Name: 드로소필라 애벌레를 사용하여 열유전학 신경 화면에서 다량 영양소 섭취의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 배우세요 Drosophila melanogaster 애벌레를 사용한 열유전학 신경 화면에서 다량 영양소 섭취 정량화 방법을. 이 프로토콜은 신경 집단이 영양 선택에 미치는 영향을 연구하는 데 도움을 줍니다.

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이 프로토콜에 설명된 실험 장비의 일부에 대한 액세스를 제공한 Instituto Gulbenkian de Ciência (IGC)에 감사드립니다. 이 작품은 포르투갈 과학기술재단(FCT), 리스보아-01-0145-FEDER-007660에 의해 지원되었다. PTDC/NEU-NMC/2459/2014, IF/00697/2014, 라 카이사 HR17-00595 ~ PMD, 호주 연구위원회 미래 펠로우십(FT170100259)이 CKM에 있습니다.

1. 자당 효모 (SY) 다이어트의 준비
<ol><li>다량 영양소 균형과 L3 양육 다이어트에 대한 모든 건조 성분 (한천, 효모, 자당)의 무게. 1L의 식품을 준비하는 데 필요한 각 성분에 대한 그램의 양은 도 1B로표시됩니다. 참고: 60mm 페트리 접시를 채우기 위해서는 약 13mL의 음식이 필요하다는 점을 고려하십시오.</li>
	<li>모든 성분을 멸균 증류수(식품 준비에 필요한 총 물량의 약 50%를 사용)에 녹여 5-10분 동안 배지를 저어줍니다.</li>
	<li>50 분 동안 자동 클라브.</li>
	<li>매체가 식히는 것을 허용한 후에, 규정식에 니파진 과 선전 산 용액을, 3%와 0.3%의 최종 농도 (v/v)에 각각 추가하십시오. 다량 영양소 균형 식단에 1 %의 최종 농도 (v /v)에 파란색 식품 염료를 추가하십시오. 증류수로 총 볼륨을 완성합니다.</li>
	<li>60mm 페트리 접시에 음식 식단을 조심스럽게 붓기 때문에 부어 넣은 음식의 양은 각 접시에 거의 동일합니다. 식단의 P:C 비율로 접시에 라벨을 붙입니다. 참고: 수유 분석 당일 다량 영양소 균형 식단을 준비합니다. 가능하지 않은 경우, 준비된 식단을 밀봉 된 용기에 4 °C에서 최대 3 일 동안 보관하십시오. 저장 기간이 길수록 식단이 너무 건조하고 단단하게 변하며 애벌레는 배지에 잠복할 수 없습니다.</li>
</ol>2. 부모의 라인의 유전 십자가
참고: Gal4/UAS시스템(21)을 사용하여 유전적 십자가를 설정합니다. 본 프로토콜에서, 특정 신경 인구에서 신경 기능을 활성화하기 위해, UAS dTRPA1 선17의 여성 처녀가 사용되고 Janelia Gal4 라인(그림 2A)에서남성에게 교차하였다. 사용된 유전 제어는 dTRPA1 선과 루빈 Gal4 수집을 생성하는 데 사용되는 벡터에 Gal4를 운반하는 "빈 GAL4" 라인 사이의 십자가의 자손이지만 규제 조각이 존재하지 않는 (attP2)22. 신경 억제를 촉진하기 위해, DTRPA1 대신 ShibireTS20을 인코딩하는 UAS 라인을 사용할 수 있습니다.
<ol><li>L3 양육 다이어트 플레이트와 함께 60mm 배아 수집 케이지를 설치하고 활성 효모 페이스트를 보충합니다.</li>
	<li>성인 UAS dTRPA1 여성 처녀와 Janelia Gal4 남성, 5-8 일 세, 배아 수집 케이지에 24-48 h, 25 °C에서, 60 % 습도 와 12:12 밝은 어두운 주기(그림 2A). 60mm 배아 수집 케이지의 경우, 약 100 처녀 암컷과 십자가 당 30 남성을 사용합니다.</li>
	<li>짝짓기 기간이 끝나면 유전 적 십자가에 사용되는 L3 양육 다이어트 플레이트를 제거하고 폐기하십시오. 계란 평지와 애벌레 준비를 수행하기 위해 신선한 L3 양육 다이어트 플레이트를 대체합니다.</li>
</ol>3. 제3성 애벌레준비 (L3)
<ol><li>짝짓기 성인 파리를 신선한 L3 양육 다이어트 플레이트로 옮기고 25°C(도2B)에서3-4h동안 계란 누워가 발생할 수 있도록 한다. 모든 플레이트가 유전자형, P:C 비율의 식이요법과 달걀 누워서 표시되어 있는지 확인하십시오. 참고: 시간을 절약하려면 계란을 추가로 취급하지 않는 L3 양육 식단에 직접 계란 을 놓습니다. 소규모 유전 적 스크리닝의 경우 사과 주스 천판을 사용하여 계란 누워의 최적화를 얻을 수 있습니다.</li>
