Name: 야누스 베이스 나노튜브와 줄기 세포 접착을 위한 섬유네틴을 갖춘 바이오미메틱 나노 매트릭스의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 학습하세요 야누스 베이스 나노튜브와 섬유네틴을 이용한 바이오미메틱 나노 매트릭스 조립 방법을. 인간 중간엽 줄기세포의 접착을 촉진하여 조직 공학 및 골절 치료에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 NIH (보조금 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF 경력 상 (1653702) 및 코네티컷 대학에 의해 재정적으로 지원됩니다.

1. JBNT의 합성
참고 : JBNT 단조량은 이전에 출판 된 대로 준비되었다11.
<ol><li>화합물 A1의 합성<ol>
<li>톨루엔 25mL및 N-디메틸포르미드의 2.5mL에서 8.50g의 시아노아세이스틱산과 9.80 g의 에틸카르바메이트를 함유한 용액을 준비한다. 4.90mL의 인산화를 드롭와이즈로 넣습니다. 그런 다음 혼합물을 70 °C로 가열하고 1.5 시간 동안 계속 저어줍니다.</li>
		<li>반응 혼합물을 실온으로 식히고 얼음 물 100g을 붓습니다. 에틸 아세테이트(3 x 250mL)로 수성 층을 추출하고 100mL의 소금물로 세척합니다. 무수성 나트륨 황산나트륨 위에 유기층을 건조시키고, 진공 상태에서 휘발성을 걸러내고 증발하여 옅은 노란색 고체를 얻습니다.</li>
		<li>노란 고체내지 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피(3% 메탄올/디클로로메탄)를 주체하여 백색 분말로서 화합물 A1의 15.61g을 산출한다.</li>
	</ol></li>
	<li>화합물 A2의 합성<ol>
<li>화합물 A1 3.12 g와 탄산칼륨 2.75 g를 N, N-디메틸포르마미드의 50mL에 섞는다. 실온에서 2시간 동안 저어줍니다.</li>
		<li>반응 현탁액에 2.6mL의 탄소 이황화를 추가합니다. 4 시간 동안 교반 유지합니다.</li>
		<li>0°C에서 반응 혼합물에 절대 에탄올을 넣습니다. 노란 침전을 걸러내고 디틸 에테르로 씻습니다. 밤새 진공 상태에서 건조하여 6.18g의 화합물 A2를 옅은 노란색 고체로 산출합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>화합물 A3의 합성<ol>
<li>아세토닐릴의 15mL에 메틸 요오드 2.7mL를 추가합니다. 또한, 물/아세토나이트(7:3비율)의 A2~80mL 6.18g을 첨가하여 화합물 A2용액을 별도로 준비한다. 용액을 모두 섞고 실온에서 30분 간 저어줍니다.</li>
		<li>반응 혼합물을 95°C로 가열하고 3시간 동안 계속 저어줍니다.</li>
		<li>반응 혼합물을 실온으로 냉각한 다음 진공 상태에서 휘발성을 증발시보세요.</li>
		<li>에틸 아세테이트 100mL로 잔류물 3배 추출하고 소금물로 씻어내다. 무수성 나트륨 황산나트륨 위에 유기층을 건조시키고, 진공 하에서 휘발성을 피하여 노란색 고체를 얻습니다.</li>
		<li>노란색 고체내지 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피(30% 에틸 아세테이트/헥산)를 주체하여 A3의 4.52 g를 연황고체로서 산출한다.</li>
	</ol></li>
	<li>화합물 A4의 합성<ol>
<li>에탄올 20mL에 925 μL의 아를라민을 추가하여 아일라민 용액을 준비하십시오. 이 용액을 절대 에탄올 75mL에 3.14 g의 A3를 추가하여 30분 이상 제조한 화합물 A3용액에 드롭와이즈를 추가합니다. 그런 다음 반응 혼합물을 16 시간 동안 역류로 가열합니다.</li>
		<li>반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 휘발성을 증발하여 노란색 고체를 줍니다.</li>
		<li>노란색 고체내지 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피(50% 에틸 아세테이트/헥산~메탄올/디클로로메탄)를 주체하여 백색 결정으로서 1.80g의 화합물 A4를 산출한다.</li>
	</ol></li>
	<li>화합물 A5의 합성<ol>
<li>2.05 g의 과니디늄 염산염과 7.8 mL의 나트륨 에탄올 (에탄올21 wt%)을 절대 에탄올 14mL에 넣습니다. 혼합물을 45°C로 15분 동안 가열합니다.</li>
