Name: 수브라크누드 출혈의 모델로 시스테나 마그나에 혈액을 이중 직접 주입 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 학습하세요 쥐 모델에서 시스테나 마그나로 이중 혈액 주입을 통한 수브라크누드 출혈(SAH) 유도 방법을. 이 표준화된 프로토콜은 출혈량 조절과 낮은 사망률로 SAH 병태생리학 연구 및 새로운 치료법 개발에 활용됩니다.

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우리는 이미징 장비에 대한 PRIMACEN 플랫폼 (노르망디 루앙 대학, 프랑스)과 씨 아르노 아라보, 부인 줄리 마우코텔과 부인 마틴 Dubois, 동물 주택 및 치료에 대한 감사합니다. 셀레스트 니콜라 여사님이 프로토콜의 비디오 녹화에 목소리를 빌려준 것에 감사드립니다. 이 작품은 세나리 노르망디 성숙 프로그램, FRM, 노르망디 루앙 대학과 Inserm의 후원 AVC에 의해 지원되었다. 노르망디 지역과 유럽 연합 (3R 프로젝트). 유럽은 유럽 지역 개발 기금 (ERDF)와 노르망디에 참여한다.

모든 절차는 프랑스 윤리위원회와 유럽 의회 지침 2010/63/EU 및 과학 목적으로 사용되는 동물 보호 위원회의 지침에 따라 H. 카스텔의 감독하에 수행되었습니다. 이 프로젝트는 지역 CENOMEXA와 동물 연구 및 테스트에 대한 국가 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. 8-12주 세의 남성 C57Bl/6J Rj 마우스(Janvier)는 통제된 표준 환경 조건하에서 보관되었습니다: 22°C ±1°C, 12시간/12시간 빛/어두운 사이클, 물 및 식품 사용 가능한 광고 리비툼.
1. SAH 수술 및 주사 준비 설정
<ol><li>수술이 시작되기 전에 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 적절한 수의 유리 모세 혈관을 당깁니다. 사출 파이펫은 0.86mm의 내지름과 1.5mm의 외경을 나타내야 한다.</li>
	<li>가짜 상태에 대한 인공 뇌척수액 (aCSF)을 준비합니다.<ol>
<li>119mM NaCl, 2.5mM KCl, 1mM NaH 2 PO4,1.3mM MgCl2,10mMM 포도당, 26.2 mM NaHCO23 InH2O, pH 7.4로 용액을 준비한다.</li>
		<li>가스 aCSF 와 95% O2 및 5% CO2 에 대 한 15 분, 다음 추가 2.5 mM MM CaCl2.</li>
		<li>0.22 μm 필터 장치로 산소aCSF를 살균한다. aCSF 용액은 4°C에서 3-4주 동안 안정될 수 있다. 오염(용액이 흐리거나) 또는 예금 형성이 나타나면 폐기하고 신선한 aCSF를 만듭니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>동종 마우스 기증자로부터 혈액의 수집<ol>
<li>기관지를 따라 경동맥을 분리하고 경동맥의 천자에 의한 최대 양의 혈액을 수집합니다.</li>
		<li>실제로, 마취 실에 마우스를 놓고 동물이 의식을 잃을 때까지 5 %의 이소플루란으로 챔버를적재합니다.</li>
		<li>수술 실험 절차의 설정을 허용하기 위해 두 개의 뒷다리 중 하나를 클램핑하여 반사 신경의 부족을 확인합니다.</li>
		<li>26G 바늘(헤파린 나트륨)을 사용하여 헤파린 용액으로 1mL 주사기를 코팅합니다. 이것은 다음 단계 도중 혈액 응고를 방지할 것입니다.</li>
		<li>다리를 떼어내고 코를 마취 마스크에 배치한 동물을 설치합니다(2~2.5%의 이소플루란을 가진 마취 유지 보수).</li>
		<li>오모로이드 근육을 세로로 해부하여 기관지를 따라 경동맥을 분리한다. 동맥이 분리되면 미세 한 갈고리와 집게의 도움으로 심장쪽으로 바늘을 삽입하고 경동맥구멍을 통해 최대 혈액을 수집합니다 (SAH 마우스 당 60 μL이 필요합니다).</li>
		<li>자궁 경부 탈구를 사용하여 혈액 수집 직후 마취 된 기증자 마우스를 희생하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 동물 (8-10 주 된 C57BL /6J 남성 마우스) 준비
<ol><li>전자 균형을 사용하여 각 마우스의 무게를 정확하게 측정합니다. 현재 연구에서, 쥐의 범위 내에서 체중을 가질 것 이다 20 받는 일 25 수술 직전에 그램.</li>
	<li>앞서 설명한 바와 같이(1.3.2 및 1.3.3단계 참조), 수술되는 마우스의 마취를 유도한다.</li>
	<li>적절한 전기 클리퍼로 목과 귀 사이의 공간을 면도합니다.</li>
	<li>스테레오전술 프레임에 다리와 코를 분리한 복부 탈구에 배치된 동물을 스테레오전술 프레임에 2~2.5%의 마취 마스크에 설치합니다.</li>
