Name: 포르신 오시테 캡슐화를 위한 프로틸분해 된 알기네이트 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: 배우세요 돼지 난포세포 복합체(COC)를 섬유소-알기네이트 비드와 FEP 분말로 캡슐화하여 3D 구조를 유지하고 생존율을 높이는 방법을. 생식생물학 연구와 불임 치료에 활용할 수 있습니다.

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저자는 매우 감사: 박사 Waclaw Tworzydlo (발달 생물학 및 무척추 동물 형태학과, 동물학 및 생물 의학 연구 연구소, Jagiellonian 대학) TEM의 기술 시설에 대 한; 기술 지원을 위해 비타 스나코프스카 (내분비학 학과, 동물학 및 생물 의학 연구 연구소, 야기엘로니아 대학)에게; 세포 생물학 및 이미징학과, 동물학 및 생물 의학 연구 연구소, 자지엘로니아 대학, JEOL JEM 2100HT (JEOL, 도쿄, 일본). 이 작품은 폴란드 국립 과학 센터로부터 2018/29/N/NZ9/00983교부금에 의해 지원되었습니다.

다음 절차는 야기엘로니안 대학의 동물학 및 생물 의학 연구 연구소의 동물 복지 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 돼지 적혈구 -oocyte 복합체의 격리
<ol><li>난소 여포의 격리를 위한 물질을 수집하기 위해, 지역 도살장에서 프레우버탈 금(약 6-7개월, 무게 70~80kg)에서 돼지 난소를 소비한다. 각 실험에서 COC 격리를 위해 10마리의 동물중 약 20마리의 돼지 난소를 선택하십시오. 참고: 각 난소가 3-5여포를 산출한다는 가정하에 총 여포 수는 60개에서 100개로 다양합니다.</li>
	<li>멸균 인산염 완충식식염(PBS; pH 7.4; 38°C)이 1% AAS를 함유한 보온병에 난소를 놓습니다. 실험 물질이 항생제를 함유한 멸균 PBS로 두 번 헹구는 1 시간 이내에 실험실로 이송되는지 확인하십시오.</li>
	<li>난소를 헹구고, HM 배지로 채워진 비커로 옮기고 모든 조작시 동안 38°C의 인큐베이터에 보관한다. 참고: 난낭 처리 중 최적의 결과를 얻으려면, 2.5%의 항생제/항mycotic 솔루션(AAS) 및 10%의 태아 소 혈청(FBS)을 추가하여 DMEM/F12 배지(취급 매체, HM)의 모든 절차를 수행하고 온도 조절(38°C) 이하의 온도 조절이 가능한 가열 테이블에서 PH를 제어합니다.2</li>
	<li>큰 돼지 여포 (직경 6-8 mm)에서 실온에서 10 분 동안 100 x g에서 포부 및 원심 분리에 의해 여포 액액 (FF)을 수집합니다. 그 후, 0.2 μm 멤브레인 모공 필터에 부착된 멸균 주사기를 사용하여 상체를 필터링하고 -80 ° C에서 동결합니다. 참고: 인슐린 주사기(u-40)를 사용하여 여포액을 포부합니다.</li>
	<li>건강한 중형 모낭(직경 4~6mm)만 코크스절연(42)에대해 선택되도록 한다. 참고: 동질적인 ooplasm 및 다층(적어도 3-4) 소형 적정체가 있는 온전하고 둥근 난미를 소지하고 있는 1급 의 COC는 추가 3D IVM시술(43)에적합한 것으로 간주된다.</li>
	<li>COC를 분리하려면 2-3 난소를 HM으로 채워진 멸균 10cm 직경페트리 접시로 옮기고 아래 절차 중 하나를 따라 중형 여포에서 COC를 분리합니다.<ol>
<li>돌출난소 여포의 표면을 멸균 수술 블레이드 15C로 부드럽게 자릅니다. 이것은 COCs와 더불어 여포 액체가 페트리 접시로 흘러 나가는 원인이 될 것입니다.</li>