		<li>불용성 물질을 걸러내고 40mL 절대 에탄올에 A4 2.70 g을 첨가하여 제조한 화합물 A4의 용액에 직접 여과물을 첨가한다. 반응 혼합물을 16시간 동안 역류에 가열합니다.</li>
		<li>오프 화이트 고체로서 화합물 A5의 2.65 g를 얻기 위해 밖으로 침전물을 필터링합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>화합물 A6의 합성<ol>
<li>24.9mL의 트리에틸라민을 1분 이상 테트라하이드로푸란 120mL에 화합물 A5 2.11g과 4-디메틸아미노피리딘 1.10g을 첨가하여 얻은 슬러리 혼합물에 천천히 첨가한다. 실온에서 2분 간 저어줍니다.</li>
		<li>디테르트부틸 디카보네이트 20.7mL을 반응 혼합물에 드롭와이즈로 넣고 40시간 동안 실온에서 계속 저어줍니다.</li>
		<li>20mL의 물을 추가하여 반응을 담금질합니다. 진공 상태에서 휘발성을 증발시다.</li>
		<li>에틸 아세테이트 500mL로 적점 잔류물을 추출합니다. 이어서 250mL의 물, 구연산 75mL, 200mL의 물, 포화나트륨 200mL, 소금물 200mL로 세척한다. 무수성 나트륨 황산나트륨 위로 유기층을 건조시키고, 진공 상태에서 휘발성을 걸러내고 증발하여 빨간색/주황색 고체를 줍니다.</li>
		<li>고체내지 실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피(0-20% 에틸 아세테이트/헥산)를 주체하여 백색 폼으로서 화합물 A6 3.87g을 산출한다.</li>
	</ol></li>
	<li>화합물 A7의 합성<ol>
<li>N-메틸모포린 N-Oxide(물 50w.%, 1.64mL)를 아세톤/물(8:1, 58.5mL)에 화합물 A6(2.93g)의 용액에 넣고 실온에서 5분 간 저어줍니다.</li>
		<li>3분 동안 혼합물에 오스뮴 테트라옥사이드(4% 수성 용액)를 드롭방향으로 넣고 실온에서 24시간 동안 계속 저어줍니다.</li>
		<li>용액이 무색으로 변할 때까지 1.0M 수성 나트륨 황산염으로 반응을 담금질합니다. 진공 상태에서 휘발성을 제거하여 물에 백색 슬러리를 생성합니다. 350mL의 디클로로메탄으로 잔류물을 추출한 다음 150mL의 물로 씻어내고 150mL의 소금물로 세척합니다.</li>
		<li>무수성 나트륨 황산나트륨위에 유기층을 건조시키고, 진공 하에서 휘발성을 증발시키고, 백색 고체로서 2.45g의 화합물 A7을 산출한다.</li>
	</ol></li>
	<li>화합물 A8의 합성<ol>
<li>디클로로메탄/물(6:1, 35mL)의 35mL에 1.36 g의 화합물 A7을 혼합하고 42시간 동안 실온에서 저어줍니다.</li>
		<li>불용성 물질을 걸러내고 진공 상태에서 여과물을 농축합니다. 디클로로메탄 250mL로 생성된 잔류물을 추출한 다음 100mL의 물과 100mL의 소금물로 세척합니다. 무수성 나트륨 황산나트륨 위에 유기층을 건조시키고, 진공 상태에서 휘발성을 걸러내고 증발하여 원유 제품을 제공합니다.</li>
		<li>실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피(5-40% 에틸 아세테이트/헥산, 5% 메탄올/디클로로메탄)를 통해 1.08g의 화합물 A8을 산출한다.</li>
	</ol></li>
	<li>화합물 A9의 합성<ol>
<li>1,2-디클로로에탄의 15mL에서 830 mg의 화합물 A8용액을 준비한다. 6-벤질옥시카보라미노-2-L-아미노 헥사노산 트리메틸실릴 에틸 에스테르(649.5 mg)와 N,N-이소프로틸레틸레틸라민(591 μL)을 1,2-디클로로탄 24mL로 첨가하고 15분 이상 15분 동안 15분 이상 저어줍니다.</li>
		<li>360.3 mg의 트리아세톡시보라이드 나트륨을 용액에 넣고 실온에서 24시간 동안 계속 저어줍니다.</li>
		<li>반응 혼합물을 6mL의 물로 담금질합니다. 디클로로메탄 200mL로 반응 혼합물 3x를 추출하고 물 속 100mL의 구연산 200mL, 200mL의 물, 포화 나트륨 중탄산염 200mL, 염수 200mL로 세척한다. 무수성 나트륨 황산나트륨 위에 유기층을 건조시키고, 진공 상태에서 휘발성을 걸러내고 증발하여 원유 제품을 얻습니다.</li>
