Name: 화학적으로 정의된 조건하에서 인간 유도된 다능성 줄기 세포에서 성숙한 신장 분피의 유도된 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 배우세요 화학적으로 정의된 배지와 세포외기질 단백질을 사용하여 인간 유도된 다능성 줄기 세포에서 성숙한 신장 분피를 26일 내에 90% 이상의 효율로 유도 분화하는 방법을. 이 기술은 신장 독성 테스트와 질병 모델링에 활용됩니다.

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이 작품은 듀크 대학의 공학의 프랫 학교, 듀크 의과 대학의 신장학 부문, 듀크 대학의 의과 대학에서 의자 연구 상, 그리고 S.M버로우 웰스 웰컴 펀드 PDEP 경력 전환 애드 호크 상에 의해 지원되었다. M.B국립과학재단의 대학원 연구 펠로우십 프로그램의 지원을 받았습니다. 우리는 DU11 줄기 세포주를 아낌없이 우리에게 제공 버삭 연구소, 일시적으로 우리의 그룹과 자신의 조직 문화 시설을 공유 듀크 대학의 Varghese 연구소에 감사드립니다. 이 출판물은 그녀의 60번째 생일을 축하하기 위해 매사추세츠 공과 대학의 노바티스 화학 교수 인 로라 L. 키슬링 교수에게 헌정되었습니다.

