Response is maladaptive in heat-stressed embryos.</a> Cell Reports. 26 (49), 3493-3501 (2019).</li>
<li>Ashworth, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2Fcofilin+mediates+actin+cytoskeletal+alterations+in+LLC-PK+cells+during+ATP+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">ADF/cofilin mediates actin cytoskeletal alterations in LLC-PK cells during ATP depletion.</a> American Journal of Physiology Renal Physiology. 284 (4), 852-862 (2003).</li>
<li>Vandebrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+analysis+of+rod+composition+and+actin+dynamics+in+inherited+myopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuropathology+and+Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">In vitro analysis of rod composition and actin dynamics in inherited myopathies.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 69 (5), 429-441 (2010).</li>
<li>Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+stimuli+induce+persistent+ADF%2Fcofilin-actin+rods+that+disrupt+distal+neurite+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function.</a> Nature Cell Biology. 2 (9), 628-636 (2000).</li>
<li>Bamburg, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin-actin+rods+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Alzheimer+Research%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin-actin rods in neurodegenerative diseases.</a> Current Alzheimer Research. 7 (3), 241-250 (2010).</li>
<li>Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+dynamics+and+cofilin-actin+rods+in+alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Actin dynamics and cofilin-actin rods in alzheimer disease.</a> Cytoskeleton. 73 (9), 477-497 (2016).</li>
<li>Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+actin-ADF%2Fcofilin+rods+transiently+retards+decline+of+mitochondrial+potential+and+ATP+in+stressed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22AJP%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons.</a> AJP: Cell Physiology. 291 (5), 828-839 (2006).</li>
<li>Munsie, L. N., Desmond, C. R., Truant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+nuclear-cytoplasmic+shuttling+affects+cofilin-actin+rod+formation+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Cofilin nuclear-cytoplasmic shuttling affects cofilin-actin rod formation during stress.</a> Journal of Cell Science. 125 (17), 3977-3988 (2012).</li>
<li>Iida, K., Iida, H., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+induction+of+intranuclear+actin+rods+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Heat shock induction of intranuclear actin rods in cultured mammalian cells.</a> Experimental Cell Research. 165, 207-215 (1986).</li>
<li>Ohta, Y., Nishida, E., Sakai, H., Miyamoto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dephosphorylation+of+cofilin+accompanies+heat+shock-induced+nuclear+accumulation+of+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Dephosphorylation of cofilin accompanies heat shock-induced nuclear accumulation of cofilin.</a> Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16143-16148 (1989).</li>
<li>Iida, K., Matsumoto, S., Yahara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+KKRKK+sequence+is+involved+in+heat+shock-induced+nuclear+translocation+of+the+18-kDa+actin-binding+protein%2C+cofilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">The KKRKK sequence is involved in heat shock-induced nuclear translocation of the 18-kDa actin-binding protein, cofilin.</a> Cell Structure and Function. 17 (1), 39-46 (1992).</li>
<li>Minamide, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+cytoplasmic+cofilin-actin+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of cytoplasmic cofilin-actin rods.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (8), 5450-5460 (2010).</li>
<li>Masurovsky, E. B., Benitez, H. H., Kim, S. U., Murray, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin%2C+development%2C+and+nature+of+intranuclear+rodlets+and+associated+bodies+in+chicken+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Origin, development, and nature of intranuclear rodlets and associated bodies in chicken sympathetic neurons.</a> The Journal of Cell Biology. 44 (7), 172-191 (1970).</li>
<li>Feldman, M. L., Peters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranuclear+rods+and+sheets+in+rat+cochlear+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurocytology%22%5BJournal%5D)">Intranuclear rods and sheets in rat cochlear nucleus.</a> Journal of Neurocytology. 1 (2), 109-127 (1972).</li>
<li>Nishida, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin+is+a+component+of+intranuclear+and+cytoplasmic+actin+rods+induced+in+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cofilin is a component of intranuclear and cytoplasmic actin rods induced in cultured cells.</a> Cell Biology. 84 (8), 5262-5266 (1987).</li>
<li>Ono, S., Abe, H., Nagaoka, R., Obinata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+ADF+and+cofilin+in+intranuclear+actin+rods+of+cultured+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Colocalization of ADF and cofilin in intranuclear actin rods of cultured muscle cells.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 14 (2), 195-204 (1993).</li>
<li>Xue, Z., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Back-to-back+mechanisms+drive+actomyosin+ring+closure+during+Drosophila+embryo+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Back-to-back mechanisms drive actomyosin ring closure during Drosophila embryo cleavage.</a> The Journal of Cell Biology. 215 (3), 335-344 (2016).</li>
<li>Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuf%2C+a+Rab11+effector%2C+maintains+cytokinetic+furrow+integrity+by+promoting+local+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Nuf, a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization.</a> Journal of Cell Biology. 182 (2), 301-313 (2008).</li>
<li>Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Lovander, K. E., Tootle, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pros+and+cons+of+common+actin+labeling+tools+for+visualizing+actin+dynamics+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The pros and cons of common actin labeling tools for visualizing actin dynamics during Drosophila oogenesis.</a> Developmental Biology. 393 (2), 209-226 (2014).</li>
<li>Chen, Q., Nag, S., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formins+filter+modified+actin+subunits+during+processive+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Formins filter modified actin subunits during processive elongation.</a> Journal of Structural Biology. 177 (1), 32-39 (2012).</li>
<li>Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+interference+by+dsRNA+injection+into+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2477(2011).</li>
<li>Juarez, M. T., Patterson, R. A., Li, W., McGinnis, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+wound+assay+and+in+vivo+localization+of+epidermal+wound+response+reporters+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Microinjection wound assay and in vivo localization of epidermal wound response reporters in Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. 81, 50750(2013).</li>
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<li>Mollinari, C., González, Microinjection and transgenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMollinari%2C+C+%22Microinjection+and+Transgenesis%3A+Strategies+and+Protocols%22">Microinjection and Transgenesis: Strategies and Protocols</a>. Cid-Arregui, A., García-Carrancá, A. , Springer. Berlin. 587-603 (1998).</li>
<li>Figard, L., Sokac, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+cell+shape+change+in+living+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Imaging cell shape change in living Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), 2503(2011).</li>
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<li>Powsner, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+temperature+on+the+durations+of+the+developmental+stages+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Zoology%22%5BJournal%5D)">The effects of temperature on the durations of the developmental stages of Drosophila melanogaster.</a> Physiological Zoology. 8 (4), 474-520 (1935).</li>
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</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