		<li>실리카 젤 플래시 컬럼 크로마토그래피(5-30% 에틸 아세테이트/헥산)에 원유 제품을 적용하여 885 mg 화합물 A9를 산출합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>JBNT 단조량합성<ol>
<li>화합물 A9(0.54g)을 94% 트리플루오로아세트산/티오아니솔 용액의 10mL에 0.54g을 녹이고 실온에서 72시간 동안 저어줍니다.</li>
		<li>다이틸 에테르(80mL)를 반응 혼합물에 넣고 침전물원심을 줄입니다. 초월제를 함유한 맑은 트리플루오로아세트산을 붓고 168.6 mg의 원유 JBNT 단조량을 산출하기 위해 다이틸 에테르와 메탄올로 백색 침전물을 씻어낸다(보충파일 1).</li>
		<li>역상 컬럼을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 원유 JBNT 단조량을 정화합니다. 격리 프로그램은 다음과 같습니다: 용매 A: 100% 물; 용매 B: 100% 아세토닐트릴; 용매 C: pH=1 HCl 용액; 유량: 3mL/min(표 1참조).</li>
		<li>약 7.2 분에 가장 큰 피크를 수집합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. JBNT/FN용 제작
<ol><li>1 mg/mL JBNT 수성 용액 의 80 μL을 1 mg/mL FN 수성 용액 및 파이펫의 40 μL에 여러 번 추가합니다.</li>
	<li>약 10s에 대한 파이펫팅 후 흰색 고체 서스펜션의 존재를 확인합니다. 참고: NM(보충파일 2)의자체 조립 프로세스를 캡처하기 위해 비디오가 촬영되었습니다.</li>
</ol>3. lyophilized 표본의 관찰
참고: 이 단계는 JBNT및 FN으로 만든 NM의 비계 구조를 보여주기 위해 수행됩니다.
<ol><li>Lyophilized 물질 관찰을 위한 FN, JBNT 및 FN/JBNT NM 솔루션을 준비합니다. FN의 100 μg/mL의 10 μL을 40 μL의 증류수로 희석하여 FN의 20 μg/mL 용액을 만듭니다.</li>
	<li>DI 수의 45 μL에 1 mg/mL JBNT의 5 μL을 희석하여 JBNT의 100 mg/mL 용액을 준비하십시오.</li>
	<li>100 μg/mL FN의 10 μL과 5 μL의 1mg/mL을 DI 수의 35 μL에 JBNT의 1 mg/mL의 5μL을 혼합하여 NM 용액을 형성합니다.</li>
	<li>FN, JBNT 솔루션 및 NM 솔루션으로 96웰의 투명한 둥근 하단 마이크로 플레이트의 3개의 웰을 각각 코팅합니다. 각 웰은 용액의 50 μL을 받습니다.</li>
	<li>아래에 설명된 바와 같이, NM의 비계 구조를 시각화하기 위해, lyophilization을 수행한다.<ol>
<li>하룻밤 -80 °C에서 접시를 동결.</li>
		<li>lyophilized 기기와 진공 펌프를 켭니다.</li>
		<li>냉각 버튼을 눌러 시스템의 온도를 -50 °C로 줄입니다.</li>
		<li>냉동 판을 lyophilized 악기에 넣고 악기의 모든 구멍을 닫습니다.</li>
		<li>시작 버튼을 클릭하여 시스템 압력을 0.9 mbar로 줄입니다.</li>
		<li>4시간 후, 대격자 버튼을 누르고 밸브를 열어 기압에 대한 시스템 압력을 증가시다.</li>
		<li>lyophilized 악기에서 접시를 꺼내.</li>
		<li>현미경을 사용하여 FN, JBNT 및 생성된 자체 조립 NM을 관찰합니다. 재료에 대한 카메라와 함께 여러 사진을 촬영합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 흡수 스펙트럼 측정
참고: FN 및 JBNT에 대한 스펙트럼 변경을 사용하여 자체 조립된 JBNT/FN NM12를제시합니다.
<ol><li>100 μg/mL FN의 30 μL을 증류수 15μL과 5 μL의 1 mg/mL JBNT와 혼합하여 JBNT/FN NM 솔루션을 준비합니다. 백색 고체 서스펜션은 용액을 여러 번 피펫팅한 후 볼 수 있습니다. 참고: 용액의 JBNT와 FN의 최종 농도는 각각 100 μg/mL 및 60 μg/mL입니다. NM 솔루션에 사용된 것과 동일한 농도의 JBNT 및 FN 솔루션도 제어 솔루션으로 제조되었다.</li>
	<li>JBNT 제어 솔루션을 준비하기 위해 증류수 45μL로 JBNT 1 mg/mL의 5 μL을 희석합니다.</li>