1. 시약 준비
<ol><li>희석 해동 5x hiPS 세포 배양 매체 (CCM) hiPS 세포 배양 기저 배지에 보충 hiPS CCM의 1 x 용액을 얻을 수 있습니다. 참고 : 냉동 5x hiPS CCM 보충은 하룻밤 동안 이상적으로 4 ° C에서 느린 해동 과정이 필요합니다. 1x hiPS CCM의 알리쿼트(Aliquots)는 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있다.</li>
	<li>hiPS 세포 배양을 위한 지하 막(BM) 매트릭스 1코팅 판의 준비: 4°C에서 얼음에 하룻밤 을 해동 BM 매트릭스 1. 해동되면 제조업체에서 제안한 적절한 희석 요인으로 알리쿼트를 준비하십시오. 참고: 일반적으로 알리쿼트(aliquots)는 50mL 원추형 튜브에서 25mL의 콜드 DMEM/F12에서 후속 희석을 위해 준비된 다음 BM 매트릭스 1을 완전히 용해하고 잔류 결정의 형성을 피하기 위해 철저한 혼합을 한다.</li>
	<li>BM 매트릭스 1용액의 1mL를 6웰 플레이트의 각 웰에 전송하고 37°C에서 1-2h 또는 4°C에서 파라핀 필름으로 싸서. BM 매트릭스 1-코팅 플레이트는 최대 2주 동안 4°C로 저장할 수 있다.</li>
	<li>지하 멤브레인 (BM) 매트릭스 2 - 코팅 플레이트의 준비 : 5 μg / mL의 최종 농도를 준비하기 위해 9 mL 멸균 증류수에 BM 매트릭스 2의 적절한 양을 희석. BM 매트릭스 2 용액의 700 μL을 12웰 플레이트의 각 웰에 추가하고 4°C에서 2시간 또는 하룻밤 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.</li>
	<li>BMP7, 액티빈 A 및 VEGF 각각 100 μg/mL 스톡 솔루션을 준비하십시오: BMP7을 0.1%(wt/vol) BSA를 함유한 멸균 증류수의 BMP7을 재구성하고 0.1%(wt/vol)를 함유한 멸균 PBS에서 별도로 액티빈 A 및 VEGF를 재구성한다. 빈번한 동결 해동 주기를 피하기 위해 각 스톡 솔루션에서 100 μL 알리코트100을 준비하고 -20°C에 최대 6개월 간 보관하십시오.</li>
	<li>멸균 증류수 3.079mL에서 Y27632 10 mg을 용해하여 Y27632의 10m M 스톡 솔루션을 준비한다. 육수에서 100 μL을 알리쿼트하고 -20°C에 보관하여 최대 6개월 동안 보관합니다.</li>
	<li>멸균 DMSO 143.4 μL에 CHIR99021 2 mg을 녹여 30mM 스톡 솔루션을 준비합니다. 5 μL 알리쿼트를 준비하고 최대 1개월 동안 -20°C에 보관하십시오(또는 제조업체의 권장 사항에 따라).</li>
	<li>3.33mL 멸균 DMSO에 10 mg의 올트랜스 망티노산을 녹입니다. 500 μL 알리쿼트를 준비하고 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.</li>
</ol>2. 문화미디어 준비
<ol><li>상응하는 스톡 용액을 100 ng/mL 액티빈 A, 3 μM CHIR99021, 10μM Y27632 및 1x B27 혈청 프리 보충제로 보충하여 중피 분화 매체를 대미염 보충제와 함께 준비한다. 참고: 중피 분화 배지는 분화 단계 전에 실험의 규모에 적합한 부피로 신선하게 준비되어야 합니다(일반적으로 50mL의 배지는 2개의 12웰 플레이트에 적합).</li>
	<li>글루타민 보충제를 사용하여 DMEM/F12의 최종 농도 100 ng/mL BMP7, 3 μM CHIR99021 및 1x B27 세럼 프리 보충제로 해당 스톡 솔루션을 재구성하여 중간 중질 균분화 매체를 준비한다. 참고: 필요한 경우, 배지는 1% (vol/vol) 페니실린-연쇄절제술로 보충될 수 있습니다. 글루타민 보충제로 DMEM/F12를 사용하여 매체의 부피를 조절합니다. 이 매체는 큰 배치로 제조 될 수있다; 그러나, 반복동결 해동 주기를 피하기 위해 작은 알리쿼트(예: 50mL 원판 튜브에 45mL)에 저장하는 것이 좋습니다. 이 매체는 최대 3개월 동안 -20°C에 보관할 수 있으며 사용하기 전에 하룻밤 사이에 4°C에서 해동될 수 있다.</li>
	<li>최종 농도 100 ng/mL BMP7, 100 ng/mL 활성제 A, 50 ng/mL VEGF, 3 μM CHIR99021, 1x B27 혈청 프리 보충제, 및 0.1M μ-트랜스노비드 비약제 및 0.1M μ-트랜스노비드 비약 제비 로 FM2의 비료 를 보충하여 포도시테 유도 매체를 준비한다. 빛으로부터 매체를 보호하십시오(예: 호일 용지로 용기를 래핑하여). 참고:이 매체는 큰 배치로 제조하고 최대 3 개월 동안 -20 °C에서 어둠 속에서 저장할 수 있습니다. 냉동 알리쿼트사용 전에 4°C에서 하룻밤 동안 해동해야 합니다.</li>
	<li>DMEM/F12에 10%(vol/vol) 열 비활성화 FBS를 추가하고 멸균 조건하에서 필터를 추가하여 25mL의 트립신 중화 솔루션을 준비하십시오.</li>
	<li>줄기 세포 유래 podocytes의 후분화 유지를 위해 제조업체의 지침에 따라 기저 배지에 보충제를 추가하여 podocyte 유지 보수 매체로 완전한 매체를 준비하고 최대 2 주 동안 4 °C에 보관하십시오.</li>
</ol>3. hiPS 세포 배양 배지를 이용한 피더 프리 hiPS 세포 배양
<ol><li>BM 매트릭스 1의 잔류 용액을 미리 코팅된 플레이트에서 흡기하고 1~2mL의 데운 DMEM/F12로 우물을 3회 세척한다.</li>
	<li>흡인은 hiPS 세포에서 hiPS CCM을 보냈고 데운 DMEM/F12로 세포를 3번 헹구었습니다. 1mL의 웜 셀 분리 용액을 추가하고 37°C에서 1분 동안 배양하여 세포를 해리시화합니다. 조직 배양 현미경하에서 세포의 육안 검사를 수행하고 세포 식민지의 가장자리가 둥글게 나타나는지 확인 한 다음 세포 분리 용액을 신속하게 흡인합니다 (세포 식민지가 여전히 접시에 부착되도록하십시오.하지만 느슨하게). DMEM/F12로 세포를 한 번 부드럽게 헹구어 세포 분리 용액을 제거합니다.</li>