	<li>계란 누워 기간의 끝에서, 케이지에서 접시를 제거하고 플라스틱 뚜껑으로 덮습니다. 효모 추출물이 L3 양육 판을 보충하는 데 사용되는 경우, 계란 누워의 끝에 있는 모든 잔류 효모를 제거하십시오. 이것은 애벌레 성장 도중 비 균일한 공급을 피하기 위하여 중요합니다. 참고 : 짝짓기 성인은 신선한 L3 양육 다이어트 플레이트로 옮길 수 있으므로 더 많은 계란 낳기를 수행하고 더 많은 실험적 애벌레를 얻을 수 있습니다. 연속 계란 평신도는 한 주 동안 같은 성인과 함께 수행 할 수 있습니다.</li>
	<li>접시당 계란 수를 추정하고 접시 당 최대 200 배아에 애벌레 밀도를 유지합니다. 이 추정은 플레이트의 1 분기에 있는 배아의 수를 계산하여 행해질 수 있습니다. 참고: 과밀한 접시는 애벌레 발달을 지연시키고 애벌레 먹이 주기 행동에 영향을 미칩니다.</li>
	<li>L3 양육 플레이트를 18°C(허용 온도), 60% 습도 및 12:12 광어두운 사이클로 배양하고 유충이 9일 동안 성장할 수 있도록합니다(그림 2B).</li>
	<li>계란 누워 후 9 일째에 (AEL), 각 유전자형에서 10 L3의 세 그룹을 수집 (및 복제에 대한) 테스트할 수 있습니다. 또한 "제로 염료 식품"제어를 위해 10 L3그룹을 수집합니다. 애벌레 수집은 계란 누워를 수행하는 데 사용되는 하루의 동등한 기간 동안 수행되도록 (예를 들어, 계란 누워가 오전 10시에서 오후 2시 사이에 발생하는 경우, 같은 기간 동안 애벌레를 수집 9 일 AEL) 가능한 한 부드럽게 수행, 포셉 #5 또는 페더급 포셉을 사용하여. 다음 단계(3.6)에 표시된 대로 애벌레를 직접 이송합니다. 참고 : "제로 염료 식품"제어 동물은 먹이 분석에서 청색 염료없이 음식을 제공하는 애벌레입니다. 이 제어는 th 애벌레 추출물의 배경 흡광도를 제거하는 것이 필수적입니다.</li>
	<li>수집된 실험유충을 1mL의 물을 포함하는 플라스틱 접시 무게 보트로 옮는다. 그림 3에주어진 방향을 따라 L3가 아니라 L2가 아닌 수집되는지 확인합니다. 참고: L3를 물 또는 1x 인산염 완충식식염(PBS)이 함유한 플라스틱 보트에 대한 컬렉션은 먹이 주기 분석이 시작되기 전에 유충을 잘 수분을 유지하는 것이 중요합니다. 이것은 다른 유전자형에서 몇몇 실험 L3 단이 동시에 집합되는 경우에 특히 중요합니다. 각 그룹에 대한 수집 순서를 추적하므로 각 그룹에 대한 음식 박탈 기간의 차이는 최소화됩니다. 이 단계에서 플라스틱 보트를 사용하면 애벌레가 수조에 직접 떠들어갈 수 있으므로 4.3 단계의 선택적 단계를 용이하게합니다.</li>
</ol>4. 열유전학 활성화 및 선택없는 수유 분석
참고: circadian 리듬과 관련된 가능한 변화를 최소화하기 위해 하루 중 거의 같은 시간에 수유 방법을 수행하는 것이 좋습니다. 또한 항상 제어 실험("빈 Gal4" 선의 자손은 UAS dTRPA1 및 "제로 염료 식품" 애벌레로 넘어간)을 관심 있는 유전자형과 병행하여 실행합니다.
<ol><li>인큐베이터를 30°C(비허용 온도)로 설정하고 높은 수준의 습도(최소 65%)를 유지합니다. 분석 중에 유충 탈수를 피하십시오.</li>
	<li>수유 분석서를 시작하기 전에 30°C에서 30분 동안 따뜻하게 하여 분석 플레이트의 온도를 상량화합니다.</li>
	<li>(선택 사항) 37° C 수조에서 2분 동안 실험유충을 열쇼크. 일부 물을 포함하는 플라스틱 무게 보트에서 동물과 함께이 단계를 수행합니다. 참고: 이 단계의 목적은 수유 분석의 시작부터 뉴런의 발사를 촉진하여 뉴런 활성화를 강화하는 것입니다.</li>
	<li>1h 준비된 여러 타이머를 설정합니다. 사용할 타이머수는 테스트 중인 실험 그룹의 수와 애벌레 처리에 대한 실험자의 숙련도 수준에 따라 달라집니다. 참고: 여러 타이머의 사용은 모든 유전자형에 대해 분석 의 지속 시간을 일관되게 유지하는 데 중요합니다.</li>
	<li>플라스틱 보트에서 물을 조심스럽게 배출하고, 촉촉한 부드러운 브러시를 사용하여, 부드럽게 분석 판의 중심으로 보트에서 L3 그룹을 전송합니다. 플레이트의 뚜껑을 뒤로 하고 정확한 1h 급식 세션을 유지하기 위해 각 플레이트(또는 플레이트 그룹)에 대한 타이머를 시작합니다.</li>