	<li>FN 제어 솔루션을 준비하기 위해 증류수 20μL로 100 μg/mL FN의 30 μL을 희석시하십시오.</li>
	<li>NM의 조립을 특성화하기 위해 분광계(재료 표 참조)를 사용하여 FN, JBNT 및 JBNT/FN NM 솔루션의UV-vis 흡수 분광 분광을 측정합니다.<ol>
<li>UV-Vis 버튼을 클릭합니다. 분광계의 시험 표면을 청소하고 증류수 2 μL을 떨어 뜨립니다. 190-850 nm에서 빈 것으로 측정합니다.</li>
		<li>분광계의 테스트 표면을 청소하고 FN 용액의 2 μL을 떨어 뜨립니다. FN 용액의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 190nm에서 850nm로 측정합니다.</li>
		<li>분광계의 테스트 표면을 청소하고 JBNT 용액의 2 μL을 떨어 뜨립니다. JBNT 용액의 흡수 스펙트럼을 190nm에서 850nm로 측정합니다.</li>
		<li>분광계의 테스트 표면을 청소하고 JBNT /FN NM 용액의 2 μL을 떨어 뜨립니다. 190nm에서 850nm까지 JBNT/FN NM 용액의 흡수 스펙트럼을 측정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 전송 전자 현미경 검사법 (TEM)에 대한 JBNT / FN NM의 준비
<ol><li>기본 플라즈마 클리너로 음수 염색하기 전에 여러 그리드를 청소하십시오(재료 표참조).</li>
	<li>두 개의 서로 다른 프로세스에 따라 시편에 대한 음의 염색을 수행합니다.<ol>
<li>JBNT의 1 mg/mL의 3 μL과 분리된 그리드에 JBNT/FN NM 용액 3μL을 떨어뜨리고 2분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 0.5 % uranyl 아세테이트 (UA) 용액의 100 μL로 각 그리드를 헹구는 다. 필터 용지로 과도한 용액을 배출하고 그리드를 건조시다.</li>
		<li>JBNT/FN NM 용액 9μL을 2.0% UA 용액3μL과 여러 번 섞는다. 그리드의 혼합 솔루션을 파이펫하고 2 분 동안 그리드에 보관하십시오. 필터 용지를 사용하여 그리드에서 혼합 된 솔루션을 제거하고 실온에서 그리드를 건조시다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마지막으로, JBNT, JBNT/FN NM에 대한 표본을 5.2.1단계로 염색하고, JBNT/FN NM에 대한 표본을 TEM으로 5.2.2단계로 염색했다.</li>
</ol>6. 체외 생물학적 기능 분석
<ol><li>각각 8웰 챔버 슬라이드의 한 웰에 음수 컨트롤 (NC, PBS), JBNT, FN 및 JBNT / FN NM 솔루션의 200 μL을 추가합니다.</li>
	<li>8웰 챔버 커버글래스를 구균 밑의 소재를 코팅하기 위해 리오필화 된 악기로 얼립니다. 동결 건조 프로토콜은 3.5 단계와 동일합니다.</li>
	<li>그런 다음 10,000 개의 세포 / 우물 hMSC (Passage 3)를 우물에 넣고 5 % CO2로37 °C에서 24 시간 동안 배양하십시오.</li>
	<li>인큐베이션 후, 우물에서 세포 배양 배지를 피펫하고 1x PBS 용액으로 배양을 헹구는다.</li>
	<li>고정 용액의 100 μL을 셀과 잘 추가하고 5 분 동안 둡니다. 1x PBS로 부드럽게 헹구십시오.</li>
	<li>1% 트리톤-X 100 ~ 0.1%를 희석합니다. 세포와 잘 각 웰에 0.1 % 트리톤 X 100의 100 μL을 추가하고 10 분 동안 둡니다. 1x PBS로 부드럽게 헹구십시오.</li>
	<li>로다민 팔로이드를 1.65 μM으로 희석. 세포와 잘 각 잘 에 로다민 Phalloidin의 100 μL을 추가하고 30 분 동안 실온에서 빛으로부터 유지 챔버 커버 글래스를 배양. 1x PBS로 부드럽게 헹구십시오.</li>
	<li>형광 현미경으로 세포 이미지를 캡처합니다.</li>
	<li>각 그룹에 대한 형광 이미지의 세포 수를 계산합니다. 각 웰에 있는 세 개의 임의 영역을 평균화하여 셀 접착 밀도를 계산합니다.</li>
	<li>모든 데이터를 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시합니다. 한 꼬리 t-테스트를 사용하여 통계 분석을 수행하고, 그 다음으로 통계적으로 유의한 것으로 간주되는 p&05를 가진 분산(ANOVA)의 분석이 뒤따릅니다.</li>
</ol>