이 방법의중요성은 드로소필라 배아21,22, 23,24,25,26, 27에서 미세 주입의 잘 확립 된 프로토콜을 활용하여 ASR 및 동반 액틴 로드 조립에 관한 새로운 연구를 가능하게한다는 것입니다. 살아있는 배아에 G-actinRed를 주입의 주요 장점은 ASR이 다양한 맥락에서 연구 될 수 있다는 것입니다. 향후 연구를 위해, 이러한 맥락은 돌연변이 스크린의 일부로 다른 유전자형의 배아를 주입하거나 산화 스트레스4,<...

이 프로토콜은 유도할 수 없는 액틴 응력 반응(ASR)1을겪고 있는 열 응력 배아에서 핵액틴 봉의 조립을 시각화하기 위해 G-actinRed를 주입하는 방법을 설명합니다. 우리는 배아에서 성기능 장애를 일으키고 생존력을 감소시키는 ASR의 연구를 돕기 위해 이 프로토콜을 개발했으며, 성인 인간 세포 유형은 신부전2,근육 근병증3,알츠하이머 및 헌팅턴병4,5,6,7,8을포함한 병리와 관련이 있다. 이러한 ASR은 열 충격9,10,11,산화 스트레스4,6,감소된 ATP 합성12,비정상적인 헌팅틴 또는 β-아밀로이드 올리고머화4,5,6,7,9,13,14, 15,16을포함한 수많은 세포응력에의해 유도된다. ASR의 특징은 반응하는 세포의 세포질 또는 핵에서 비정상적인 액틴 봉의 조립으로, 이는 작용 단백질, 코필린1,5,6,10의스트레스 유발 과잉 활성화에 의해 구동된다. 안타깝게도 ASR에 대한 주요 지식 격차는 여전히 남아 있습니다. 예를 들어 액틴 로드의 기능은 알려져 있지 않습니다. 우리는 왜 막대가 몇몇 세포 모형의 세포질에서 형성하는지 이해하지 않습니다, 그러나 그 외의 핵. ASR이 스트레스를 받고 있는 세포 또는 배아에 대한 보호또는 적응력이 있는지도 분명하지 않습니다. 마지막으로, 우리는 여전히 Cofilin 하이퍼 활성화 또는 액틴 로드 어셈블리의 기본 상세한 메커니즘을 모른다. 따라서, 이러한 프로토콜은 살아있는 과일 플라이 배아의 고도로 인가가능한 실험 시스템에서 액틴 로드 형성 및 역학을 시각화하여 ASR을 조사하는 신속하고 다재다능한 분석법을 제공한다.
살아있는 Drosophila 배아로 G-actinRed를 마이크로젝트하는 프로토콜은 조직 건물 이벤트 도중17의 일반적인 세포질 액틴 구조물의 역학을 연구하기 위하여 처음에 개발되었습니다. 그 연구 결과에서, 우리는 G-actin적부분이 세포동체증 또는 위화17,18을포함하여 태아의 초기 발달 과정에 부정적인 영향을 미치지 않았다는 것을 것을을 발견했습니다. 그런 다음 프로토콜을 수정하여 ASR1을겪고 있는 열 스트레스 배아에서 액틴 봉의 이미징을 허용하기 위해 배아 처리 및 G-actin적주입을 조정한다. G-actin빨간 주입 외에 다른 방법은 배아에서 액틴을 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 방법은 유트로핀-mCherry, Lifeact, F-로틴-GFP 및 모에신-GFP(19에서 검토됨)와 같은 액틴 결합 단백질의 영역또는 액틴 결합 단백질의도메인에 태그된 형광 단백질(FPs)을 발현하는 데 의존합니다. 그러나, 이러한 FP 프로브를 사용하면 일부 액틴 구조를 안정화하거나 방해할 수 있기 때문에 주의가 필요하며, 모든 액틴구조(20)를동등하게 라벨화하지 않으며, 액틴-GFP의 경우 스트레스 의존일뿐만 아니라 액틴 농도의존도 1인로드 어셈블리의 분석에 문제가 된다. 따라서, G-actinRed는 플라이 배아에서 막대 연구를 선호하는 프로브이며, 배아의 큰 크기는 쉽게 주입할 수 있다.
이 프로토콜의 워크플로우는 단백질, 핵산, 약물 및 형광 지표를 Drosophila 배아21,22,23,24,25,26,27에주입하는 데 사용되어 온 다른 잘 확립된 미세 주입 기술과 유사합니다. 그러나, 여기서 G-actinRed의 미세 주입에 이어, 배아는 ASR 및 핵내 액틴 로드 조립을 유도하기 위해 온화한 열 응력에 노출된다. 파리와 사출 장비에 접근할 수 있는 실험실의 경우, 이 방법은 ASR과 관련하여 특정 연구 라인에 대해 쉽게 구현가능하고 적응할 수 있어야 하며, 여기에는 다른 스트레스 또는 뚜렷한 유전 적 배경의 변조에 의한 유도가 포함됩니다.