	<li>마우스가 자고 있고 머리가 제대로 막혔는지 확인합니다.</li>
	<li>피하 부프레노르핀(0.1 mg/kg)을 허리에 26G 바늘로 피하하여 각성 후 통증을 피합니다.</li>
	<li>보호 액체 젤을 사용하여 안구건조건조를 방지하고 자동 조절 된 전기 담요를 사용하여 37 °C의 내장 온도를 유지합니다.</li>
	<li>멸균 면 도로를 사용하여 방부제 용액 (포비도 요오드 또는 클로르헨시딘)로 후방 목 면도 영역을 치료하십시오.</li>
	<li>준비된 피부/피하 조직을 만지는 모든 계측기를 사전 살균하고(2시간 동안 200°C로 가열)하고 무균 처리합니다.</li>
</ol>3. SAH 유도
<ol><li>첫날(D-1)<ol>
<li>후목의 얇은 가위로 1cm 절개를 자르고 중간선을 따라 근육이 분리되어 시스테르나 마그나에 접근합니다.</li>
		<li>얇은 가위로 빈 유리 파이펫의 끝을 잘라냅니다. 그런 다음 유연한 실리콘 커넥터에 연결된 주사기에 적응합니다.</li>
		<li>정밀 마이크로피펫을 사용하여 0.5mL 튜브에서 혈액 또는 aCSF(SAH 또는 sham 상태의 경우 각각)의 60 μL을 전송합니다.</li>
		<li>SAH 상태를 위한 60 μL 또는 가짜 상태를 위한 aCSF의 60 μL을 유리 파이펫으로 빨아 넣습니다.</li>
		<li>주입을 위해, 링 또는 블루 압정을 사용하여 입체 프레임에 파이펫을 설치하고 천천히 시스테나 마그나와 인터페이스에서 멤브레인에 파이펫 팁을 가져.</li>
		<li>스테레오전술 프레임의 마이크로 조작기를 사용하여 아틀란토 후현막을 시스테나 마그나에 천천히 삽입합니다.</li>
		<li>이전에 혈액 또는 aCSF로 채워진 파이펫을 압력 유도에 대비한 주사기에 연결합니다.</li>
		<li>급성 두개 내 압력을 피하기 위해 플런저를 약 10 μL/min 의 낮은 속도로 눌러 주입하십시오.</li>
		<li>주사 하는 동안, 밀접 하 게 호흡 속도 및 직장 온도 모니터링.</li>
		<li>주입이 끝나면 마이크로 조작기를 통해 파이펫을 조심스럽게 벗고 철수 중에 누출이 없는지 시각적으로 확인하십시오.</li>
		<li>흡수성 hemostat를 사용하여 hemostasis를 달성하고 편조 비 흡수성 봉합 실로 두 봉합사를 실행합니다.</li>
		<li>수술 직후, 마우스를 분해하고 수축을 조절하고 회복 기간 동안 열린 상자에 생존 담요로 덮습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유도 의 둘째 날 (D0)<ol>
<li>24 시간 후에 마취를 유도하십시오 (1.3.2 및 1.3.3 단계 참조). 피하 부프레노르핀 100 μL을 다시 주입하고(0.1 mg/kg) 보호액 젤을 사용하여 안구건조증을 방지합니다(2.7단계 및 2.8단계 참조).</li>
		<li>전날의 고정 프레임에 동물을 설치합니다.</li>
		<li>미세 가시와 봉합사를 조심스럽게 제거합니다.</li>
		<li>아틀란토-후두막을 이전과 같이 준비하고 멸균 면봉으로 목의 면도 부위에 방부제 준비를 적용합니다.</li>
		<li>낮은 속도로 혈액 또는 aCSF의 30 μL을 주입하십시오(단계 3.1.2 ~ 3.1.8). 호흡 속도와 직장 온도를 모니터링합니다.</li>
		<li>주사가 끝나면 조심스럽게 파이펫을 벗고 철수 시 혈액 누출의 부재를 제어하십시오.</li>
		<li>hemostasis를 달성하고 편조 흡수 가능한 봉합 실로 두 봉합사를 실행합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 수술 후 후속 조치 및 실험 종료
<ol><li>수술 직후, 회복 중에 마우스를 분리하고 생존 담요를 뒤쪽에 서바이벌 담요로 분리하고 배치합니다.</li>
	<li>무게와 조심스럽게 희생 될 때까지 각 마우스의 행동을 매일 관찰 (예를 들어, D7 수술 후).</li>
	<li>인도적 종점 중, 상당한 체중 감소 (>15% 무게)는 고전적으로 발견된다. "구부러진" 자세, 느린 움직임, 프로스트레이션, 상처 및 /또는 중요한 공격적인 행동의 비정상적인 발성또한 동물의 고통의 중요한 징후입니다. 이러한 징후 또는 징후의 조합이 나타나면 동물의 모니터링이 출현 후 몇 시간 내에 강화됩니다. 동물의 복지가 48시간 이내에 악화되거나 개선되지 않으면 참을 수 없는 고통의 수준에 도달하고 안락사가 수행되는 것으로 간주됩니다.</li>
	<li>선택의 시점에서, 참수에 의해 마취 된 마우스를 희생하고, 추가 분석을 위해 뇌를 수확.</li>
	<li>이소플루란 마취 후 안락사 (참수)를 수행 (5%).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