	<li>애벌레가 30°C에서 1시간 동안 먹이를 주도록 허용한다(도2C). 참고: 어둠 속에서 분석의 성능다이어트는 같은 염료 농도를 포함 하더라도 톤이 다를 것이기 때문에 식단 전반에 걸친 시각적 단서의 차이를 제어하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>접시를 얼음 욕조로 옮기면 먹이 주기 분석서를 중지하십시오. 가능한 한 얼음을 눌러 플레이트에 안정적인 표면을 제공합니다. 참고: 추운 온도는 잠복 및 굴착 행동을 억제하여 수유의 끝을 촉진합니다. 애벌레의 대부분은 몇 분 후에 음식 접시를 표면화하고 다음 단계에서 회복을 촉진합니다.</li>
</ol>5. 식품 염료 추출
<ol><li>테스트된 10L3의 각 그룹에 대해 2mL 마이크로튜브를 준비하여 약 0.5mm 유리 구슬(마이크로튜브의 바닥 부분을 채우기에 충분함)과 300 μL의 얼음-차가운 메탄올을 함유하고 있습니다. 벤치 쿨러를 사용하여 마이크로 튜브를 추위에 유지합니다. 주의: 메탄올은 인화성이 높고 독성이 있습니다. 통풍이 잘 되는 지역에서 작업하고 니트릴 장갑을 착용하는 등 이 시약을 처리하는 데 권장되는 모든 안전 절차를 따르십시오. 참고: 메탄올의 사용은 애벌레 샘플을 고치고 큐티클에서 멜라늄화 반응을 피하는 것이 중요합니다.</li>
	<li>#5 또는 페더급 집게를 사용하여, 조심스럽게 먹이 분석 플레이트에서 10 L3의 그룹을 복구하고 일부 물을 포함하는 분석 판의 뚜껑으로 전송. 유충을 헹구고 몸에 있는 음식 파편을 제거하면서 유충을 부드럽게 다루어 부상을 피하십시오. 복제당 각 유전자형에 대해 회수된 애벌레의 수에 대한 기록을 보관하여 애벌레당 평균 양의 음식 섭취량을 정량화할 수 있도록 하십시오. 참고 : 부상당한 애벌레는 피부색을 혼합하여 착색 정량화에 적합하지 않을 수 있기 때문에 버려야합니다.</li>
	<li>L3 그룹을 5.1로 제조된 2mL 마이크로튜브로 전송합니다.</li>
	<li>애벌레 조직을 lyse하여 5.1 단계에서 첨가된 조직 용액 및 유리 구슬을 사용하여 기계적 용해 방법에 의해 용기에서 식품 염료를 추출합니다. (티슈 라이저를 사용할 수 없는 경우 균질화 유봉을 사용하십시오). 우선, 4 °C(도 2D)에서이단계를 수행합니다. 참고: 이 단계의 지속 시간은 사용되는 장비에 따라 달라집니다. 종래의 조직 용액을 사용하여 1 분 추출이 충분합니다. 시간 수축의 경우 프로토콜은 이 단계가 끝날 때 일시 중지되고 나중에 진행할 수 있습니다. 샘플을 -20°C에 저장합니다.</li>
	<li>추출물을 1.5mL 마이크로튜브를 청소하여 새로운 1.5mL 마이크로튜브에 직접 2mL 마이크로튜브를 반전시음으로써 이송한다. 부드럽게 수행하면 대부분의 유리 구슬은 2 mL 마이크로 튜브의 하단에 유지됩니다.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 최대 속도로 추출물을 원심분리하여 세포 이물질을 치웁울 수 있습니다.</li>
	<li>1.5 mL 마이크로튜브를 청소하기 위해 초월제를 수집합니다. 셀룰러 파편이 초월제에서 여전히 보이는 경우 5.6 및 5.7 단계를 반복하십시오.</li>
</ol>6. 식품 소비의 색채 정량화
<ol><li>시작 블루 염료 용액의 메탄올에서 직렬 1:2 희석을 수행하여 교정 곡선을 생성하기 위해 표준 솔루션을 준비합니다. 빈 으로 메탄올만 사용하십시오. 표준의 농도는 동물의 음식 섭취량 수준에 따라 달라집니다. 참고: 여기에 제시된 파일럿 스크린의 경우, 애벌레 추출물에 대해 얻어진 염료 농도가 0.02에서 1.93 μL/mL/ mL범위로, 메탄올내 2 μL/mL 청색염 용액의 8개의 직렬 희석의 흡광도를 측정하여 얻어진 표준 곡선을 사용하였다. 필요한 경우 실험 용료의 염료 농도에 따라 이러한 용액의 농도를 증가또는 감소시합니다.</li>
	<li>실험용 시료(5.7단계에서 얻어진) 100μL을 96웰 마이크로플레이트의 우물로 이송하고 플레이트 판독기(도2E)를이용하여 600nm에서 흡광도를 측정한다. 배경 흡광도를 제거하려면 애벌레 추출물("제로 염료 식품 제어)에 대한 "제로"로 청색 염료없이 식품에 공급된 애벌레에서 얻은 추출물의 흡광도를 측정합니다.</li>
	<li>표준 곡선을 생성하고 각 실험 애벌레 그룹에서 샘플에 대해 얻은 흡수도 값을 음식 섭취량의 양(mL의 부피)과 상관관계를 맺습니다. 5.2 단계에서 각 그룹에 대해 수집된 애벌레수를 고려하여 애벌레당 평균 음식 소비량 찾기</li>
</ol>