<table><tbody><tr><td>아데노신 삼인산 (ATP)</td> <td>Millipore-Sigma</td><td>A23835G</td><td>G 버퍼</td></tr><tr><td>사과 주스, Mott's, 64 fl oz</td><td>Mott's</td><td>014800000344</td><td>사과 주스 플레이트 구성 요소</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>사과 주스 플레이트 구성 요소</td></tr><tr><td>표백제, PureBright 살균, 6.0% 차아염소산나트륨</td><td>KIK International</td><td>059647210020</td><td>배아 제거 칼슘</td></tr><tr><td>염화</td><td>Millipore - 시그마</td><td>C1016500G</td><td>G 완충</td></tr>기 <tr><td>세포 여과기의 구성 요소, 70 &mu; m</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>탈염 배아 수집용</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경, LSM 880 Airyscan Zeiss 0000001994956이 있는 34채널</td><td></td><td></td><td>핵내 액틴 막대 이미징용</td></tr><tr><td>Desiccant</td><td>Drierite</td><td>24001</td><td>배아 건조용</td></tr><tr><td>해부 현미경, Stemi 508 8:1 줌</td><td>Zeiss</td><td>4350649000000</td><td>한천 쐐기에 배아 배열용</td></tr><tr><td>해부 바늘, 5 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>08965A</td><td>한천 쐐기에 배아 배열용</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1725</td><td>G 버퍼</td></tr><tr><td>양면 테이프의 구성 요소, 스카치 퍼머넌트, 0.5 in x 250 in</td><td>3M</td><td>021200010323</td><td>배아 접착제</td></tr><tr><td>배아 수집 케이지</td> 제작용 <td>Genessee Scientific</td><td>59100</td><td>성충 파리 수용 및 배아 수집용</td></tr><tr><td>파인 팁 핀셋, Dumont 핀셋, Style 5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72701D</td><td>한천 쐐기에 배아 배열용</td></tr><tr><td>유리 모세혈관, Borosillicate 유리, 얇은 1mm x 0.75mm</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW1004</td><td>마이크로 니들 용</td></tr><tr><td>할로 카본 오일 27</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H8773100ML</td><td>배아 수분 공급용</td></tr><tr><td>가열 스테이지 인큐베이터</td><td>Zeiss</td><td>4118579020000, 4118609020000, 4118609010000</td><td>컨포칼 이미징</td></tr><tr><td>용 실험실 조직 와이퍼, KimWipes Kimberly-Clark</td><td></td><td>34155</td><td>실험실 조직 와이퍼</td></tr><tr><td>광학 현미경, Invertoskop 40C 역 위상차 현미경, 리퍼브 상품</td><td>Zeiss</td><td>단종된</td><td>주입 현미경</td></tr><tr><td>메틸-4-하이드록시벤조에이</td>트 <td>Millipore-Sigma</td><td>H36471KG</td><td>사과 주스 플레이트의 구성 요소</td></tr><tr><td>마이크로인젝터, FemtoJet4x</td><td>Eppendorf</td><td>5253000025</td><td>마이크로인젝터</td></tr><tr><td>마이크로 로더 팁, epT.I.P.S. 20 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>바늘 조정을 위한 x,y,z 다이얼이 있는 microneedle micromanipulator 및 주입 단계</td><td>Bernard Instruments, Inc (Houston, TX)</td><td>Custom</td><td>micropipette</td></tr><tr><td>puller, Model P-97, Flaming/Brown</td><td>Sutter Instruments</td><td>P97</td><td>마이크로니들을 만들기 위해 모세관 당기기용</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리 