SAH 분야의 연구의 강도와 지난 20년 동안 증가하는 혈관 내 및 약리학적 치료 옵션과 같은 치료 전략의 발달에도 불구하고 사망률은 입원 첫 주 내에 높게 유지되며 다음 6개월 동안 약 50%에 도달하고,있으며, 25년후 6개월 동안 약 50%에24도달한다.. 시스테나 마그나에 동종 동맥 혈액의 매일 이중 주입에 의한 이 현재 전임상 모델은 그것의 타당성 및 낮은 사망률과의 협회에 대한 인식되고 있습니다. 실제로, SAH 설치류 모델 중, 사망률의 넓은 범위가 보고되었습니다 : 시스테나 마그른26,2727,,,28,,,,26<...

수막치출혈(SAH)은 모든 뇌졸중 사례의 최대 5%를 차지하며, 100,000명당 7.2~9명의 환자를 발생시키고, 연구3결과에따라 사망률이 20%-60%인 비교적 흔한 병리학을2구성한다., 급성 단계에서, 사망률은 출혈, 재출혈, 뇌 혈관 경련 (CVS) 및 /또는 의학적 합병증4의중증도에 기인한다. 생존자에서, 초기 뇌 손상 (EBI)는 출혈의 빈약한 연장및 두개내 압력의 급격한 증가와 연관됩니다, 이는 1 차대 뇌 허혈귀착될 수 있는 5 및케이스6의 대략 10%-15%에 있는 즉각적인 죽음 귀착될 수 있습니다. SAH의 초기 "급성" 단계 후, 예후는 대뇌 전산 단층 촬영에 의해 환자의 거의 40%에서 검출된 "이차" 또는 지연된 대뇌 허혈(DCI)의 발생에 달려 있으며, 자기 공명 영상(MRI)7,,8후 환자의 최대 80%에서 검출된다. CAH 환자의 대다수에서 동맥류 파열 후 4~21일 사이에 발생하는 CVS 외에도, DCI9는 마이크로혈전증 형성, 감소된 뇌관류, 신경염증 및 피질 확산 우울증(CSD),10,11,,12,,13에이차적으로 다인성 확산 뇌 병변으로 인해 발생할 수 있다. 이는 SAH 생존자의 30%에 영향을 미치며 시각 기억, 언어 기억, 반응 시간 및 집행, visuospatial 및 언어 기능14[일상 생활]을포함한 인지 기능에 영향을 미친다. 현재 SAH 환자의 CVS 및/또는 열악한 인지 결과를 방지하기 위한 표준 요법은 Ca2+ 채널 억제제를 Nimodipine으로 사용하여 Ca2+ 신호 및 혈관 수축의 막힘에 기반을 두고 있습니다. 그러나 혈관 수축을 대상으로 한 최근의 임상 시험은 환자의 신경 학적 결과와 CVS16의예방 사이의 해리를 밝혀, SAH 장기 결과에 관련된 더 복잡한 병생리적 메커니즘을 제안. 따라서, SAH와 수반되는 병리학적 사건의 수와 원래의 치료 내정간섭을 시험하기 위하여 유효하고 표준화된 동물 모형의 발달의 더 중대한 이해를 위한 의학 필요가 있습니다.
인간에 있는 SAH를 주로 책임 있는 두개 내 동맥류의 파열은 전임상 동물 모형에서 모방하기 어렵습니다. 현재, 동맥류 파열 및 SAH 상황은 마우스17,,18에서CVS 및 감시운동 기능 장애를 담당하는 중뇌동맥(혈관 내 천자 모델)의 천공에 의해 잠정적으로 시험될 수 있다. 이 모형에 있는 출혈의 개시 및 혈액의 확산을 통해 가능한 통제의 부족 때문에, 그밖 방법은 혈관 내 파열 없이 SAH 모형을 생성하기 위하여 설치류에서 개발되었습니다. 보다 정밀하게, 그들은 마그나시스테나(19)에서 단일 또는 이중 주사또는 전각 시스테른(20)에 단일 또는 이중 주사를20통해 수막체 공간으로 동맥 혈액을 직접 투여하는 것으로 구성된다. 혈관 내 파열없이 이러한 마우스 모델의 주요 장점은 주입 된 혈액 샘플의 외과 적 절차와 품질 및 양을 재현적으로 마스터 할 수있는 가능성입니다. 특히 혈관 내 천포에 의해 모델에 비해이 모델의 또 다른 장점은 동물의 일반적인 복지의 보존이다. 사실, 이 수술은 경동맥 벽 파열을 생성하는 데 필요한 것보다 덜 침습적이고 기술적으로 덜 도전적입니다. 이 마지막 모델에서, 동물은 외부 경동맥에 삽입되고, 내부 경동맥으로 진보하는 동안, 동물을 삽관하고 기계적으로 환기되어야 합니다. 이것은 가능성이 와이어 경로에 의해 혈관 방해로 인해 일시적인 허혈으로 이어집니다. 따라서, 수술과 관련된 공동 이환율(moribund 상태, 중요한 통증 및 죽음)은 혈관 내 천공 모델에 비해 이중 주사 모델에서 덜 중요하다. 보다 일관된 SAH일 뿐만 아니라, 이중 직접 주사 방법은 연구 및 테스트(마취 하에서 시간 단축, 수술 및 고통의 조직 중단으로 인한 통증)을 준수하며 프로토콜 연구 및 인력 훈련에 사용되는 최소 총 동물 수로 이어집니다.