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<li>Li, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GAL4+driver+resource+for+developmental+and+behavioral+studies+on+the+larval+CNS+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila.</a> Cell Reports. 8 (3), 897-908 (2014).</li>
<li>Bhatt, P. K., Neckameyer, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+larval+feeding+circuit+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the larval feeding circuit in Drosophila.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e51062(2013).</li>
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<li>Lingo, P. R., Zhao, Z., Shen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-regulation+of+cold-resistant+food+acquisition+by+insulin-+and+neuropeptide+Y-like+systems+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Co-regulation of cold-resistant food acquisition by insulin- and neuropeptide Y-like systems in Drosophila melanogaster.</a> Neuroscience. 148 (2), 371-374 (2007).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 프로토콜을 사용하면 특정 신경 인구의 열유전학 활성화하에서 유충의 능력을 테스트하여 단백질과 탄수화물의 섭취 수준을 조절할 수 있으며, 두 가지 주요 다량 영양소가 다른 P:C 조성물의 식단에 노출될 수 있습니다. 이 방법은 다른 다량 영양소 품질의 다이어트에 걸쳐 음식 섭취량의 제어와 관련된 신경 인구를 식별하는 것을 목표로 애벌레 예비 검진의 맥락에서 테스트되었다. 이 작품은 또한 Drosophila 애벌레가 영양 항상성에 관련 되 었던 먹이 행동의 신경 기초를 조사하기위한 귀중한 동물 모델임을 입증하는 데 기여합니다.
프로토콜의 메모로 제공되는 정보 외에도 몇 가지 중요한 측면에 대해 더 논의하고자 합니다. 모든 행동 분석에서와 마찬가지로, 동물 행동과 관련된 변이를 최소화하기 위해 실험자가 조치를 취해야 합니다. 하나는 염두에 두어야 할 매우 중요한 측면은 발달 동기화 된 동물을 얻는 것의 중요성과 관련이 있습니다. 발달 단계에서 잘 동기화되는 초기 L...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.
Figure 1 was updated from:
<img alt="Macronutrient balancing chart and table; protein-carbohydrate ratios in L3 larvae diets, experiments." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Protein-carbohydrate ratio chart, diet composition graph for L3 larvae, macronutrient quantification." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 1"> 
Figure 1: The sucrose-yeast (SY) diets used in our protocol. (A) The blue dots represent the isocaloric (248 calories/L) macronutrient balancing diets used in the feeding assay, which differ in the protein to carbohydrate (P:C) ratios: 1:1, 1:4 and 1:16. The beige dot represents the diet used to rear the experimental third-instar larvae (L3), which contained a P:C ratio of 1:2 and a caloric density of 495 calories/L. (B) Detailed composition and nutritional information of the sucrose-yeast (SY) based diets. The components are the same for all the diets: agar, sucrose and yeast. The amount in grams of the components needed to prepare 1 L of diet is shown. Note that 1% (v/v) of blue dye must be added to the macronutrient balancing diets and to the L3 rearing diet nipagin and propionic acid solutions must be added to a final concentration (v/v) of 3% and 0.3%, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61323/61323fig1v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61323/quantification-macronutrients-intake-thermogenetic-neuronal-screen">Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae</a>. A figure was updated.