24x50-1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td>배아 장착용</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드, 라일락 컬러프로스트, 사전 세척, 25 x 75 x 1mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>22037081</td><td>주입용 배아 장착용</td></tr><tr><td>n-헵탄</td><td>Fisher Scientific</td><td>H3601</td><td>배아 접착제</td></tr><tr><td>대물렌즈 구성 요소, 10x</td><td>Zeiss</td><td>단종</td><td>10x 주사 현미경</td></tr><tr><td>용 대물렌즈대물렌즈, C-Apochromat 40x/1,2 W Kor. 컨</td>포칼 대물렌즈용 FCS <td>Zeiss</td><td>4217679971711</td><td>40x 물 대물렌즈</td></tr><tr><td>, 오일, 물, 실리콘 오일 또는 글리세린 침수용 LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Cor DIC M27(D=0-0.17mm)(D=0.17mm에서 WD=0.57mm)</td>컨포칼 대물렌즈용 <td>Zeiss</td><td>4208529871000</td><td>25x 혼합 이멀젼 대물렌즈</td></tr><tr>, 컨포칼용<td>Plan-Apocrhomat 63x/1.40 Oil DIC f/ELYRA</td><td>Zeiss</td><td>4207829900799</td><td>63x 오일 대물렌즈</td></tr><tr><td>페인트브러시, 로버트 시몬스 익스프레션 E85 포인티드 라운드 사이즈 2</td><td>Daler-Rowney 038372016954</td><td></td><td>배아 이식용</td></tr><tr><td>종이 타월, Kleenex C-fold 종이 타월, 흰색</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td>884266344845 블로팅 셀 스트레이너</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫, 5 3/4 in</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367820A</td><td>배아를 오일로 덮는 데 페</td></tr><tr><td>트리 접시, 유리, 100 x 20 mm</td><td>코닝</td><td>3160102</td><td>습한 배양 챔버용</td></tr><tr><td>페트리 접시, 플라스틱, 60 x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25384092</td><td>사과 주스 플레이트용</td></tr><tr><td>피펫, Eppendorf Reference 0.5-10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>2231000604</td><td>마이크로니들</td></tr><tr><td>피펫 팁 로딩용, xTIP4 250 &mu; L</td><td>Biotix</td><td>63300006</td><td>커버슬립에 배아 접착제를 추가하기 위해</td></tr><tr><td>면도날</td><td>VWR</td><td>55411050</td><td>한천 쐐기, 테이프, 피펫 팁 절단용</td></tr><tr><td>로다민 접합 구형 액틴, 인간 혈소판(비근육; 4x10 &mu; g)</td> <td>세포골격, Inc.</td><td>APHR-A</td><td>G-actin^Red</td></tr><tr><td>Scintillation 바이알, 폴리에틸렌 라이너 및 요소 캡이 있는 20mL 유리 borosillicate</td><td>Fisher Scientific</td><td>033377</td><td>배아 접착제 제조용</td></tr><tr><td>나사 상단 항아리, 16oz</td><td>Nalgene</td><td>000194414195</td><td>배아 건조용</td></tr><tr><td>스테이지 마이크로미터</td><td>전자 현미경 과학</td><td>602104PG</td><td>G-actin 주입 설탕의 부피 보정용</td></tr><tr><td></td><td>Millipore-Sigma</td><td>840971KG</td><td>사과 주스 플레이트의 구성 요소</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T15031KG</td><td>G 버퍼</td></tr><tr><td>효모의 구성 요소, Lesaffre Yeast Corporation 효모, Red Star Active Dry, 32 oz</td><td>Lesaffre Yeast Corporation</td><td>117929157002</td><td>효모 페이스트의 구성 요소</td></tr></tbody></table>