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</ol>

유펑 첸 박사는 나노드 테라피의 공동 창립자입니다.

이 연구에서는 DNA에서 영감을 얻은 JBNT와 FN으로 형성된 자체 조립 된 생체 Mimetic NM을 개발했습니다. JBNT 용액을 준비할 때, PBS가 조립을 억제하는 JBNT의 응집을 유발하기 때문에 JBNT 리오필화 분말은 PBS 대신 물에 용해되어야 합니다. 또한, NM은 PBS의 염이 NM 섬유와 번들되기 때문에 NM의 나노 피브릴 구조를 관찰하려는 경우에도 물로 조립되어야 하며, 이는 이미지의 해상도를 크게 감소시킬 수 있다.
NM은 hMSCs 접착 및 분화를 용이하게하는 데 사용 된 조직 재생 비계를 제조하기 위해 많은 노력이 이루어졌지만 새로운 조직 공학 발판으로 봉사 할 수있는 큰 잠재력을 보여주었습니다. 그러나, 이러한 물질의 대부분은 3D 프린팅 스캐폴드18,19와같은 특정 형상으로 미리 만들어집니다. 따라서 관절 깊숙이 있는 부상당한 부위에 이식하기가...

인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)는 조직1의재생 및 유지에 도움이 되는 다른 중간엽 혈통을 따라 자가 재생 및 자가 분화의 잠재력을 보여주었습니다. 분화 잠재력에 기초하여, hMSC는 중간 엽 조직 상해 및 조혈 장애 치료2에대한 후보로 간주됩니다. hMSC는 조직 수리, 혈관 신생, 염증 감소3을증가시켜 상처 치유를 촉진하는 능력을 보여주었습니다. 그러나 생화학적 또는 생체 재료 의 지원 없이, hMSC가 표적 조직에 도달하고 원하는 위치에서 기능하는 효율은 낮다4. 병변을 고수하기 위해 hMSC를 유치하기 위해 다양한 엔지니어링 스캐폴드가 활용되었지만, 긴 뼈 의 중간에 있는 성장판 골절과 같은 일부 부위는 기존의 사전 제작 된 비계로 쉽게 접근 할 수 없으며 불규칙한 모양의 부상 부위에 완벽하게 맞지 않을 수 있습니다.
여기서, 우리는 그 자리에서 스스로 조립하고 표적 영역에 도달하기 어려운 주입할 수 있는 생체 모방 나노 물질을 개발했습니다. 주사용 바이오 스캐폴드 NM은 야누스 염기 나노튜브(JBNT)와 섬유네틴(FN)으로 구성된다. 또한 로제트 나노 튜브 (RNTs)로 알려진 JBNTs는 DNA 기본 쌍, 특히 티민과 아데닌, 여기에5,6,7에서파생됩니다. 도 1에서볼 수 있듯이, 나노튜브는 유래 된 DNA 염기의 6 분자가 수소 결합을 통해 자가 조립하여 비행기6을형성할 때 형성된다. 6개의 분자는 그 때 길이200-300 μm까지 할 수 있는 강한 pi-stacking 상호 작용7을통해 평면에 서로 적층됩니다. JBNT는 FN이 그들과 반응할 수 있도록 형태학적으로 콜라겐 섬유를 모방하도록 설계되었습니다.
FN은 세포외 매트릭스(ECM)9에서발견될 수 있는 고분자 성 접착제 당단백질이다. 이들은 ECM의 다른 성분, 특히 콜라겐10의다른 성분에 줄기 세포의 부착을 중재할 수 있다. 우리는 JBNT를 형태학적으로 모방하여 FN이 비동적 결합을 통해 몇 초 안에 NM을 형성할 수 있도록 설계했습니다. 따라서, NM은 기존의 제조된 스캐폴드에 의해 접근할 수 없었던 뼈 골절 부위에 주입되는 유망한 바이오 스캐폴드이다. 여기서, 주 사용 NM은 시험관 내에서 hMSC 앵커리지를 향상시키는 우수한 능력을 제시, 조직 재생을위한 발판으로 봉사 할 수있는 자신의 잠재력을 전시.

<table><tbody><tr><td>1,2-디클로로에탄</td><td>Alfa Aesar</td><td>39121</td><td></td></tr><tr><td>2-시아노아세트산</td><td>시그마-알드리치</td><td>C88505</td><td></td></tr><tr><td>4-디메틸아미노피리딘</td><td>TCI America</td><td>D1450</td><td></td></tr><tr><td>8웰 챔버 커버글라스</td><td>Thermo Fisher 155409</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>앱솔루트 에탄올</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>시그마-알드리치</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>시그마-알드리치</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>알릴아민</td><td>시그마-알드리치</td><td>145831</td><td></td></tr><tr><td>기본 플라즈마 클리너</td><td>해릭 플라즈마</td><td>PDC32G</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>시그마-알드리치</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>농축 염산</td><td>시그마-알드리치</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>탈이온수</td><td>써모 피셔</td><td>15230147</td><td></td></tr><tr><td>디클로로메탄</td><td>시그마-알드리치</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>디에틸 에테르</td><td>시그마-알드리치</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>디-tert-부틸 디카보네이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>361941</td><td></td></tr><tr><td>에틸 아세테이</td><td>트 시그마-알드리치</td><td>319902</td><td></td></tr><tr><td>에틸카르바메이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U2500</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Thermo Fisher</td><td>PHE0023</td><td></td></tr><tr><td>고정액(PBS에서 제조된 4% 포름알데히드)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R37814</td><td></td></tr><tr><td>구아니디늄 염산염</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13543</td><td></td></tr><tr><td>헥산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>227064</td><td></td></tr><tr><td>Human 중간엽 줄기 세포</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>메틸 요오드화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>289566</td><td></td></tr><tr><td>N,N-디이소프로필에틸아민</td><td>알파 아이사르</td><td>A17114</td><td></td></tr><tr><td>N,N-디메틸포름아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>N-메틸모르폴린 N-옥사이드</td><td>알파 아이사르</td><td>A19802</td><td></td></tr><tr><td>오스뮴 테트라옥사이드</td><td>Alfa Aesar</td><td>45385</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 용액</td><td>Thermo Fisher</td><td>20012050</td><td></td></tr><tr><td>염화인산 인</td>산 <td>Sigma-Aldrich</td><td>201170</td><td></td></tr><tr><td>탄산칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>347825</td><td></td></tr><tr><td>역상 컬럼</td><td>Thermo Fisher</td><td>25305-154630</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine Phalloidin</td><td>Thermo Fisher</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>실리카겔</td><td>TCI America</td><td>S0821</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>에톡산화나트륨</td><td>Alfa Aesar</td><td>L13083</td><td></td></tr><tr><td>소듐 주기드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71859</td><td></td></tr><tr><td>황산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239313</td><td></td></tr><tr><td>아황산나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 트리아세테톡시보로하이드라이드</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22060</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계(NanoDrop One/Onec UV-Vis)</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>줄기세포 성장 매체 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td></td></tr><tr><td>테트라하이드로푸란</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>, 401757</td><td></td></tr>, <tr><td>티오아니솔</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>T28002</td><td></td></tr>, <tr><td>톨루엔</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>트리에틸아민</td>, <td>알파 에</td>자르 <td>Aesar, A12646</td><td></td></tr>, <tr><td>트리플루오로아세트산</td>, <td>알파 아이사르</td><td>, A12198</td><td></td></tr>, <tr><td>트리톤 X-100</td>, <td>써모 피셔</td><td>HFH10</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 솔루션</td><td>Thermo Fisher</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