	<li>세포 분리 용액으로 처리된 hiPS 세포(6웰 플레이트의 각 웰)에 hiPS CCM 3mL을 추가합니다. 셀 리프터를 사용하여 콜로니를 긁어 내고, 느슨하게 부착된 세포를 제거하기 위해 부드럽게 피펫 셀 서스펜션을 위아래로 피펫합니다. 모든 세포가 수확되도록 플레이트를 철저히 세척하십시오. 참고: 셀의 과도한 전단을 피하기 위해 5mL 파이펫을 사용하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>새로운 BM 매트릭스 1-코팅 6웰 플레이트의 각 웰에 세포 현탁액의 0.5 mL을 잘 당 2 mL의 hiPS CCM을 전달한다. 피겨-8 패션으로 플레이트를 이동하여 우물 내의 세포 식민지를 분배하고 5% CO2 인큐베이터에서 37°C에서 배양한다. 세포가 분화 또는 분화 실험 (약 70 % 수렴)에 사용될 준비가 될 때까지 매일 배지를 새로 고칩니다. 참고: iPSC의 일상적인 패싱을 위한 이상적인 식민지 크기는 hiPS CCM(ROCK 억제제 제외)를 사용하여 피더 없는 조건 하에서 200-500 μm 사이입니다. 세포가 해리 효소 또는 완충제로 치료하는 동안 개별화되는 경우, hiPS CCM은 세포 생존가능성을 향상시키기 위해 ROCK 억제제(예를 들어, 10 μM Y27632)로 보충될 수 있다.</li>
</ol>4. hiPS 세포의 분화 는 중피 세포로 분화 (일 0-2)
<ol><li>hiPS 세포 배양은 기하급수적 성장 단계(월화 후 배양 의 약 4 일 이내에 약 70 % 수렴)에 있는 동안, 식민지의 가장자리 안팎에서 자발적으로 분화 된 세포의 존재를 시각적으로 검사합니다. 필요한 경우 차균적으로 차별화 영역을 긁어냅니다.</li>
	<li>hiPS 세포에서 흡인 hiPS CCM을 흡인하고 따뜻한 DMEM/F12로 세포를 3번 헹구세요. 37°C에서 10분 동안 효소가 없는 세포 해리 버퍼1mL로 세포를 배양하고 현미경하에서 해리를 확인한다. 상이한 hiPS 세포주 간의 내재된 차이로 인해 세포 해리 버퍼의 실제 잠복기 시간은 지정된 세포주를 위해 결정되어야 합니다.</li>
	<li>느슨하게 부착된 세포를 빼내고 셀 현탁액을 15mL 원추형 튜브로 옮기고, 그 다음에 는 hiPS 세포를 개별화하기 위해 여러 번 피펫팅하여 셀 리프터로 우물을 부드럽게 긁어냅니다.<ol>
<li>실온에서 290 x g에서 5 분 동안 따뜻한 DMEM / F12 및 원심 분리기로 셀 서스펜션을 15 mL 볼륨으로 가져옵니다.</li>
		<li>잔류 BM 매트릭스 1 및 해리 버퍼 구성 요소를 제거하기 위해 상체를 부드럽게 흡인하고 따뜻한 DMEM / F12로 세포를 다시 분리하여 원심 분리의 또 다른 라운드를 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>상술한 바와 같이 중피 유도 배지의 1mL에서 슈퍼네티산을 흡인하고 세포를 재중단한다. 혈류계 또는 쿨터 카운터를 사용하여 세포의 총 수를 계산하여 1 x 105 세포/mL의 농도를 달성하는 데 필요한 중피 분화 배지의 적절한 부피를 결정한다.</li>
	<li>BM 매트릭스 2 코팅 플레이트에서 ECM 용액을 흡입하고 따뜻한 DMEM / F12로 플레이트를 두 번 헹구십시오. 몇 번 피펫팅하여 hiPS 셀 서스펜션을 부드럽게 섞습니다. BM 매트릭스 2 코팅 12웰 플레이트의 각 웰에 셀 서스펜션의 1mL를 전송한 다음 부드럽게 판을 흔들어 세포를 더 균등하게 분배합니다.</li>
	<li>5% CO2 인큐베이터에서 플레이트를 37°C로 배양합니다. 다음 날 중피 유도 매체를 새로 고칩니다. 참고: 2일 후에, hiPS 세포 유래 중피 세포는 중간 중증 유도를 위한 준비가 될 것입니다.</li>
</ol>5. hiPS 세포 유래 중피 세포의 분화중간경(일 2-16일)
<ol><li>차별화 프로토콜의 2일째에, 중피 유도 배지를 흡수시키고, 중간 중질도 유도 배지당 1mL로 보충한다.</li>
	<li>신진 대사 활성 세포에 대한 성장 인자와 작은 분자의 정확한 임계 값을 유지하기 위해 매일 매체를 새로 고침. 미디어 영양소의 상당한 세포 성장 및 급속한 고갈이 있는 경우(매체의 황변에 의해 표시), 중간 중구 분화 배지의 부피는 12웰 플레이트의 웰당 1.3mL로 증가될 수 있다.</li>
	<li>중간 중피 세포를 얻기 위해 추가 14 일 동안 배양 세포. 16일째에, 이 세포는 나중에 사용하기 위해 냉동 보존될 수 있습니다.</li>
</ol>6. hiPS 세포 유래 중간 중질 세포의 분화(일 16 받는 사람 21)
<ol><li>37°C에서 3분 동안 0.05% 트립신-EDTA의 웰당 0.5mL의 세포 배양으로 중간 중음근 세포를 헹구는 다. 세포가 해리되기 시작되었는지 확인하기 위해 육안으로 검사를 수행합니다.</li>
	<li>셀 리프터와 파이펫을 사용하여 세포를 긁어 1,000 μL 파이펫 팁을 사용하여 개별화된 (또는 작은 덩어리) 세포를 얻습니다. 참고: 이 단계에서, 응집된 세포가 프로토콜의 타임라인 내에서 말단분화 표현형을 획득하지 못할 수 있으므로 세포가 완전히 해리되는지 확인합니다.</li>
	<li>트립신의 활동을 중지 트립신 중화 솔루션의 우물 당 약 2 mL을 추가합니다.</li>
	<li>세포를 50mL 원상 튜브로 옮기고 DMEM/F12를 사용하여 최대 50mL의 부피를 가져온 다음 실온에서 201 x g에서 5분 동안 셀 서스펜션을 원심분리합니다.</li>
	<li>초신자를 흡인하고 포도세포 유도 배지에서 세포를 재중단한다. 최적의 결과를 얻으려면 약 100,000개의 세포/웰의 최종 시드 밀도를 12개의 웰 플레이트로 보장하십시오. BM 매트릭스 2 코팅 플레이트에 셀 서스펜션을 추가하고 부드럽게 세포를 더 균등하게 분배하는 데 도움이 접시를 흔들어.</li>
	<li>세포를 37°C 및 5%CO2에서 배양하고 21일까지 세포세포를 얻기 위해 최대 5일 동안 매일 배지를 새로 고칩니다. 참고: 결과 hiPS 세포 유래 podocytes는 podocyte 유지 보수 매체를 가진 완전한 매체를 사용하여 2-4 추가 주 동안 배양에서 유지될 수 있습니다. 일단 podocyte 유지 보수 매체에 일단, 세포는 격일로 공급될 수 있고 후속 연구 또는 다운스트림 분석에 사용될 수 있습니다.</li>
</ol>