Erratum: Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

모든 동물은 생존, 성장 및번식을위해 필요한 양의 영양소를 얻기 위해 균형 잡힌 식단에 의존합니다. 무엇을 얼마나 먹을지의 선택은 포만 수준과 같은 동물의 내부 상태와 관련된 다양한 상호 작용 요인및 식품 품질2,3,4,5와같은 환경 조건에 의해 영향을 받습니다. 단백질과 탄수화물은 두 가지 주요 다량 영양소이며 균형 잡힌 섭취는 동물의 생리적 과정을 유지하는 데 필수적입니다. 따라서, 먹이 행동을 통제하고 이러한 다량 영양소의 균형 잡힌 섭취를 유지하는 신경 메커니즘의 이해는 매우 관련이 있다. 이는 수명, 대변, 대사 건강 과 같은 생명력 특성이단백질 섭취량6,7,8,9,10의수준에 직접적으로 영향을 받고 있기 때문이다.
포유류를 포함한 복잡한 동물과 함께 진화적으로 보존된 먹이 습관을 나타내는 더 간단한 더 많은 기관 유기체의 사용은 이러한 유형의 연구에 필수적입니다. 중요한 것은, 이러한 간단한 동물 모델은 비용이 많이 드는, 윤리적, 기술적으로 더 효과적인 맥락에서 복잡한 생물학적 질문을 해부 할 수있는 좋은 기회를 제공합니다. 지난 수십 년 동안, Drosophila는강력한 유전 도구 키트, 복잡하고 고정관적인 행동 및 포유류와 말초 및 영양 감지 메커니즘의 보존 된 아키텍처를 통해 행동 신경 생물학자11을위한유익한 모델이되었습니다. 궁극적으로, 희망은 음식 섭취가 이 동물에서 어떻게 규제되는지 이해함으로써, 더 간단한 신경계로, 우리는 인간 섭식 장애의 근본적인 신경 오작동을 풀어 놓기 시작할 수 있다는 것입니다.
먹이 행동에 대 한 신경 기판의 연구는 그들의 신경 활동을 조작 하는 동안 동시에 동물의 음식 섭취를 측정 할 수 있는에 깊이 의존. 섭취하는 음식의 최소한의 양으로 인해 파리가 먹는 음식의 양을 정량화하는 것은 매우 어렵고 현재 사용 가능한 모든 방법은 상당한 한계를 제시합니다. 따라서, 금본위제는 상호 보완적인방법론(12)의조합을 사용하는 것입니다. 성인 파리는 역사적으로 유전 및 행동 모델로 선호되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, Drosophila 애벌레, 또한 먹이 행동을 코딩 하는 신경 기판을 조사 하는 기회를 제공. 약 12,000개의 뉴런을 가진 애벌레 중추 신경계 (CNS)는 대략 150,000개의 뉴런을 포함하는 성인의 그것 보다는 현저하게 더 적게 복잡합니다. 이 낮은 복잡성은 수치뿐만 아니라 기능적입니다, 유라 행동은 간단한 기관차 기능과 감각 시스템에 의존하기 때문에. 그들의 신경계의 명백한 단순성에도 불구하고, 애벌레는 아직도 완전한 먹이 행동을 전시하고, Drosophila 애벌레에 있는 음식 섭취를 정량화하는 몇몇 방법은5,13,14,15를기술되었습니다. 신경 활동의 조작과 짝을 이면, Drosophila 애벌레는 음식 섭취의 신경 조절을 이해하기 위한 고도의 기관모형을 구성할 수 있습니다.
여기에 제공 된 다른 다량 영양소 품질의 다이어트에 노출 된 애벌레의 음식 섭취량을 정량화하는 상세한 프로토콜이 있습니다. 이른바 다량영양소 균형 식단은 단백질과 탄수화물 함량이 다르며, 특히 탄수화물(P:C) 비율에 대한 단백질과 관련하여 1:1(단백질이 풍부한 식단), 1:4(중간 식단), 1:16(단백질 가난한 식단)에 대해 도 1A에나타낸 바와 같이. 간단히 말해서, 청색 식품 염료로 염색한 이 3개의 동종 자당 효모(SY)를 사용하여 정량적 무선택 수유 분석이 설립되었습니다. 효모 추출물과 자당은 단백질 및 탄수화물 공급원으로 사용되었고, 둘 다 탄수화물을 함유하고 있기 때문에, P:C 비율의 변이는 이전에 설명된 바와 같이, 이 두 성분의 균형을 변경하여 얻어졌다16 및 도 1B에나타난 바와 같이. 주요 실험 단계를 보여주는 프로토콜의 회로도 개요는 그림 2에서사용할 수 있습니다.
이 프로토콜은 다른 P:C 비율의 규정식에 있는 애벌레 공급 수준의 규칙에 특정 신경 인구의 역할을 조사하고 열유전학 신경 스크린의 맥락에서 설치되었습니다. 잘 특징적인 신경유전학 적 도구는 과도 수용체 전위 (TRP) 제품군에서 사용되었다: 드로소필라 과도 수용체 잠재적 채널 (dTRPA1), 이는 온도 및 전압 게이트 양이온 채널입니다, 주변 온도가 25 ° C17이상 상승 할 때 행동 잠재력의 발사를 허용. dTRPA1 트랜스진을 표현하기 위해, 우리는 Janelia 연구 캠퍼스18,19에서플라이 라이트 프로젝트의 맥락에서 루빈 실험실에 설립 된 드로소필라 게놈에서 시스- 규제 영역을 기반으로 Gal4 라인을 이용했다.
여기서 설명된 프로토콜은 활성화 화면의 맥락에서 확립되었지만, dTRPA1의 대안으로, 온도에 민감한 뉴런 소음기 ShibireTS20을사용하여 억제 스크린을 수행하기 위해, 즉 다른 특정 요구 또는 관심사에 실험자가 쉽게 적응할 수 있다. 이 및 기타 적응은 프로토콜 및 토론 섹션에서 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 마이크로튜브</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>10xPBS</td><td>Nytech</td><td>MB18201</td><td></td></tr><tr><td>2.0mL 마이크로튜브</td><td>Sarstedt AG & Co.</td><td>72.695.500</td><td></td></tr><tr><td>60mm 페트리 접시</td><td>Greiner Bio-one, 오스트리아</td><td>628161</td><td></td></tr><tr><td>96웰 마이크로플레이트</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-204453</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Pr&oacute;-vida, 포르투갈</td><td></td><td></td></tr><tr><td>벤치 쿨러</td><td>Nalgene, USA</td><td>Labtop Cooler 5115-0032</td><td></td></tr><tr><td>Blue food dye</td><td>Rayner, Billingshurst, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 파괴 매체</td><td>Scientific Industries, Inc.</td><td>888-850-6208</td> <td>(0.5 mm 유리 구슬)</td></tr> <tr><td>접시 무게 보트</td><td>산타 크루즈 생명 공학</td><td>SC-201606</td><td></td></tr><tr><td>60mm 페트리 접시 용 배아 수집 케이지</td><td>플라이 스터프, 과학 실험실 용품, 영국</td><td>FLY1212 (59-100)</td><td></td></tr> <tr><td>페더급 집게</td><td>BioQuip 제품, 미국</td><td>4750</td><td></td></tr><tr><td>재고 유지 보수</td><td></td><td></td><td>를위한 플라이 식품1L 식품 내용물: 한천 10g, 효모 추출물 100g, 자당 50g, 니파진 30mL, 프로피온산</td></tr><tr><td>겸자 3mL #5</td><td>Dumont</td><td>0108-5-PS</td><td>표준 팁, INOX, 11cm</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>LMS Ltd, UK</td><td>Series 2, Model 230</td><td>열유전학적 섭식 분석용(30? C)</td></tr> <tr><td>Incubator</td><td>Percival Scientific, 미국</td><td>DR36NL</td><td>유충 (19? C)</td></tr> <tr><td>Janelia lines</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>표 2의 상세 정보</td></tr><tr><td>다량 영양소 균형 다이어트</td><td></td><td></td><td>구성 및 영양 정보 그림 1</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>VWR</td><td>CAS 번호 : 67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>니파진 (메틸 4- 하이드 록시 벤조 에이트)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H5501</td><td></td></tr><tr><td>니트릴 장갑</td><td>VWR, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf, Germany</td><td>5804 R / 일련 번호: 5805CI364293</td><td></td></tr><tr><td>Rubin Gal4 ines</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>Bloomington Drosophila Stock Center에서 사용 가능</td></tr><tr><td>ShibireTS UAS 라인</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BDSC 번호: 66600</td><td>Carlos Ribeiro Group</td></tr><tr><td>Soft brushes</td><td></td><td></td> <td>제공마취된 초파리 분류용</td></tr><tr><td>분광광도계 플레이트 리더</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Multiskan Go 51119300</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Nikon</td><td>1016625</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sidul, 포르투갈</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세 번째 instar 유충(L3) 사육 다이어트</td><td></td><td></td><td>그림 1의 구성 및 영양 정보</td></tr><tr><td>타이머</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue lyzer / bead beater</td><td>MP Biomedicals, USA</td><td>FastPrep-24 6004500</td><td></td></tr><tr><td>TRPA1 UAS 라인</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BDSC 번호: 26264</td><td>UAS 제어 하에 TrpA1을 표현합니다. 25에서 실험적으로 뉴런을 활성화하는 데 사용할 수 있습니까? C</td></tr><tr><td>수조</td><td>Sheldon Manufacturing Inc., 미국</td><td>W20M-2 / 03068308 / 9021195</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Pr&oacute;-vida, 포르투갈</td><td></td><td>51% 단백질, 15% 탄수화물</td></tr></tbody></table>

