화학적으로 정의된 조건하에서 인간 유도된 다능성 줄기 세포에서 성숙한 신장 분피의 유도된 분화

줄기세포를 기능적 신장 세포로 분화시키기 위한 프로토콜은 여전히 파악하기 어렵습니다. 이 방법은 특이성과 효율성을 가진 성숙한 포도세포를 생산하여 신장 질환 메커니즘을 연구하기 위한 새로운 도구를 제공합니다. 이 방법은 화학적으로 정의된 조성을 가진 세포 배양 배지 및 세포외 기질 단백질을 사용하여 하위 집단 선택 또는 유전자 조작을 사용하지 않고 고순도의 인간 iPS 세포 유래 포도세포를 생성합니다.

신장 질환 환자를 위한 치료 옵션은 제한적입니다. 이 방법은 질병 메커니즘을 모델링하고 이해하는 데 영향을 미치며, 이는 새로운 바이오마커 및 치료제의 개발을 촉진할 수 있습니다. 피더가 없는 인간 iPSC 배양을 설정하려면 사전 코팅된 플레이트에서 기저막 매트릭스 1의 잔류 용액을 흡인하고 가열된 기저 배지 웰당 1-2밀리리터로 웰을 세 번 세척합니다.

인간 iPSC 배양에서 사용한 세포 배양 배지를 흡인하고 가온된 배지로 세포를 세 번 헹굽니다. 각 웰에 1ml의 따뜻한 세포 분리 용액을 첨가하여 섭씨 37도에서 1분 동안 배양합니다. 조직 배양 현미경으로 둥근 세포 집락 가장자리를 확인한 후 세포 박리 용액을 빠르게 흡입하고 세포 배양 배지로 세포를 부드럽게 헹굽니다.

인간 유도 만능 줄기 세포에 3ml의 인간 iPSC 배양 배지를 추가하고 세포 리프터를 사용하여 집락을 긁어냅니다. 세포 현탁액을 부드럽게 피펫팅하여 느슨하게 부착된 세포를 제거하고 플레이트를 철저히 세척하여 모든 세포를 수확할 수 있도록 합니다. 500마이크로리터의 세포를 웰당 2밀리리터의 인간 유도 만능 줄기세포를 포함하는 1개의 코팅된 6웰 플레이트를 새로운 기저막 매트릭스의 각 웰로 옮기고 플레이트를 8자 모양으로 이동하여 웰 내의 세포 군체를 고르게 분포시킵니다.

플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 놓고 세포가 약 70%의 포화도에 도달할 때까지 배지를 매일 새로 고칩니다. 필요한 경우, 웰에서 상층액을 흡인하기 전에 분화 영역을 무균으로 긁어냅니다. 웰을 세 번 세척한 후 시연된 대로 세포를 해리하고 생성된 세포 현탁액을 15ml 원추형 튜브로 당깁니다.

피펫팅으로 혼합한 후 따뜻한 배지로 튜브의 최종 부피를 15ml로 가져오고 원심분리로 세포를 수집합니다. 두 번째 원심분리를 위해 펠릿을 새로운 배지에 재현탁하고 계수를 위해 1ml의 중배엽 유도 배지에 세포를 재현탁합니다. 계수 후, 세포를 중배엽 유도 매체 농도의 밀리리터당 5번째 세포의 1배인 10으로 재현탁하고 기저막 매트릭스 2 코팅된 플레이트에서 세포외 매트릭스 용액을 흡인합니다.

따뜻한 배지로 플레이트를 두 번 헹구고 인간 유도 만능 줄기 세포 현탁액을 부드러운 피펫팅과 혼합합니다. 기저막 매트릭스 2 코팅된 12웰 플레이트의 각 웰에 1ml의 세포를 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포를 더 고르게 분포시킵니다. 그런 다음 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣습니다.

분화 2-15일째에 중배엽 유도 배지를 웰당 1ml의 중간 중배엽 유도 배지로 교체합니다. 배지의 황변에 의해 표시된 바와 같이 상당한 세포 성장과 영양소의 급격한 고갈이 관찰되는 경우, 중간 중배엽 분화 배지의 부피는 웰당 1.3ml로 증가할 수 있습니다. 배양 16일째에 중간 중배엽 세포를 따뜻한 배지로 헹구고 웰당 500마이크로리터의 0.05% 트립신 EDTA를 섭씨 37도에서 3분 동안 배양합니다.

세포가 해리되기 시작하면 세포 리프터로 세포를 긁어내고 피펫팅으로 세포를 부드럽게 혼합합니다. 웰당 약 2ml의 트립신 중화 용액으로 반응을 중지하고 세포를 50ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 배지로 부피를 최대 50 밀리리터까지 가져오고 원심 분리로 세포를 수집합니다.

펠릿을 포도사이트 유도 배지에 1회 10으로 매체 농도 1밀리리터당 5번째 세포에 재현탁시키고 세포를 기저막 매트릭스 2 코팅된 플레이트에 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 부드럽게 흔들어 세포가 더 고르게 분포되도록 하고 최대 5일 동안 세포를 인큐베이터에 넣습니다. 입증된 배양 전략을 사용하여 줄기세포는 먼저 Brachyury를 발현하는 중배엽 세포로 분화한 다음 PAX2 양성 중간 중배엽 세포로 분화하고 최종적으로 성숙한 신장 사구체 podocytes로 분화할 수 있습니다.

줄기세포 유래 포도세포는 WT1과 계통 식별 마커 nephrin에 대해 양성으로 염색되었습니다. 흥미롭게도, 네프린의 세포 내 국소화는 주로 포도사이트 발 돌기와 세포 세포질 내에서 이루어지며, 이는 성숙한 포도세포 표현형과 일치합니다. 12-well plate의 well당 5번째 세포에서 권장 밀도 1 x 10을 크게 초과하는 밀도로 seed된 세포는 프로토콜의 표준 타임라인 내에서 성숙한 podocytes의 예상되는 형태학적 표현형이 부족한 대규모 세포 클러스터를 생성합니다.

그러나 이 프로토콜에서 권장하는 밀도로 파종하면 원하는 형태를 가진 세포를 배양할 수 있습니다. 세포 분리를 위해 적절한 기저막 단백질을 사용하고 중배엽 및 포도사이트 유도를 위해 올바른 세포 파종 밀도를 유지하는 것이 좋습니다. 이 포도사이트 분화 방법은 장기 칩, 미세유체 시스템 또는 3D 바이오프린팅 기술과 통합되어 약물 스크리닝 및 신독성 테스트를 위한 인간 신장의 기능 모델을 개발할 수 있습니다.

적절한 세포 배양 모델의 부족은 신장 질환 메커니즘을 이해하는 데 어려움을 겪고 있습니다. 이 프로토콜은 연구자에게 질병 모델링을 위한 환자 유래 podocytes의 무궁무진한 소스를 제공합니다.