살아있는 열에 있는 화상 진찰 내 핵 액틴 막대는 drosophila 배아를 강조했습니다

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

이 프로토콜의 목적은 열 응력에 따라 살아있는 Drosophila 멜라노가스터 배아에서 조립되는 핵 액틴 막대를 시각화하는 것입니다. 액틴 로드는 신경 퇴행성 질환을 포함한 인간의 병리학과 함께 제공되는 보존되고 유도할 수 없는 액틴 스트레스 반응(ASR)의 특징입니다. 이전에, 우리는 ASR이 태아 발달의 형태 발생 실패 및 감소된 생존에 기여한다는 것을 보여주었습니다. 이 프로토콜은 이미징, 유전학 및 생화학에 매우 순종하는 모델 시스템에서 근본적인 actin 막대 조립 및 ASR 메커니즘의 지속적인 연구를 허용합니다. 배아는 주사를 준비하기 위해 커버슬립에 수집되고 장착됩니다. 로다민-컨쥬게이드 구형 액틴(G-actinRed)은희석되어 마이크로니들로 적재된다. 단일 주사는 각 태아의 중심으로 이루어집니다. 주사 후, 배아는 높은 온도에서 배양되고 핵 내 액틴 막대는 공초점 현미경 검사법에 의해 시각화됩니다. 광표백 후형화 회복(FRAP) 실험은 액틴 봉상에서 수행될 수 있다; 및 세포질에 있는 그밖 액틴이 풍부한 구조물은 또한 심상일 수 있습니다. 우리는 G-actin빨간 내인성 G-actin 같이 중합하고, 그 자체로, 일반적인 배아 발달을 방해하지 않는다는 것을 것을을 발견합니다. 이 프로토콜의 한 가지 제한은 태아에 심각한 부상을 피하기 위해 주입 중에주의를 기울여야한다는 것입니다. 그러나, 연습으로, Drosophila 배아에 G-액틴레드를 주입하는 것은 actin 막대를 시각화하는 빠르고 신뢰할 수있는 방법이며, 쉽게 어떤 유전자형의 파리또는 저산소증과 산화 스트레스를 포함한 다른 세포 스트레스의 도입과 함께 사용할 수 있습니다.