드로소필라 애벌레를 사용하여 열유전학 신경 화면에서 다량 영양소 섭취의 정량화

Quantification of Macronutrients Intake in a Thermogenetic Neuronal Screen using Drosophila Larvae

먹이를 주고 먹이를 주는 행동을 통해 동물은 개발, 건강 및 피트니스에 필수적인 에너지와 영양소의 원천에 접근할 수 있습니다. 이러한 행동의 신경 조절을 조사하는 것은 영양 항상성의 근본적인 생리적 및 분자 메커니즘의 이해를 위해 필수적입니다. 벌레, 파리 및 물고기와 같은 유전적 인 동물 모델의 사용은 이러한 유형의 연구를 크게 용이하게합니다. 지난 10 년 동안, 과일 플라이 Drosophila 멜라노가스터는 먹이와 위조 행동의 신경 제어를 조사하는 신경 생물학자에 의해 강력한 동물 모델로 사용되었습니다. 의심 할 여지없이 가치가 있지만, 대부분의 연구는 성인 파리를 검사합니다. 여기서, 우리는 애벌레가 그들의 단백질과 탄수화물 함량이 다른 규정식에 드러날 때 먹이 행동을 통제하는 신경 기질을 조사하기 위하여 간단한 애벌레 신경계를 이용하는 프로토콜을 기술합니다. 우리의 방법은 뉴런 열유전학 활성화 스크린의 맥락에서 수행되는 정량적 색색 무선택 공급 분석법을 기반으로 합니다. 판독으로, 1 시간 간격을 통해 애벌레에 의해 먹는 음식의 양은 탄수화물 (P:C) 비율에 그들의 단백질에서 다른 3개의 염료 표지 규정식 의 한에 드러낼 때 이용되었습니다. 이 프로토콜의 효능은 다른 다량 영양소 품질의 식단에서 먹는 음식의 양을 조절하는 후보 신경 인구를 식별함으로써, 애벌레 Drosophila에서신경 유전학 화면의 맥락에서 입증된다. 우리는 또한 표현형으로 시험된 유전자형을 분류하고 그룹화할 수 있었습니다. 문헌에서 현재 사용 가능한 방법에 대한 간략한 검토 외에도 이러한 방법의 장점과 제한 사항이 논의되고 이 프로토콜이 다른 특정 실험에 어떻게 적응할 수 있는지에 대한 몇 가지 제안이 제공됩니다.

Drosophila 애벌레는 과잉 탄수화물을 섭취하는 비용으로 단백질 섭취량을 조절23 (그림 2E의회로도 플롯). 실제로, 단백질 섭취량의 이러한 우선 순위는 다른 많은 동물에서 관찰되었으며24,25를활용하는 단백질이라고 불린다.
이 강력한 먹이 행동 반응을 활용, 행동 기반 화면 다량 영양소 균형에 관련 된 신경 인구를 식별 하기 위해 설계 되었습니다. DTRPA1을 이용한 L3(그룹당 10명)의 그룹이 광고 리비도를 1시간 동안, dTRPA1을 이용한 뉴런 열유전학 활성화 조건 하에서 특정 P:C 비율(1:1, 1:4및 1:4)을함유한 식품 염색 식단 3...

여기에 설명된 프로토콜은 다른 다량 영양소 품질의 식단에 노출된 Drosophila 멜라노가스터 애벌레에 의해 정의된 시간 간격 내에 섭취되는 음식의 양을 정량화할 수 있도록 하는 프로토콜이다. 이 소는 신경 열유전학 스크린의 맥락에서 행해질 것입니다.