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<li>Becker, G. J., Hewitson, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+chronic+kidney+disease%3A+useful+but+not+perfect%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology+Dialysis+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Animal models of chronic kidney disease: useful but not perfect.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 28, 2432-2438 (2013).</li>
</ol>

S.M. 만능 줄기 세포에서 신장 podocytes의 생성을 위한 방법에 대한 특허 출원에 대한 저자입니다 (미국 특허 출원 14/950859). 나머지 저자는 경쟁 적인 관심사가 없다고 선언합니다.

이 보고에서는, 우리는 hiPS 세포에서 신장 구엽 포도세포의 생성을 위한 프로토콜을 기술합니다. hiPS 세포 유래 podocytes는 성숙한 신장 podocyte 표현형(13)과관련된 형태학적 및 분자 특징을 나타낸다. 이전 간행물에서, 우리는 hiPS 세포 유래 podocytes가 구체 미생물 혈관 내피 세포와 결합할 때 신장 구체 구체세포의 구조 및 선택적 여과 기능을 모방할 수 있음을 보여주었다8,11.
다음 중요한 단계는 이 프로토콜을 조정하는 데 관심이 있는 연구원들에 의해 고려되어야 합니다. 첫째, 중피 세포의 유도를 위해 라미닌 코팅 플레이트에 hiPS 세포의 파종은 중요한 단계이다. 100,000 개의 세포 / 우물의 파종 밀도가 권장되는 반면, 연구원은 연구에 사용되는 줄기 세포주의 복제 속도에 따라 초기 세포 파...