더욱이, 이것은 SAH의 최적화된 병리학적 이해와 잠재적인 치료 화합물의 비교 시험의 가능성으로 이끌어 내는 형질성 마우스에 동일 프로토콜의 구현을 허용합니다. 여기서, 우리는 6-8주 된 남성 C57Bl/6J 마우스에서 시스테르나 마그나에 자가 동맥 혈액을 이중으로 연속주사함으로써 수막뇌출혈(SAH)의 표준화된 마우스 모델을 제시한다. 이 모델의 주요 장점은 혈관 내 천포 모델에 비해 출혈 부피의 제어, 그리고 두개내압력(21)의급격한 증가 없이 출혈 이벤트의 보강이다. 최근에는 시스테나 마그나로 혈액을 이중 직접 주사하는 것은 마우스의 실험적 및 생리병리학적 문제에 대해 잘 설명되어 왔다. Indeed, we recently demonstrated CVS of large cerebral arteries (basilar (BA), middle (MCA) and anterior (ACA) cerebral arteries), cerebrovascular fibrin deposition and cell apoptosis from day 3 (D3) to 10 (D10), circulation defects of paravascular cerebrospinal fluid accompanied by altered sensitivomotor and cognitive functions in mice, 10 days post-SAH in this model22. 따라서 이 모델은 SAH 이후 단기 및 장기 행사를 마스터, 검증 및 특징으로 합니다. 새로운 표적의 장래 식별및 SAH 관련 합병증에 대한 강력하고 효율적인 치료 전략에 대한 연구에 이상적입니다.

<table><tbody><tr><td>흡수성 지혈제</td><td>Ethicon</td><td>Surgicel</td><td></td></tr><tr><td>흡수성 봉합사</td><td>Ethicon</td><td>Vicryl 5.0</td><td></td></tr><tr><td>자동 조절 전기 담요</td><td>Harvard Apparatus</td><td>50-7087-F</td><td></td></tr><tr><td>모세관 고정용 블루택</td><td>UHU</td><td>Patafix</td><td></td></tr><tr><td>전자 저울</td><td>Denver Instrument</td><td>MXX-2001</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC150F-15</td><td>내경 0.86 mm 외경 1.5 mm</td></tr><tr><td>이소플루란 기화기</td><td>Phymep</td><td>V100</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>바늘 26 G</td><td>BD 마이크로밸런스</td><td>300300</td><td></td></tr><tr><td>비흡수성 봉합사</td><td>Peters surgical</td><td>Filapeau 4.0</td><td></td></tr><tr><td>입체 프레임</td><td>David Kopf 악기</td><td>모델 902</td><td></td></tr><tr><td>수술 장비</td><td>켄트 과학</td><td>클램프, 마이크로 가위, 얇은 가위</td><td></td>,</tr><tr><td>주사기, 20mL TERUMO</td><td>Thermofisher</td><td>11866071</td><td></td></tr></tbody></table>