배아 처리의 회로도 워크플로우가 도 1에묘사되고, 일반적인 실험을 위한 시간표는 표 1에제시된다. 좋은 실험 결과에 대한 추정은 주입된 10개의 배아마다, 조회된 배아의 적어도 절반은 올바른 발달 단계에 있을 것이고, 손상되지 않고, 32°C에서 열 응력으로 견고한 ASR을 나타낸다는 것입니다. 이러한 ASR은 도 2A(오른쪽 패널)에서 배아의 대표적인 표면 뷰 이미지에 도시된 바와 같이 핵내 액틴 봉의 조립에 의해 입증될 것이다. 액틴 로드는 핵 내부에 여러 방향(이미징 평면에 평행또는 수직)으로 나타나며 여러 초점 평면을 통해 이미지화될 수 있다. 이에 비해, 18°C에서 배양된 대조군 배아는 액틴로드(도 2A,좌판)를 표시하지 않는다. 막대를 함유하는 퍼센트 핵은 도 2B에서입증된...

이 프로토콜의 목표는 열 응력에 따라 드로소필라 배아및 이미지 내 핵 액틴 로드 어셈블리에 로다민-컨쥬게이드 구형 액틴을 주입하는 것입니다.

살아있는 열에 있는 화상 진찰 내 핵 액틴 막대는 Drosophila 배아를 강조했습니다

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

당사의 프로토콜은 초파리 배아에서 잘 확립된 미세주입 기술을 사용하여 액틴 스트레스 반응 및 이에 수반되는 액틴 막대 조립에 대한 새로운 연구를 가능하게 하기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 돌연변이 스크리닝 또는 다양한 스트레스 조건과 같은 다양한 상황에서 액틴 스트레스 반응을 연구할 수 있다는 것입니다. 이전에 이 기술을 한 번도 수행한 적이 없는 개인은 배아를 다루고 미세 주입을 수행하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.사용자가 편안함을 느낄 때까지 이러한 단계를 연습하는 것이 좋습니다. 이 방법을 시각적으로 시연하는 것은 매우 중요한데, 그 이유는 미세주입 및 이미징을 위한 배아 처리, 배치 및 장착 단계가 서면 지침만으로는 명확하지 않을 수 있기 때문입니다. 원고 지침에 따라 배아 채취 컵과 사과 주스 한천 플레이트를 준비합니다.가장 넉넉한 알을 낳는 것을 촉진하려면 실험 이틀 전에 파리가 있는 수집 컵을 설치하십시오. 각 수집 컵에 최소 100마리의 암컷과 50마리의 수컷 파리를 추가한 다음 사과 주스 접시로 덮습니다. G-actin red의 작업 용액을 준비하고 마이크로 바늘에 넣을 때까지 얼음에 보관하십시오.파리가 섭씨 30도의 효모 페이스트와 함께 사과 주스 플레이트에 18분 동안 배아를 낳도록 합니다. 파리가 낳는 동안 면도날로 4x1cm 직사각형의 사과 주스 한천을 잘라 25 x 75mm 유리 슬라이드에 놓습니다. 컬렉션에서 플레이트를 수확하고 플레이트에 새로운 표백제 용액을 붓고 1분 동안 휘젓는 방식으로 배아를 디코리온화합니다.페인트 브러시의 강모를 증류수로 적신 다음 이를 사용하여 수집 바구니에서 탈수 및 세척된 배아를 유리 슬라이드의 준비된 사과 주스 한천 쐐기로 옮깁니다. 한 쌍의 가는 끝 핀셋 또는 해부 바늘을 사용하여 직사각형 한천 쐐기의 긴 축을 따라 직선으로 10개의 배아를 배열합니다. 배아의 등쪽이 연구자를 향하도록 배아를 머리에서 꼬리까지 배열합니다.면도날로 P200 피펫 팁 끝을 반 cm 잘라 배아 접착제에 담그십시오. 24 x 50mm 직사각형 커버슬립의 긴 가장자리를 따라 5mm 영역을 넉넉하게 코팅하고 접착제 면이 위로 향하게 건조시킵니다. 배아 접착제가 마르면 커버슬립 접착제 쪽을 아래로 향하게 하여 한천에 정렬된 배아 열 위에 부드럽게 놓고 커버슬립 가장자리와 배아 줄 사이에 2-3mm의 공간을 남겨둡니다.배아가 위를 향하도록 커버슬립을 뒤집습니다. 그

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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자동 고함량 분석기를 사용하여 수행된 살아있는 세포 현미경 검사법을 위한 Drosophila 배아 준비 및 미세 주입

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Rho1 매개 악토미오신 수축성의 광유전학적 억제와 초파리 배아의 상피 긴장 측정

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형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

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