인간 만능 줄기 세포 배양의 발전은 연구자들이인체내거의 모든 세포 유형을 얻기 위해 설계될 수 있는 생물학적 물질의 재생 가능하고 확장 가능한 근원을 제공함으로써 재생 의학, 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 혁명을 일으킬 태세입니다. 이 전략은 그렇지 않으면 얻기 어려울 전문적이고 기능적인 세포 유형을 유도하는 데 특히 유용합니다. 인간 유도만능 줄기(hiPS) 세포2,3,4,5는 그들의 체세포 기원 과 개인화된 의학을 대변하는 잠재력 때문에 특히 매력적이다. 그러나, hiPS 세포로부터 다른 세포 혈통을 유도하는 방법을 개발하는 방법은 낮은 효율과 비특이적 세대의 이종세포 집단을 유도하는 제대로 정의된 배양 조건의 빈번한 사용으로 인해 여전히 어려운 남아 있다6,7.
여기에 제시된 화학적으로 정의된 조건하에서 특이성과 고효율을 가진 hiPS 세포로부터 성숙한 신장 세포세포의 유래를 위한 방법이 있다. 세포 마이크로환경 내의 다중 인자의 역할을 고려하여 세포 배양 배지에 제시된 수용성 인자의 최적화뿐만 아니라 세포외 매트릭스 성분 또는 접착제 기판과 같은 불용성 인자의 최적화를 포함하는 줄기 세포 분화 전략이 개발되었다. 포도세포 발달 및 기능에서 인테그린 신호의 중요성을 감안할 때, 세포 표면에 있는 인테그린 수용체의 발현은 처음에 검토되었다. β1 인테그린은 hiPS 세포뿐만 아니라 중질 및 중간 중질 세포를 포함하는 유도체에서도 높게 발현되었다8,9,10. 후속 실험은 β1 통합에 결합하는 리간드(라미닌 511 또는 라미닌 511-E8 단편 포함)가 아래에 설명된 수용성 유도성 매체와 함께 사용될 때 hiPS 세포의 접착 및 분화를 podocytes로 분리하는 것을 확인하였다.
세포 계보 약정의 유도는 먼저 액티빈 A, CHIR99021 및 Y27632 바위 억제제가 함유된 배지의 존재 속에서 라미닌 코팅 표면에 배양된 hiPS 세포가 초기 메소더름 마커 HAND1, 거스로이드 및 brachry81,brachry81을발현하는 세포로 분화할 수 있음을 확인함으로써 시작되었다. 14일 동안 중피세포를 골형태유전학단백질 7(BMP-7) 및 CHIR99021로 보충한 중간 중질세포를 치료하여 신장-전구 세포 마커 윌름의 종양 1(WT1), 홀수 건너뛰관련 단백질 1(OSR1) 및 12유전자(OSR1) 및 12유전자(OSR1)및12유전자(OSR1) 및12유전자를발간하였다. 성숙한 신장 구체 포도세포를 도출하기 위하여는, 중간 중구 세포는 BMP-7, 액티빈 A, 혈관 내피 성장 인자(VEGF),모든-트랜스 망막산 및 CHIR99021로 구성된 새로운 매체로 4-5 일 동안 처리되었다. 유동 세포및 면역스테인링은 생성된 세포의 >90%가 성숙한 신장 분두세포의 분자, 형태학적 및 기능적 특성을나타낸다는 것을 확인하기 위해 사용되었다8,11,13. 이러한 특성은 기본 및 이차 발 프로세스의 개발을 포함한다; SYNPO, PODXL, MAF, EFNB28을 포함하는 포도세포 계보 특이적 유전자의 발현및 포도신, 네프린 및 WT114,15,16을포함하는 단백질의 발현. 또한, hiPS 세포 유래 podocytes는 상용 배지8,11을 사용하여 시험관 내에서 최대 4주 동안 배양하여 유지될 수 있어 다운스트림 실험의 타이밍에 추가적인 유연성을 제공한다는 것을 발견하였다. hiPS-podocytes의 순도를 결정하는 데 사용되는 유동 세포측정패널에 대한 자세한 내용은 이전간행물(11)을참조하십시오.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DU11 human iPS cells</td><td></td><td></td><td>DU11(Duke University clone #11) iPS 세포주는 Duke University iPSC Core Facility에서 생성되었으며 Duke University의 Bursac Lab에서 제공했습니다. 이 라인은 마이코플라스마에 대해 테스트되었으며 2019년 7월 우리 실험실에서 마지막으로 핵형 분석을 받았으며 핵형 정상으로 판명되었습니다.</td></tr><tr><td>Growth Factors and Media Supplements</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-trans retinoic acid (500 mg)</td><td>72262</td><td>Stem Cell Technologies</td><td></td></tr><tr><td>B27 무혈청 보충제</td><td>17504044</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>04-0004</td><td>Stemgent</td><td>로트간 변동을 보일 수 있음</td></tr><tr><td>CultureBoost-R</td><td>이 포함된 완전한 배지 키트4Z0-500-R</td><td>세포 시스템</td><td>Podocyte 유지 관리 매체</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>12634028</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제가 포함된 DMEM/F12</td><td>10565042</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>글루타민 보충제가 포함된 DMEM/F12</td></tr><tr><td>열 비활성화 FBS</td><td>10082147</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Human activin A</td><td>PHC9564</td><td>Thermo/Life 기술</td><td></td></tr><tr><td>Human BMP7</td><td>PHC9544</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Human VEGF</td><td>PHC9394</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 매체</td><td>05850</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>hiPS 세포 배양 매체 (CCM)</td></tr><tr><td>Penicillin&ndash; 스트렙토마이신, 액상 (100&times;)</td><td>15140-163</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Y27632 ROCK 억제제</td><td>1254</td><td>Tocris</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&ndash; 및 Alexa Fluor 594&ndash; 접합 2차 항체</td><td>A32744; A32754입니다. A-11076; A32790</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Brachyury(T)</td><td>ab20680</td><td>Abcam</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin</td><td>GP-N2</td><td>Progen</td><td></td></tr><tr><td>OCT4</td><td>AF1759</td><td>R& D Systems</td><td></td></tr><tr><td>PAX2</td><td>71-6000</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>WT1</td><td>MAB4234</td><td>Millipore</td><td></td></tr><tr><td>ECM Molecules</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment</td><td>N-892012</td><td>Iwai North America</td><td>Basement membrane (BM) matrix 2</td></tr><tr><td>Matrigel hESC 인증 매트릭스, 5-mL 바이알</td><td>354277</td><td>BD 생명과학</td><td>기저막(BM) 매트릭스 1. 로트-투-로트(lot-to-lot) 변이</td></tr><tr><td><강>효소 및 기타 시약</강한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아큐타아</td><td>A1110501</td>제를 나타낼 수 <td>있음: Thermo/Life Technologies</td><td>세포 박리 용액</td></tr><tr><td>BSA</td><td>A9418</td><td>시그마-알드리치</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>D2438</td><td>시그마-알드리치</td><td>DMSO는 독성이 있습니다. 화학 물질 안전 후드에서 취급해야 합니다</td></tr><tr><td>효소가 없는 세포 해리 완충액, Hank' s 균형 잡힌 염</td><td>13150016</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 용액, 70%(vol/vol), 생명공학 등급</td><td>97065-058</td><td>VWR</td><td>에탄올은 가연성 및 독성이 있습니다</td></tr><tr>.<td>FBS</td><td>431097</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde(PFA)</td><td>28906</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>PFA는 장갑, 실험복, 보안경을 포함한 적절한 개인 보호 장비와 함께 화학 흄 후드에서 취급해야 합니다. 흡입 및 피부 접촉을 피하십시오.</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>14190-250</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>멸균 증류수</td><td>15230162</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>97062-208</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA, 0.05%</td><td>25300-120</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>흡입 피펫, 개별 포장</td><td>29442-462</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-15R 원심분리기</td><td>B99516</td><td>Beckman Coulter</td><td></td></tr><tr><td>원추형 원심분리기 튜브, 15 mL</td><td></td><td>352097 Corning</td><td></td></tr><tr><td>원추형 원심분리기 튜브, 50 mL</td><td>352098</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>극저온 상자</td><td>3395465</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>냉동 보관용 부분 표본</td></tr><tr><td>EVOS M7000</td><td>AMF7000</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>고정 및 염색된 iPS 세포 및 그 유도체의 이미지를 획득하는 데 사용되는 형광 현미경</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>100503-092</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 인큐베이터</td><td>51030403</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>iPS 세포 및 그 유도체</td></tr><tr><td>의 일상적인 배양 및 유지 관리AxioCam 503 카메라가 장착된 거꾸로 된 Zeiss Axio Observer</td><td>491916-0001-000(현미경) ; 426558-0000-000(카메라)</td><td>Carl Zeiss Microscopy</td><td>podocyte 분화의 각 단계에서 살아있는 iPS 세포 및 그 유도체의 위상차 이미지를 획득하는 데 사용</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark 니트릴 장갑</td><td>40101-346</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes, 대형</td><td>21905-049</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes, 소형</td><td>21905-026</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>P10 정밀 배리어 피펫 팁</td><td>P1096-FR</td><td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P100 배리어 피펫 팁</td><td>P1125</td><td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P1000 배리어 피펫 팁</td><td>P1126</td><td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P20 배리어 피펫 팁</td><td>P1121</td><td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>P200 배리어 피펫 팁</td><td>P1122</td><td>Denville Scientific</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫, 10mL, 개별 포장</td><td>356551</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫, 25mL, 개별 포장</td><td>356525</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Serological 피펫, 5mL, Corning</td><td></td><td></td>Steriflip <td>356543</td> 개별 포장</tr><tr><td>, 0.22 &mu; m, PES</td><td>SCGP00525</td><td>EMD Millipore</td><td></td></tr><tr><td>멸균 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>1138W14</td><td>Thomas Scientific</td><td>성장 인자 분취용</td></tr><tr><td>조직 배양&ndash; </td><td></td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture&ndash 353043 처리된 12웰 플레이트; 처리 된 6 웰 플레이트</td><td>353046</td><td>Corning</td><td></td></tr><tr><td>VWR 화이트 techuni 랩 코트</td><td>10141-342</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>와이드 베벨 셀 리프터</td><td>3008</td><td>코닝</td><td></td></tr></tbody></table>