수브라크누드 출혈의 모델로 시스테나 마그나에 혈액을 이중 직접 주입

Double Direct Injection of Blood into the Cisterna Magna as a Model of Subarachnoid Hemorrhage

뇌졸중 중, 뇌동맥류의 파열에 연속 된 뇌동맥류 (SAH)는 5-9 %를 나타내지만 신경 학적 결과의 관점에서 중요한 이환율을 가진 총 뇌졸중 관련 사망률의 약 30 %를 담당합니다. 지연된 대뇌 혈관경련(CVS)은 지연된 대뇌 허혈과 관련하여 가장 자주 발생할 수 있습니다. SAH의 다른 동물 모델은 현재 혈관 내 천공 및 시스테나 마그나 또는 심지어 전치질 통에 혈액의 직접 주입을 포함하여 사용되고 있으며, 각각 뚜렷한 장점과 단점을 나타낸다. 본 기사에서는, SAH의 표준화된 마우스 모델이 시스테나 마그나로 의정된 부피의 결정된 볼륨을 이중 직접 주입하여 제시된다. 간단히 말해서, 마우스는 이소플루란 흡입에 의해 계량한 다음 마취하였다. 이어서, 동물은 37°C의 직장 온도를 유지하는 가열된 담요상에 기대어 배치하고 약 30°의 자궁경부 굴곡이 있는 스테레오테틱 프레임에 배치하였다. 일단 제자리에, 같은 나이와 성별의 다른 마우스의 경동맥에서 가져온 상동성 동맥 혈액으로 채워진 길쭉한 유리 마이크로피펫의 끝 (C57Bl/6J)은 미세 조작기를 통해 아틀란토 -문부막과 접촉하는 직각으로 위치하였다. 그런 다음 60 μL의 혈액을 시스테르나 마그나에 주입한 다음 2분 동안 동물의 30° 하향 기울기가 뒤따랐습니다. 시스테나 마그나에 혈액 30 μL의 두 번째 주입은 첫 번째 후 24 시간 수행되었다. 각 동물의 개별 후속 은 매일 수행됩니다 (무게와 웰빙의 주의 평가). 이 절차는 인공 뇌 척수액 (CSF)의 동등한 주입에 의해 모방 될 수있는 두개 내 압력 고도를 동반, 혈액의 예측 가능하고 매우 재현 가능한 분포를 허용하고, 낮은 사망률을 유도 SAH의 급성에서 온화한 모델을 나타냅니다.

실험적 타임라인, 절차, 후속 및 사망률 도 1A 및 도 1B는 혈액의 이중 인종 차별적 주입에 의해 SAH 모델 프로토콜을 요약한다. 간략하게, SAH 유도 (D-1)의 첫날에, 60 μL의 혈액은 동종 마우스 또는 인공 뇌척수액 (aCSF)의 60 μL에서 각각 SAH 또는 sham 조건에서 시스테나 마그나로 주입되었다. 다음 날(D0), 동종 마우스에서 30μL 또는 aCSF의 30 μL을 각각 SAH 또는 샴 조건에서 시스테나 마그나에 주입했다. 수술 후 24시간, 마우스 살해 및 뇌 분석은 도 1C에도시된 바와 같이 파라혈관 공간으로의 혈액 분포를 관찰할 수 있게 되었다. D1에서 희생까지 일반적인 복지에 대한 민감한 지표로서, 체중은 D1에서 D8까지 매일 평가되었고, D1에서 D8까지의 가짜 동물에 비해 SAH에서 체중이 ...

우리는 이 프로토콜에서 시스테나 마그나에 자가 전혈을 이중 으로 주입하여 표준화된 지주막 출혈(SAH) 마우스 모델을 기술하였다. 이중 주사 절차의 높은 수준의 표준화는 사망률에 관한 상대적 안전과 SAH의 중간-급성 모델을 나타낸다.

Among strokes, subarachnoid hemorrhage (SAH) consecutive to the rupture of a cerebral arterial aneurysm represents 5-9% but is responsible for about 30% ...