야누스 베이스 나노튜브와 줄기 세포 접착을 위한 섬유네틴을 갖춘 바이오미메틱 나노 매트릭스의 제조

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

생체 모방 NM은 줄기 세포 앵커리지를 향상시킬 수 있는 조직 공학 생물학적 스캐폴드로 개발되었습니다. 생체 모방 NM은 수성 용액의 자체 조립을 통해 JBNT및 FN에서 형성됩니다. JBNT는 내부 소수성 중공 채널과 외부 친성 성 표면으로 길이 200-300 μm을 측정합니다. JBNT는 양수 충전되며 FN은 음수 로 충전됩니다. 따라서 중립 수성 용액에 주입하면 비일관성 결합을 통해 결합되어 NM 번들을 형성합니다. 자체 조립 공정은 화학 개시기, 열원 또는 자외선 없이 몇 초 이내에 완료됩니다. NM 솔루션의 pH가 FN(pI 5.5-6.0)의 등광점보다 낮으면, NM 번들은 양전하 FN의 존재로 인해 자체 방출됩니다.
NM은 세포외 매트릭스 (ECM)를 형태학적으로 모방하는 것으로 알려져 있으므로 hMSC 접착력을 향상시키는 우수한 플랫폼을 제공하는 주사용 스캐폴드로 사용할 수 있습니다. 세포 밀도 분석 및 형광 이미징 실험은 NM이 음의 대조군과 비교하여 hMSC의 앵커리지를 크게 증가시켰다는 것을 나타냈다.

우리의 연구는 JBNT와 FN의 NM의 형성이 빠르다는 것을 것을을 발견했습니다, 이는 10 초에 일어났습니다. 도 2에도시된 바와 같이, JBNT 용액이 FN 용액과 혼합되고 여러 번 배관되었을 때 백색 플록을 얻었다. NM의 형성 과정은 완전히 생물모방이다. 외부 자극이 필요하지 않습니다. 제조 과정은13을교차연결하기 위한 자외선 또는 화학 개시자를 기반으로 하는 일부 신흥 생체 재료보다 훨씬 쉽습니다.
FN, JBNT, NM(그림3)의카메라 이미지를 캡처하고 분석했습니다. FN 군의 경우 짧은 백색 반점을 제외하고는 긴 섬유가 관찰되지 않았다. 짧은 클러스터는 FN으로 구성된 단백질 응집체였으며, 이는 JBNT(그림3A)없이는FN만으로는 스캐폴드 구조를 형성할 수 없음을 나...

이 프로토콜의 목표는 야누스 염기 나노튜브(JBNT)와 섬유네틴(FN)을 가진 생물미메틱 나노매트릭스(NM)의 조립을 보여주는 것이다. 인간 중간엽 줄기 세포(hMSC)와 공동 배양할 때, NM은 hMSCs 접착을 장려하는 우수한 생체 활성을 나타낸다.