Foraging and feeding behaviors allow animals to access sources of energy and nutrients essential for their development, health, and fitness. Investigating ...

우리의 프로토콜은 두 가지 주요 다량 영양소인 단백질과 탄수화물의 섭취 수준 조절과 관련된 영양 선택을 인코딩하는 유충 신경 세포 개체군을 식별할 수 있도록 합니다. 우리 방법의 단순성과 상대적으로 높은 처리량으로 인해 다양한 영양 조건에 노출된 여러 유전자형에 대한 음식 섭취량을 정량화할 수 있습니다. 유전적으로 부모의 혈통을 넘나들기 위해, 60mm 배아 채취 케이지에 L3 양육 다이어트 플레이트와 약간의 활성 효모 페이스트를 보충하십시오.5-8일 된 성체 TripA1 암컷 처녀와 Janelia GAL4 수컷을 배아 수집 케이지로 옮기고 섭씨 25도에서 60%의 습도와 12, 12의 밝은 어두운 주기에서 24-48시간 동안 짝짓기가 일어나도록 합니다. 짝짓기 기간이 끝나면 짝짓기 된 성충 파리를 신선한 L3 사육 다이어트 플레이트로 옮기고 섭씨 25도에서 3-4시간 동안 알을 낳을 수 있도록 합니다. 모든 플레이트에 알을 낳는 유전자형과 날짜가 표시되어 있는지 확인하십시오.알을 낳는 기간이 끝나면 우리에서 플레이트를 제거하고 플레이트의 1/4에 있는 배아의 수를 세어 플레이트당 계란 수를 추정합니다. 유충 밀도를 플레이트당 최대 200개의 배아로 유지하고 플레이트를 플라스틱 뚜껑으로 덮습니다. L3 사육 플레이트를 섭씨 18도, 습도 60%, 12, 12의 어두운 주기에서 9일 동안 배양합니다.배양 후, 테스트할 각 유전자형에서 10 L3로 구성된 3개 그룹과 제로 염료 식품 대조를 위해 10 L3로 구성된 한 그룹을 수집합니다. 5번 또는 깃털처럼 가벼운 집게를 사용하여 유충 수집을 가능한 한 부드럽게 수행합니다. 수집된 유충을 1ml의 물이 들어 있는 플라스틱 접시 무게 보트로 옮깁니다.섭씨 30도의 인큐베이터를 설치하고 분석 중 유충 탈수를 방지하기 위해 물을 채운 트레이를 추가하여 습도 수준을 높게 유지합니다. 시작하기 전에 분석 플레이트를 섭씨 30도로 가열하여 온도를 평형화합니다. 모든 플레이트에 식단의 유전자형과 단백질 대 탄수화물 비율이 표시되어 있는지 확인하십시오.동물이 들어있는 플라스틱 보트를 섭씨 37도의 수조로 직접 옮겨 실험용 유충을 2분 동안 열충격을 가합니다. 필요한 타이머 수를 1시간 동안 설정한 다음 플라스틱 보트에서 물을 조심스럽게 빼내고 보트의 L3 그룹을 자산 플레이트 중앙으로 옮깁니다. 접시를 덮고 타이머를 시작하십시오.유충이 어둠 속에서 섭씨 30도에서 1시간 동안 먹이를 먹도록 합니다. 플레이트를 얼음 수조로 옮겨 공급 분석을 중지합니다. 마이크로튜브의 바닥 부분을 채우기에 충분한 0.5mm 유리 구슬과 300마이크로리터의 얼음처럼 차가운 메탄올을 포함하는 테스트된 각 L3 그룹에 대해 2개의 밀리리터 마이크로튜브를 준비합니다.벤치 쿨러를 사용하여 마이크로튜브를 차갑게 유지하십시오. 공급 분석 플레이트에서 L3 그룹을 조심스럽게 회수하고 약간의 물과 함께 플레이트의 뚜껑으로 옮깁니다. 유충을 헹구어 몸에서 음식물 찌꺼기를 제거하고 부상을 입지 않도록 주의하십시오.유충을 준비된 마이크로튜브로 옮기고 조직 용해기로 용해하여 내장에서 식용 염료를 추출합니다. 2ml 마이크로튜브를 새 튜브에 직접 뒤집어 1.5ml 마이크로튜브를 세척하기 위해 추출물을 옮깁니다. 대부분의 유리 구슬이 2 밀리리터 튜브의 바닥에 머물도록 부드럽게 수행하십시오.추출물을 최대 속도와 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하여 세포 파편을 제거한 다음 상층액을 옮겨 1.5ml 튜브를 청소합니다. 식품 소비량의 열량 계량을 수행하려면 메탄올에 1-2 회 연속으로 희석하여 파란색 염료의 표준 용액을 준비하십시오. 100마이크로리터의 실험 샘플, 표준물질 및 블랭크를 96웰 마이크로플레이트의 웰로 옮기고 600나노미터에서 흡광도를 측정합니다.이 프로토콜은 유충 신경계의 특정 신경 세포 집단의 열유전학적 활성화를 받는 동물에게 소비되는 다량 영양소의 상대적인 양을 정량화하는 데 사용되었습니다. 뉴런 개체군의 뚜렷한 활성화는 제3 instar 유충의 다량 영양소 균형에 유의한 영향을 미쳤습니다. 여기에서 회색으로 표시된 대조선에서 관찰된 수유 패턴은 단백질 대 탄수화물 비율이 높은 식단에서 예상되는 음식 섭취 감소를 보여주며 이 방법의 효과를 보여줍니다.실험동물에 대해 확립된 5가지 표현형 분류는 많이 먹는다, 과식으로 인한 단백질 희석을 보상한다, 많이 먹지만 보상하지 않는다, 적게 먹지만 보상한다, 적게 먹는다와 보상하지 않는다, 비정상적으로 먹는다. 이러한 표현형 분류 및 유전자형 각각에 대해 third-instar 유충의 중추 신경계의 GFP 패턴이 표시됩니다. 이 프로토콜을 시도할 때, 동물 행동과 관련된 변동을 최소화하기 위해 발달적으로 동기화된 초기 제3 instar 유충을 생성하는 것이 중요합니다.이 프로토콜에 따라, 식품의 무선 라벨링은 이 방법을 사용하여 발견된 히트의 확인 및 추가 해부를 가능하게 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