이 현재 비디오의 전반적인 목표는 지주 막증 출혈의 모델로 시스테나 마그나에 혈액의 이중 직접 주입의 프로토콜을 설명하는 것입니다. 지주 막 증 출혈의 생리학은 종종 동맥류의 파열때문입니다. 그리고 우리는 먼저 뇌와 뇌를 덮는 조직 사이의 구획으로 혈액의 사치를 합니다.이 구획은 수막의 공간입니다. 수막치출혈은 모든 파업 케이스의 최대 7%를 차지합니다. 사망률은 인구 기반 연구와 지주 막 증 출혈 생존자에서 30~50%사이 변화 일반적으로 메모리 적자로 인지 후속편을 경험, asthenia, 또는 기분 장애.가난한 결과의 높은 보급에 있는 주요한 원인은 대뇌 허혈입니다. 연구는 첫번째 팽만점 사건 후에 첫번째 와 15 일 사이 환자의 대다수에서 검출될 수 있는 현미경 혈관경련이라는 큰 대뇌 동맥의 혈관 수축에 있는 허혈의 발생 사이 링크를 만들었습니다. 현재 치료 옵션의 비효율성 때문에 병리학 적 사건에 대한 더 나은 이해를위한 명백한 의학적 필요성이 있습니다.수위 지주 체 증 과 새로운 치료 대상 테스트 해야 하지만 이 다양 하 고 표준화 된 동물 모델 필요. 인간에서 지주 막 증 출혈의 주로 책임 inter cranial 동맥류의 파열은 전임상 및 인간 적인 모형을 만들기 위하여 확률이 높습니다. 동물에서는 출혈과 혈액 분포의 제어 발생률에 주요 어려움이 있지만, 최근 연구는 지주 막증 출혈의 모델의 더 많은 재적 모델의 개발에 초점을 맞추고 있습니다.여기에 시스테나 마그나로 우리의 이틀의 자가 동맥 혈액의 두 연속 주사의 표준화 된 마우스 모델을 나타냅니다. 이 모델의 주요 장점은 비침습적 외과 적 수술을 다시 마스터하고 주입 된 혈액의 품질과 양을 조정하고 두개내 압력을 크게 증가시키지 않고 출혈 이벤트를 강화하는 것입니다. 수술이 시작되기 전에 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 또 다른 많은 수의 유리 모세 혈관을 넣어야합니다.주입 파이펫은 0.86 밀리미터의 내지름과 0.5 밀리미터의 외경을 나타내야 한다. 서면 프로토콜에 표시된 것처럼 인공 뇌 척수액을 가짜 상태에 대비하십시오. 0.22 미크론 필터 장치를 사용하여 이 산소인공 뇌척수액을 깨달아야 합니다.우리의 지주 막 증 출혈 모델의 첫 번째 단계는 기관지를 따라 경동맥의 격리와 경동맥 천막에서 혈액의 최대의 수집에 이루어져 있습니다. 이소플루란에 의한 마취 후, 실험 절차의 설정을 허용하기 위해 하나 또는 두 개의 뒷다리를 클램핑하여 반사 신경의 부족을 확인하십시오. 26 게이지 바늘을 사용하여 Eprin으로 1밀리미터 주사기를 코딩합니다.이것은 다음 단계 도중 혈액 응고를 방지할 것입니다. 전자 균형을 사용하여 각 마우스의 무게를 정확하게 측정합니다. 현재 연구에서, 쥐의 범위 내에서 체중을 가질 것 이다 20 받는 일 25 수술 직전에 그램.앞서 설명한 바와 같이, 수술된 마우스의 마취를 유도한 다음 적절한 전기 클리퍼를 통해 각 귀 사이의 목과 공간을 면도한다. 체크 마우스는 자고 마우스 헤드가 잘 차단되어 있습니다. 1킬로당 0.1 밀리그램의 부프레노르핀 100마이크로리터를 허리에 26게이지 바늘로 주입하여 각성 후 통증을 피하십시오.보호 액체 젤을 사용하여 안구건조건조도 방지하고 자동 조절 전기 담요를 사용하여 37도의 내관 온도를 유지합니다. 살균 용액으로 면도 영역을 치료하기 전에 조직을 만지는 모든 계측기는 살균되어 무균으로 처리되었습니다. 첫날, 후방 목에 1센티미터 길이의 절개를 자르고, 미드라인을 따라 근육이 분리되어 시스테나 마그나에 접근했습니다.얇은 가위로 빈 유리 파이펫의 끝을 잘라냅니다. 그런 다음 유연한 실리콘 커넥터에 연결된 주사기에 적응합니다. 