화학적으로 정의된 조건하에서 인간 유도된 다능성 줄기 세포에서 성숙한 신장 분피의 유도된 분화

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

신장 병은 전 세계 인구의 10% 이상에 영향을 미치고 연방 지출에 수십억 달러의 비용이 듭니다. 신장 질환과 최종 말기 신부전의 가장 심각한 형태는 종종 신장의 여과 장벽을 형성하기 위해 내피 세포 및 구체 지하실 막과 함께 작동하는 고도로 전문화 된 상피 세포인 구체 포도세포의 손상에 의해 발생합니다. 신장 의학의 발전은 1 차 조직의 제한된 가용성과 podocytes와 같은 기능적인 인간 신장 세포의 파생을 위한 강력한 방법의 부족에 의해 방해되었습니다. 줄기 세포와 같은 재생 가능한 소스에서 podocytes를 파생하는 기능은 인간 신장 발달 및 질병의 기계장치의 현재 이해를 발전시키는 것을 도울 뿐만 아니라 치료 발견을 위한 새로운 공구를 제공할 수 있었습니다. 이 프로토콜의 목표는 고효율 및 특이성을 가진 인간 유도만능 줄기 (hiPS) 세포로부터 성숙하고 미토성 후 podocytes를 추출하고 화학적으로 정의된 조건하에서 도출하는 방법을 개발하는 것이었습니다. 이 방법에 의해 생성된 hiPS 세포 유래 podocytes는 혈통 특이적 마커(nephrin, podocin 및 Wilm의 종양 1 포함)를 발현하고 성숙하고 기능적인 podocytes와 관련된 특수형태특성(1차 및 이차 발 프로세스 포함)을 나타낸다. 흥미롭게도, 이러한 특수 특징은 특히 현장에서 널리 사용되는 불멸의 podocyte 세포주에서 결석하며, 이는 본원에 기술된 프로토콜이 기존의 podocyte 세포주보다 발달적으로 더 성숙한 표현형을 갖는 인간 신장 podocytes를 생산한다는 것을 시사한다.

이 프로토콜의 목표는 성숙한 인간 podocytes가 화학적으로 정의된 조건의 밑에 hiPS 세포에서 파생될 수 있다는 것을 보여주기 위한 것이었습니다. 본 원고에 제시된 데이터는 처음 테스트된 DU11 hiPS세포주(17)를사용하여 생성되었으며, 마이코플라즈마가 없는 것으로 나타났다. 염색체 분석도 수행되었고, 세포는 karyo전상정상인 것으로 나타났다. 미분화 DU11 hiPS 세포를 시작으로, 본 보고서에 설명된 분화전략(도 1)은먼저 브라추리를 발현하는 중피 세포로 줄기세포(도2A)를분화하기 위해 채택되었다(도 1B 및 도 2B),PAX2 양성 중형 메소더름세포(도 2C), 및 마지막으로 성숙신장발구체(도 2C)로 분화한 후, 신장 발구체(그림<strong class=...

여기에 제시된 화학적으로 정의된 프로토콜은 유도된 다능성 줄기 세포로부터 의하여 > 유전 조작 또는 하위 집단 선택과 무관하게 유도된 다능성 줄기 세포로부터 의하여 유래한다. 이 프로토콜은 26 일 이내에 원하는 세포 유형을 생성하고 신장 독성 검사 및 질병 모델링에 유용 할 수 있습니다.