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

우리는 조직 공학 골격 역할을 할 가능성이 큰 생체 모방 나노 매트릭스를 개발했습니다. 이 프로토콜은 제 연구실에서 합성된 Janus 기반 나노튜브와 피브로넥틴 단백질의 나노 매트릭스를 조립하는 방법을 보여줍니다. 이 나노 매트릭스는 추가 지원을 사용하지 않고 몇 초 안에 자체 조립할 수 있습니다.인간 중간엽 줄기세포와 공동 배양했을 때, 나노 매트릭스는 세포 부착을 촉진하는 데 탁월한 생체 활성을 나타냈습니다. 나노 매트릭스는 형태학적으로 세포외 기질을 모방합니다. 따라서 목표 위치에서 세포 접착과 기능을 촉진하여 골절을 복구하는 주사 가능한 골격 역할을 할 수 있는 잠재력이 있습니다.나노 매트릭스를 제작하는 것으로 시작합니다. 80마이크로리터의 1밀리리터 Janus 염기 나노튜브를 40마이크로리터의 밀리리터당 1밀리리터 피브로넥틴에 첨가하고 혼합물을 부드럽고 천천히 여러 번 피펫팅합니다. 10초 후 튜브에 흰색 고체 서스펜션이 있는지 육안으로 검사합니다.다음으로, 원고 지침에 따라 동결건조된 물질 관찰을 위해 피브로넥틴, JBNT 및 피브로넥틴/JBNT 나노 매트릭스 용액을 준비합니다. 96웰의 투명한 둥근 바닥 마이크로플레이트의 3웰에 용액을 코팅하고 각 웰에 50마이크로리터를 추가합니다. 접시를 섭씨 영하 80도에서 밤새 얼립니다.다음 날에는 동결건조 기기와 진공 펌프를 켜고 냉각 버튼을 눌러 시스템 온도를 섭씨 영하 50도로 낮춥니다. 얼어붙은 플레이트를 기기에 넣고 모든 구멍을 닫습니다. 시작 버튼을 클릭하여 시스템 압력을 0.9mbar로 줄입니다.4시간 후 에어레이트 버튼을 누르고 밸브를 열어 시스템 압력을 대기압으로 높입니다. 그런 다음 동결 건조 된 기기에서 플레이트를 꺼냅니다. 본문 원고에 기재된 바와 같이 JBNT/피브로넥틴 나노 매트릭스 용액을 준비하고, JBNT와 피브로넥틴 용액을 증류수로 희석하여 대조 용액을 만든다.분광 광도계로 용액의 흡수 스펙트럼을 측정하여 나노 매트릭스의 조립을 특성화합니다. UV-vis 버튼을 클릭합니다. 그런 다음 분광 광도계의 테스트 표면을 청소하고 그 위에 2마이크로리터의 증류수를 떨어뜨립니다.물을 190에서 850 나노 미터까지 공백으로 측정합니다. 각 샘플에 대해 테스트 표면을 청소하고 그 위에 2마이크로리터의 용액을 떨어뜨립니다. 그런 다음 190 - 850 나노미터의 UV-vis 흡수 스펙트럼을 측정합니다.200마이크로리터의 negative control, JBNT, fibronectin 및 nano-matrix 용액을 8웰 챔버 슬라이드의 웰에 추가합니다. 동결 건조된 기기로 8웰 챔버 커버 유리를 동결 건조하여 우물 바닥에 재료를 코팅합니다. 다음, 덮개 유리의 각 우물에 10, 000의 인간적인 mesenchymal 줄기 세포를 추가하고, 5%carbon dioxide를 가진 37 섭씨 온도에 24 시간 동안 그것을 배양하십시오.배양 후 웰에서 세포 배양 배지를 제거하고 PBS로 헹굽니다. 각 웰에 100마이크로리터의 고정액을 넣고 실온에서 5분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 PBS로 세포를 두 번 부드럽게 헹구고 각 웰에 0.1% Triton X-100 100마이크로리터를 추가합니다.10분 후 PBS로 헹굼을 반복합니다. 각 웰에 100마이크로리터의 로다민 팔로이딘을 첨가하고 챔버 커버 유리를 30분 동안 배양하여 빛으로부터 보호합니다. PBS로 세포를 두 번 헹구고 형광 현미경으로 이미지화합니다.나노 매트릭스 형성은 빠르고 완전히 생체 모방입니다. JBNT 용액을 피브로넥틴 용액과 혼합한 후 10초 후에 흰색 응집이 보였습니다. 피브로넥틴(fibronectin), JBNT 및 나노 매트릭스의 카메라 이미지를 캡처하고 분석했습니다.피브로넥틴 그룹에서 긴 섬유가 관찰되지 않았는데, 이는 JBNT 없이는 골격 구조가 형성될 수 없음을 나타냅니다. JBNT는 길고 얇은 섬유로 나타납니다. 피브로넥틴과 가교결합되면 나노 매트릭스 섬유는 길이가 수 센티미터까지 자랄 수 있습니다.나노 매트릭스의 조립은 또한 UV-vis 스펙트럼을 얻어 확인되었습니다. JBNT의 두 흡수 피크는 나노 매트릭스 형성 후에 단독으로 감소합니다. 투과 전자 현미경은 JBNT와 나노 매트릭스의 형태를 특성화하는 데 사용되었습니다.JBNT는 직경이 균일한 가느다란 튜브입니다. 피브로넥틴과 혼합되면 전하 상호작용을 통해 긴 섬유종 나노 매트릭스를 형성합니다. pH가 피브로넥틴의 등전점보다 낮으면 나노 매트릭스는 양전하를 띤 피브로넥틴으로 인해 자체 방출됩니다.JBNT/피브로넥틴 나노 매트릭스가 세포 부착에 미치는 영향도 조사되었습니다. 나노 매트릭스는 형태학적으로 세포외 기질을 모방하도록 설계되었기 때문에 골격을 제공하고 세포 접착력을 증가시킵니다. 형광 현미경 검사는 나노 매트릭스를 사용한 배양이 세포 접착력을 증가시킨다는 것을 확인했습니다.다음 절차에서는 세포 이동, 분화 및 장기 기능을 보여주어 나노 매트릭스가 인간 중간엽 줄기 세포 성장 및 기능에 미치는 영향을 추가로 탐구할 수 있습니다.

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

단일 또는 다수의 세포 외 기질 단백질로부터 나노 섬유 및 나노 구조 복합체를 얻는 방법을 설명한다. 이 방법은 조직 공학 및 생명 공학 응용 프로그램의 다양한 사용을위한 조정 가능한 구성과 아키텍처 무료 서 단백질 계 물질을 생성하는 단백질 표면의 상호 작용을 사용합니다.