그런 다음 정밀 마이크로 피펫을 사용하여 0.5 밀리리터 튜브에 혈액 또는 인공 뇌 척수액 60 마이크로리터를 옮기고, 지주 막증 출혈 상태를 위한 혈액 60 마이크로리터 또는 가짜 상태에 대한 인공 뇌척수액의 60 마이크로리터를 전달합니다.주입의 경우, 예를 들어, 우리의 링 또는 a를 사용하여 스테레오전술 프레임에 파이펫을 삽입하고 시스테나 마그나와 인터페이스에서 멤브레인에 파이펫 팁에 천천히 접근한다. 스테레오전술 프레임의 미세 조작기를 사용하여 아틀란토 후현막을 통해 피펫 팁을 천천히 시스테나 마그나에 삽입합니다. 파이펫을 이전에 채워진 주사기에 연결하여 압력 유도에 대비합니다.급성 두개 내 고혈압을 피하기 위해 분당 약 10 마이크로 리터의 낮은 속도로 압력에 의해 주입하십시오. 주사 하는 동안, 밀접 하 게 호흡 속도 및 직장 온도 모니터링. 주입의 끝에서, 조심스럽게 마이크로 조작기를 사용하여 파이펫을 벗고 시각적으로 철수 하는 동안 누출이 없습니다 주의.항상성을 달성하고 편조 비 흡수성 봉합 실로 두 봉합사를 수행합니다. 수술 직후, 마우스를 쇠약함으로 분리하고 배치하고 회복 기간 동안 열린 상자에 생존 담요로 덮습니다. 24 시간 후에, 마취를 다시 유도하고, 전날로 입체 프레임에 마우스를 설치하고 마이크로 가위를 가진 봉합사를 주의하여 제거하십시오.아틀란토 후두막의 멸균 이전과 같이 면도 부위에 바르고 면봉을 사용하여 무균 용액을 바르게 하십시오. 전날과 같이 30마이크로리터의 혈액 또는 인공 뇌척수액을 낮은 비율로 주입하십시오. 이미 언급했듯이 호흡률과 직장 온도를 모니터링하십시오.주사가 끝나면 조심스럽게 파이펫을 벗고 철수 시 혈액 누출의 부재를 제어하십시오. 항상성을 달성하고 편조 흡수 가능한 봉합 실로 두 봉합사를 수행합니다. 수술 후 첫날부터 희생의 날까지, 체중은 일반적인 웰빙에 대한 민감한 지표로 매일 평가되어야합니다.그것은 지주 막 증 출혈에 상당한 감소 체중 증가 보여 주었다, 가짜 동물에 비해, 오래 지속 활동 복구 과정 및 장기간 된 병 리 질환 이벤트를 제안, 후 지주 막 출혈. 왜 필멸의 삶이 가짜 상태가 아닌가? 사망률은 지주 막증 출혈 상태에서 7일째에 30%에 가깝으며, 대부분의 동물은 수술 후 1일 또는 4일째에 사망합니다.인도적 종점 중, 초기 체중의 15 %의 우수한 상당한 체중 감소가 주목된다. 구부러진 등 자세, 느린 움직임, 상처, 비정상적인 발성 또는 중요한 침략은 동물이 고통받고 있다는 징후이기도합니다. 이러한 징후 또는 징후의 조합이 나타나면 동물의 추적이 출현 후 몇 시간 내에 강화됩니다.동물의 상태가 48시간 이내에 발생하거나 개선되지 않는 시간에 악화되면 참을 수 없는 고통의 수준에 도달하고 살인이 수행되는 것으로 간주됩니다. 수술 첫날이 예에서, 그것은 샘플 뇌에서 관찰 될 수있다, 지주 막치 출혈 대상에 윌리스 다각형의 큰 동맥을 따라 혈전. 수술 후 5일째와 희생 전, 인도 간 잉크 주입은 큰 소뇌 동맥의 혈관 수축에 대응하는 거시성 혈관 경련의 검출을 허용하고, 헤마톡시린과 에오신을 가진 뇌 슬라이스의 착색은 뇌 혈관 경련의 측정을 허용합니다.이 사진 현미경에 설명된 바와 같이 바실라 동맥의 혈관 경련을 관찰할 수 있습니다. cisterna magna에 혈액의 직접 주입을 우회의이 모델에서, 우리는 최근에 큰 뇌 동맥의 뇌 혈관 경련을 입증했다, 뇌 혈관 세동 증착, 및 세포 세포 증착, 마우스에 변경 된 감각, 모터, 및 인지 기능과 함께. 따라서, 그것은이 모델을 검증 하 고 단기 및 오래 지속 이벤트에 대 한 특성화, 후지 암 초 출혈.새로운 표적의 장래 식별및 뇌막증 출혈 관련 합병증에 대한 효율적인 치료 전략에 대한 연구에 이상적입니다.