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

줄기세포를 기능적 신장 세포로 분화시키기 위한 프로토콜은 여전히 파악하기 어렵습니다. 이 방법은 특이성과 효율성을 가진 성숙한 포도세포를 생산하여 신장 질환 메커니즘을 연구하기 위한 새로운 도구를 제공합니다. 이 방법은 화학적으로 정의된 조성을 가진 세포 배양 배지 및 세포외 기질 단백질을 사용하여 하위 집단 선택 또는 유전자 조작을 사용하지 않고 고순도의 인간 iPS 세포 유래 포도세포를 생성합니다.신장 질환 환자를 위한 치료 옵션은 제한적입니다. 이 방법은 질병 메커니즘을 모델링하고 이해하는 데 영향을 미치며, 이는 새로운 바이오마커 및 치료제의 개발을 촉진할 수 있습니다. 피더가 없는 인간 iPSC 배양을 설정하려면 사전 코팅된 플레이트에서 기저막 매트릭스 1의 잔류 용액을 흡인하고 가열된 기저 배지 웰당 1-2밀리리터로 웰을 세 번 세척합니다.인간 iPSC 배양에서 사용한 세포 배양 배지를 흡인하고 가온된 배지로 세포를 세 번 헹굽니다. 각 웰에 1ml의 따뜻한 세포 분리 용액을 첨가하여 섭씨 37도에서 1분 동안 배양합니다. 조직 배양 현미경으로 둥근 세포 집락 가장자리를 확인한 후 세포 박리 용액을 빠르게 흡입하고 세포 배양 배지로 세포를 부드럽게 헹굽니다.인간 유도 만능 줄기 세포에 3ml의 인간 iPSC 배양 배지를 추가하고 세포 리프터를 사용하여 집락을 긁어냅니다. 세포 현탁액을 부드럽게 피펫팅하여 느슨하게 부착된 세포를 제거하고 플레이트를 철저히 세척하여 모든 세포를 수확할 수 있도록 합니다. 500마이크로리터의 세포를 웰당 2밀리리터의 인간 유도 만능 줄기세포를 포함하는 1개의 코팅된 6웰 플레이트를 새로운 기저막 매트릭스의 각 웰로 옮기고 플레이트를 8자 모양으로 이동하여 웰 내의 세포 군체를 고르게 분포시킵니다.플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 놓고 세포가 약 70%의 포화도에 도달할 때까지 배지를 매일 새로 고칩니다. 필요한 경우, 웰에서 상층액을 흡인하기 전에 분화 영역을 무균으로 긁어냅니다. 웰을 세 번 세척한 후 시연된 대로 세포를 해리하고 생성된 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 당깁니다.피펫팅으로 혼합한 후 따뜻한 배지로 튜브의 최종 부피를 15ml로 가져오고 원심분리로 세포를 수집합니다. 두 번째 원심분리를 위해 펠릿을 새로운 배지에 재현탁하고 계수를 위해 1ml의 중배엽 유도 배지에 세포를 재현탁합니다. 계수 후, 세포를 중배엽 유도 매체 농도의 밀리리터당 5번째 세포의 1배인 10으로 재현탁하고 기저막 매트릭스 2 코팅된 플레이트에서 세포외 매트릭스 용액을 흡인합니다.따뜻한 배지로 플레이트를 두 번 헹구고 인간 유도 만능 줄기 세포 현탁액을 부드러운 피펫팅과 혼합합니다. 기저막 매트릭스 2 코팅된 12웰 플레이트의 각 웰에 1ml의 세포를 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포를 더 고르게 분포시킵니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.분화 2-15일째에 중배엽 유도 배지를 웰당 1ml의 중간 중배엽 유도 배지로 교체합니다. 배지의 황변에 의해 표시된 바와 같이 상당한 세포 성장과 영양소의 급격한 고갈이 관찰되는 경우, 중간 중배엽 분화 배지의 부피는 웰당 1.3ml로 증가할 수 있습니다. 배양 16일째에 중간 중배엽 세포를 따뜻한 배지로 헹구고 웰당 500마이크로리터의 0.05% 트립신 EDTA를 섭씨 37도에서 3분 동안 배양합니다.세포가 해리되기 시작하면 세포 리프터로 세포를 긁어내고 피펫팅으로 세포를 부드럽게 혼합합니다. 웰당 약 2ml의 트립신 중화 용액으로 반응을 중지하고 세포를 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 배지로 부피를 최대 50 밀리리터까지 가져오고 원심 분리로 세포를 수집합니다.펠릿을 포도사이트 유도 배지에 1회 10으로 매체 농도 1밀리리터당 5번째 세포에 재현탁시키고 세포를 기저막 매트릭스 2 코팅된 플레이트에 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포가 더 고르게 분포되도록 하고 최대 5일 동안 세포를 인큐베이터에 넣습니다. 입증된 배양 전략을 사용하여 줄기세포는 먼저 Brachyury를 발현하는 중배엽 세포로 분화한 다음 PAX2 양성 중간 중배엽 세포로 분화하고 최종적으로 성숙한 신장 사구체 podocytes로 분화할 수 있습니다.줄기세포 유래 포도세포는 WT1과 계통 식별 마커 nephrin에 대해 양성으로 염색되었습니다. 흥미롭게도, 네프린의 세포 내 국소화는 주로 포도사이트 발 돌기와 세포 세포질 내에서 이루어지며, 이는 성숙한 포도세포 표현형과 일치합니다. 12-well plate의 well당 5번째 세포에서 권장 밀도 1 x 10을 크게 초과하는 밀도로 seed된 세포는 프로토콜의 표준 타임라인 내에서 성숙한 podocytes의 예상되는 형태학적 표현형이 부족한 대규모 세포 클러스터를 생성합니다.그러나 이 프로토콜에서 권장하는 밀도로 파종하면 원하는 형태를 가진 세포를 배양할 수 있습니다. 세포 분리를 위해 적절한 기저막 단백질을 사용하고 중배엽 및 포도사이트 유도를 위해 올바른 세포 파종 밀도를 유지하는 것이 좋습니다. 이 포도사이트 분화 방법은 장기 칩, 미세유체 시스템 또는 3D 바이오프린팅 기술과 통합되어 약물 스크리닝 및 신독성 테스트를 위한 인간 신장의 기능 모델을 개발할 수 있습니다.적절한 세포 배양 모델의 부족은 신장 질환 메커니즘을 이해하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 이 프로토콜은 연구자에게 질병 모델링을 위한 환자 유래 podocytes의 무궁무진한 소스를 제공합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는 정의된 화학적 조건 하에서 세포 분화를 통해 유도 만능 줄기 세포에서 인간 신장 포도세포를 추출하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 생성된 포도사이트(podocytes)는 신독성 검사 및 질병 모델링에 사용할 수 있습니다.