ECM 단백질 나노 섬유 및 나노 구조 엔지니어링 사용하여 표면 시작 회의

여기서 우리는 섬유의 계조 조직과 전기 방사 나노 섬유 지지체를 제작하고 세포 형태 / 방향을 조절하는 응용 프로그램을 탐구하는 프로토콜을 제시한다. 나노 섬유 지지체의 물리 화학적 특성에 관한 그라디언트는 생물 의학 분야에서 다양한 응용 프로그램을 제공합니다.

섬유 조직의 그라데이션으로 전기 방사 나노 섬유 공사장 공중 발판

세포 거동의 나노 지형학적 조절을 연구하기 위해 작은 나노 패턴 주형에서 넓은 면적의 나노 패턴 기판을 생산하는 프로토콜이 제시됩니다.

셀 동작의 Nanotopographical 변조를위한 나노 패턴 기판 사용 스티치 기법을 확장

받는 dendrimer 기반 고르지 nanopatterns 로컬 아르기닌-글리신-aspartic 산 (RGD) 표면 밀도의 나노 제어를 허용 하는 방법은 설명 하 고 세포 접착 및 chondrogenic 분화의 연구에 대 한 적용.

로컬 컨트롤 표면 점착을 고르지 Nanopatterns Dendrimer 기반: Chondrogenic 차별화 하는 방법

이 프로토콜 사용자 정의 3D 인쇄 하는 플라스틱 금형을 사용 하 여 변수 크기의 자기 조립된 조직 반지 날조를 위한 플랫폼을 설명 합니다. PDMS 원판 3D 인쇄 형;에 치료 된다 다음 agarose 치료 PDMS 원판에 캐스팅 됩니다. 세포는 그들은 조직의 반지로 집계 결과 agarose 우물에 시드.

셀 시드를 위한 사용자 지정 Agarose 우물 및 자기 조립 금형 3D 인쇄를 사용 하 여 조직 반지 제작

이 문서에서는 물리와 화학의 높은 처리량 조작 신호 세포 microenvironments vivo에서 흉내 낸 고을 다중화 인공 세포 MicroEnvironment (MACME) 배열 준비 하 상세한 방법론 단일 셀 프로 파일링 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 위한 최적의 휴대폰 환경을 식별 합니다.

멀티플렉스 인공 세포 MicroEnvironment 배열의 제작

여기, 우리는 열 nanoimprinting 통해 그라데이션 nanopattern 판의 제조와는 nanostructures 인간의 내 피 조상 세포의 응답을 검사 하는 방법에 대 한 프로토콜을 제시. 설명 된 기술을 사용 하 여 물리적 자극에 의해 셀 동작을 조작할 수 있는 비 계를 생산 가능 하다.

열 Nanoimprinting 기술과 인간의 내 피 식민지 형성 세포의 응답의 심사에 의해 그라데이션 Nanopattern의 제조

The aim of this method is to obtain fibroblast-derived 3D matrices as a natural scaffold for subsequent cellular assays. 섬유아세포는 전처리된 배양판에 씨를 뿌리고 매트릭스 생성을 위한 아스코르브산으로 자극된다. 행렬은 탈세포화되고 관련 세포(예를 들어, 내피 세포)를 배양하도록 차단된다.

섬유 아세포 유래 3D 매트릭스 시스템은 내피 튜브 형성 분석에 적용

이 프로토콜은 야누스 염기 나노 튜브 (JBNts), 마트린 -3 및 형질 전환 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)을 순차적으로 추가하여 층별 야누스 염기 나노 매트릭스 (JBNm) 스캐 폴드의 조립을 설명합니다. JBNm은 제작되고 특성화되었습니다. 또한 우수한 생리활성을 나타내어 부착, 증식 및 분화와 같은 세포 기능을 촉진했습니다.

연골 재생을 촉진하기 위한 층별 야누스 베이스 나노매트릭스의 제작 및 특성 분석

플라스틱 멤브레인이 있는 조직 배양 삽입물은 세포 배양 실험실에서 세포층과 장벽 조직 모델을 확립하기 위한 투과성 지지체로서 황금 표준입니다. 여기에서, 우리는 플라스틱 멤브레인을 재조합 기능화된 거미줄 단백질로부터 만들어진 생물학적으로 더 관련성이 높은 멤브레인으로 대체하는 간단한 방법을 제시한다.

맞춤형 조직 배양 인서트에 재조합 기능성 거미줄로 만든 Nanofibrillar 기저막 모방

다음 프로토콜은 광범위한 조직 공학 응용 분야에 적용할 수 있는 나노 스케일 패턴의 섬유소를 가진 콜라겐 하이드로겔 제조를 위한 전단 기반 압출 방법을 제시합니다.

조직공학을 위한 Nanofibrillar Patterned Collagen 생산

학습하세요 야누스 베이스 나노튜브와 섬유네틴을 이용한 바이오미메틱 나노 매트릭스 조립 방법을. 인간 중간엽 줄기세포의 접착을 촉진하여 조직 공학 및 골절 치료에 활용할 수 있습니다.

야누스 베이스 나노튜브와 줄기 세포 접착을 위한 섬유네틴을 갖춘 바이오미메틱 나노 매트릭스의 제조

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