double-direct-injection-blood-into-cisterna-magna-as-model

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 프로토콜에서 설명하는 생쥐에서 했습니다만 출혈의 autologous 혈액 주입 모델은 바늘 트랙까지 혈액 역류, 펌핑 시스템에서 anticoagulants의 위험을 최소화하기 위해 이중 사출 기술을 사용하고, 시스템의 모든 죽은 공간 및 확장 튜브를 제거합니다.

마우스에서 자연 했습니다만 출혈을 모델로 Autologous 혈액 주입

Aneurysmal subarachnoid 출혈 (SAH)은 때 동맥 파열 subarachnoid 공간에 발생합니다 출혈이 있습니다. subarachnoid의 출혈이 몇 년 전 예전처럼 될 수 계속 한 후이 행사의 병적 상태와 사망률이 개선 치료 방법으로 인해 감소, vasospasm의 위험에 왔지만. 뇌성 vasospasm의 시작 이벤트를 식별하기 위해 포괄적이고 재현 동물 모델을 확립의 중요성은 배리의 1979 년 실험 vasospasm 모델 쥐의 첫 번째 사용하기 때문에 연구의...

실험 Subarachnoid의 출혈 후 뇌 지연 Vasospasm을 평가하기 위해 낮은 사망 쥐 모델

intracerebral 출혈 (ICH)의 임상 관련 동물 모델은 출혈성 뇌졸중에 대한 지식을 확장하고 새로운 치료 전략을 검토 필요합니다. 본 연구에서는, 우리는 설명과 쥐의 기저 신경절 (코퍼스 striatum)에 autologous 전체 혈액이나 세균 collagenase 하나의 일방적 주사를 구현하는 두 ICH 모델을 평가합니다.

마우스의 모델링 Intracerebral 출혈 : Autologous 혈액이나 세균 Collagenase의 주입

이 비디오는 지주막하 출혈 쥐 모델을 설정하는 절차를 보여줍니다. 마취된 쥐에게는 두개내압과 뇌혈류를 측정하기 위해 프로브를 이식합니다. 표적 부위가 확인되고 바늘이 chiasmatic 전 위치에 삽입됩니다. 그런 다음 자가 혈액을 지주막하 공간으로 주입하여 두개내 압력을 높이고 뇌 혈류를 감소시켜 모델을 확립합니다.

자가 혈액 주입에 의해 유도된 지주막하 출혈 쥐 모델 구축

출처: Tang, X. et. al., 자가 혈액의 이중 주입에 의한 대량 폰틴 출혈. J. Vis. Exp. (2021)이 프로토콜은 쥐 뇌의 폰틴 부위에 자가 혈액을 제어하여 주입하여 대규모 폰틴 출혈을 모델링하는 방법을 설명합니다. 목적은 국소 압력을 증가시켜 국소적인 뇌출혈을 시뮬레이션하는 것입니다.

자가 혈액 주입에 의한 쥐 모델에서 대량 폰틴 출혈 유도

윌리스 천공의 관내 서클 지주막 하 출혈의 표준화 된 마우스 모델을 설명한다. 선박 천공 및 지주막 하 출혈은 두개 내 압력 모니터링에 의해 모니터링된다. 또 각종 중요한 파라미터는 기록 및 생리적 조건을 유지하도록 제어된다.

지주막 하 출혈의 생쥐 모델

토끼를 대상으로 한 실험적 두개내 압력 조절 혈액 션트 지주막하 출혈(SAH) 모델은 쇄골하 동맥 삽관 및 경피적 수조 마그나 천자라는 표준 절차를 결합하여 SAH 후 인간의 병태생리학적 상태를 밀접하게 모방할 수 있습니다. 단계별 지침을 제시하고 성공적인 실험적 SAH 생성을 위한 주요 수술 포인트에 대해 논의합니다.

지주막 하 출혈의 급성과 늦은 후유증의 연구에 대한 토끼 피 션트 모델 : 기술적 측면

우리는 자가 혈액의 이중 주입을 통해 쥐에 거대한 pontine 출혈 모델을 설정하는 프로토콜을 제시한다.

자동 혈액의 이중 주입에 의한 대규모 폰틴 출혈

지주막하 출혈은 계속해서 사람의 사망률과 이환율에 대한 높은 부담을 안고 있습니다. 상태와 병태생리학에 대한 추가 연구를 용이하게 하기 위해 pre-chiasmatic, 단일 주입 모델이 제시됩니다.

쥐 모델에서 실험적 지주막하 출혈을 유도하기 위한 자가 혈액의 Pre-chiasmatic, 단일 주사

여기서 우리는 정확한 출혈 부위를 보장하고 다른 관련 두개내 병리를 배제하기 위해 수술 후 24 시간 동안 자기 공명 영상 (MRI)과 결합 된 혈관 내 필라멘트 천공에 의해 유도 된 표준화 된 SAH 마우스 모델을 제시합니다.

자기 공명 영상(MRI)과 결합된 Subarachnoid 출혈에 대한 혈관 내 천공 모델

학습하세요 쥐 모델에서 시스테나 마그나로 이중 혈액 주입을 통한 수브라크누드 출혈(SAH) 유도 방법을. 이 표준화된 프로토콜은 출혈량 조절과 낮은 사망률로 SAH 병태생리학 연구 및 새로운 치료법 개발에 활용됩니다.

수브라크누드 출혈의 모델로 시스테나 마그나에 혈액을 이중 직접 주입

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