유도 만능 줄기 세포에서 인간 신장 Podocytes 도출: 줄기 세포에서 성숙한 Kidney Podocytes 의 지시된 분화를 위한 절차

여기서 우리는 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)로부터 신장 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 두 주 이내에 신장 오가노이드를 생성합니다. 생성된 신장 오가노이드는 병렬 약물 테스트 접근법을 위해 대규모 스피너 플라스크 또는 다중 웰 자기 교반 플레이트에서 배양될 수 있다.

인간 다능성 줄기 세포로부터 신장 오가노이드를 생성하는 단순화된 방법

여기에 제시된 것은 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 된 유 전적으로 일치하는 상피 및 혈관 내피 세포를 통합하여 신장 사구체 여과 장벽의 구조와 기능을 요약하는 개인화 된 장기 온 칩 시스템을 설계하는 프로토콜입니다. 이 생체 공학 시스템은 신장 정밀 의학 및 관련 응용 분야를 발전시킬 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포로 설계된 Isogenic 신장 사구체 칩

이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)로의 에피솜 재프로그래밍과 후속 족세포로의 분화를 통해 진피 섬유아세포에서 환자 특이적 족세포를 생성하는 2단계 프로토콜을 설명합니다.

피부 생검에서 환자 유래 Podocytes의 생성

이 프로토콜은 현탁 배양 조건을 사용하여 유도만능줄기세포(iPSC)에서 신장 오가노이드를 생산하기 위한 포괄적이고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 연구의 주요 초점은 초기 세포 밀도와 WNT 작용제 농도의 결정에 있어 신장 오가노이드 연구에 관심이 있는 연구자에게 도움이 됩니다.

유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells)에서 현탁액의 신장 오가노이드 생성

우리는 endoderm 및 dopaminergic (DA) 뉴런에 전파하고 배아 줄기 세포의 분화에 대한 효과적인 3D 플랫폼으로 microencapsulation 기술을 최적화했습니다. 또한 이식하는 동안 호스트에서 세포의 면역 - 절연을위한 기회를 제공합니다. 이 플랫폼은 다른 세포 유형에 적응하실 수 있습니다.

다른 Lineages로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 전파 및 차별 화를위한 3D 플랫폼으로서 알긴산의 Microcapsule

이 프로토콜의 개발, 확대, hESCs에와 유도 만능에서 파생 된 NK 세포의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)유래 한 근생 선조는 근 이영양증을 치료하는 세포 치료 전략에 대한 유망한 후보입니다. 이 프로토콜은 급성 및 만성 근육 재생의 마우스 모델에서 iPSC 유래 메소포아세포(근육 선조의 일종)의 이식 및 분화를 평가하는 데 필요한 이식 및 기능측정을 설명합니다.

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

선물이 파생 된 세포 (PDCs) 비타민 C (비타민 C) 및 1, 25-dihydroxy 비타민 D [1,25-(OH)2D3]에 의해 유도 된의 mRNA 식 biomarkers를 조사 하는 프로토콜. 또한, 우리는 osteocytes, chondrocytes, adipocytes에 차별 하는 Pdc의 능력을 평가 합니다.

인간의 치경과 파생 셀 Osteogenic 활동에 비타민 D의 효과에서 중간 엽 줄기 세포의 분리

프로토콜은 차별화에 생체 재료의 강성 효과 확산의 조사와 펩타이드, 없이 투입 했다 다양 한 뻣 뻣 함과 폴 리 비닐 알코올-co-itaconic 산 hydrogels를 준비 하 여 줄기 세포입니다. hydrogels 강성 가교에 의해 통제 되었다.

폴 리 비닐 알코올-Co-Itaconic 산 Hydrogels 이종 없는 조건 하에서 다양 한 강성에 인간의 Pluripotent 줄기 세포 문화

배우세요 화학적으로 정의된 배지와 세포외기질 단백질을 사용하여 인간 유도된 다능성 줄기 세포에서 성숙한 신장 분피를 26일 내에 90% 이상의 효율로 유도 분화하는 방법을. 이 기술은 신장 독성 테스트와 질병 모델링에 활용됩니다.

화학적으로 정의된 조건하에서 인간 유도된 다능성 줄기 세포에서 성숙한 신장 분피의 유도된 분화

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