확인된 뉴런과 먹이 행동에서 칼슘 신호의 동시 녹화 Drosophila melanogaster</em

CApillary FEeder (CAFE) 분석은 음식 섭취의 기저에 있는 메커니즘을 조사하기 위한 간단하고 예산 친화적이며 매우 신뢰할 수 있는 방법입니다. 다재다능한 유전자 모델 유기체인 Drosophila melanogaster와 함께 사용되는 이 제품은 음식 섭취의 조절 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 강력한 수단을 제공합니다.

모세관 공급 분석은 식품 섭취를 측정<em&gt; 노랑 초파리</em

이것은 높은 지방 다이어트를 먹이 초파리, 이해 기본적인 분자 메커니즘 lipotoxicity에 연루에 대 한 모델에서에서 비만 유발 하는 프로토콜 이다. 초파리 와 다양 한 식이, 환경, 유전적 또는 생리 적인 조건 하에서 (곤충) 잠재적으로 다른 모델에 지방 축적을 측정 하기 위한 높은 처리량 triacylglyceride 분석 결과를 제공 합니다.

높은 지방 다이어트 먹이 초파리 Melanogaster 의 높은 처리량 Triacylglyceride 분석 결과

염색 음식 양이 많은 음식 섭취 량 분석 제공 하는 강력한 고 높은 처리량 먹이 동기 평가를 의미 합니다. 결합 식품 소비 분석 결과 thermogenetic 및 optogenetic 스크린은 성인에서 식욕을 기본 신경 회로 조사 하는 강력한 접근 방식을 초파리 melanogaster.

양이 많은 음식 섭취 량 분석을 결합 하 고 강제로 초파리 에서 식욕을 공부 하는 뉴런을 활성화

선물이 산소 소비와 초파리 melanogaster 애벌레와 성인 두뇌에 있는 세포 외 산성화를 측정 하기 위한 프로토콜. 신진 대사 분석기는 적응 하 고 최적화 된 프로토콜 활용 됩니다. 마이크로 조직 억제는이 프로토콜의 중요 한 구성 요소 설계 하 고이 분석에 그들의 사용을 위해 특히 창조 되었다.

초파리 melanogaster Larval 및 성인 두뇌의 변화 분석

우리는 파리에 대한 두 선택 먹이 분석에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 수유 분석은 빠르고 실행하기 쉬우며 소규모 실험실 연구뿐만 아니라 파리의 고처리량 행동 스크린에도 적합합니다.

드로소필라의 신속한 식품 선호 분석

마이크로 플레이트 피더 분석법은 Drosophila에서액체 음식 소비를 정량화하기 위한 경제적이고 높은 처리량 방법을 제공합니다. 3D 프린팅 장치는 파리가 트레이서 염료로 공급 용액을 소비하는 1536웰 마이크로 플레이트에 파리가 보관되는 96웰 마이크로 플레이트를 연결합니다. 용액 량 감소는 분광계로 측정됩니다.

드로소필라에서 소비의 정량화를 위한 높은 처리량 마이크로 플레이트 피더 분석

여기에서는 생체 외 초파리 유충 뇌 제제에서 유전적으로 인코딩된 Förster 공명 에너지 전달 기반 센서를 사용하여 신경교세포와 뉴런에서 모노카르복실레이트, 포도당 및 ATP의 수송을 시각화하는 프로토콜을 제시합니다.

유전적으로 인코딩된 센서를 사용하여 생체 외 초파리 유충 뇌에서 모노카르복실레이트 및 기타 관련 대사 산물 시각화

를 사용하여 화합물 Bioactivity위한 이점 Nanoinjection 및 화면에 대한 전기 생리학 분석 Drosophila melanogaster 거대 섬유 시스템

이 문서에서 우리는 assays가 열 nociception 공부를...

에서 열 Nociception를 평가 지역 및 글로벌 방법<em&gt; Drosophila</em&gt; 애벌레

배우세요 Drosophila melanogaster 애벌레를 사용한 열유전학 신경 화면에서 다량 영양소 섭취 정량화 방법을. 이 프로토콜은 신경 집단이 영양 선택에 미치는 영향을 연구하는 데 도움을 줍니다.

드로소필라 애벌레를 사용하여 열유전학 신경 화면에서 다량 영양소 섭취의 정량화

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