		<li>일회용 주사기에 부착된 5/8"의 크기를 갖는 28 G 바늘을 사용하여 여포 함량을 흡인시키고 페트리 접시에 옮긴다. 참고 : 난소 조직의 유해를 폐기하십시오. 격리의 후속 단계는 스테레오 현미경으로 수행됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3-5 60mm IVF 페트리 요리를 준비합니다.<ol>
<li>중앙 우물에 HM 1mL을 추가하고 외부 고리에 3-4 방울의 HM (드롭 당 50 μL)을 놓습니다.</li>
		<li>그런 다음 폴리카보네이트 마이크로파이프를 사용하여 손상되지 않은 COC를 외부 고리에 HM을 떨어뜨려 3-4시간 간 간략하게 헹구도록 합니다.</li>
		<li>결국, 개별적으로 중앙 우물로 전송합니다. 이 IVF 플레이트를 인큐베이터에 저장하여 추가 절차를 진행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>COC를 수집한 후 아래에 나열된 두 개의 다른 IVM 캡슐화 프로토콜에 무작위로 할당하여 최종 선택 단계를 수행합니다.</li>
</ol>2. 피브린 알기네이트 하이드로겔 구슬 캡슐화
<ol><li>트리스 버퍼식 식염수(TBS; pH 7.4)에서 50IU/mL 혈소판 1mL를 2.0mL 멸균 마이크로센티리후지 튜브에 100mMMMCaCl2로 준비한다.</li>
	<li>피브리노겐 스톡 솔루션(TBS에서 50 mg/mL)을 준비하고 냉동 상태로 유지하십시오. 참고: TBS에서 피브리노겐을 용해할 때 응집하지 않으려면 TBS를 37°C로 가열합니다.<ol>
<li>시술 당일, 얼음에 천천히 해동하고 사용 직전에 실온으로 가져 온다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1:1 비율 알자네이트 용액과 50 mg/mL 피브리노겐 용액에서 혼합을 사용하기 직전 2mL(FA)를 얻을 수 있습니다. 멸균 미세 원심 분리기 튜브에서 혼합물을 부드럽게 소용돌이시다. 거품을 하지 마십시오.</li>
	<li>"인큐베이션 챔버"를 준비하려면 유리 현미경 슬라이드에 파라핀 필름의 얇은 스트립을 적용하십시오. 참고: 사용하기 전에 70% EtOH로 슬라이드를 닦아냅니다. 하나의 배양 챔버는 두 개의 슬라이드로 형성된다. 그들을 분리하려면, 그들 중 하나에 3mm 스페이서를 배치합니다.</li>
	<li>파이펫 7.5 μL은 FA 혼합물을 이 파라핀 필름 코팅 유리 슬라이드에 떨어뜨려 스페이서를 분리합니다. 한 슬라이드 플레이스에 8-10 방울, 두 개의 행으로 배열.</li>
	<li>마이크로피펫, 3-5 개의 COC를 사용하여 성숙 매체 (MM)의 최소 부피 (최대 5 μL)를 사용하여 FA 드롭의 중심에 정확하게 배치합니다. 이 절차는 좋은 수동 기술과 정밀도가 필요합니다. 참고: 성숙 배지(MM)는 DMEM/F12로 구성되어 있으며, 10IU/mL PMSG, 10IU/mL hCG, 10% FBS 및 50% 돼지 여포액(FF)으로 구성됩니다.</li>
	<li>각 FA 드롭에 7.5 μL의 혈전/Ca2+ 용액을 추가하여 커버합니다. 젤이 거의 즉각적으로 형성되기 때문에 혼합 할 필요가 없습니다.</li>
	<li>이전에 준비된 두 번째 유리 슬라이드를 FA 캡슐에 적용하여 인큐베이션 챔버를 덮습니다. 매우 신중하지만 단단한 움직임으로 챔버를 거꾸로 뒤집어 건조를 피하기 위해 촉촉한 필터 종이가 늘어선 100mm 페트리 접시에 놓습니다.</li>
	<li>이어서, 페트리 접시를 약 5-7분 동안 5% CO2 인큐베이터(38°C)로 옮기다. 그 후, FA 캡슐 때문에 피브린과 알기네이트의 동시 젤레이션의 흐린 될 것입니다.</li>
	<li>FA 캡슐을 우물당 100 μL MM을 함유한 96개의 웰 플레이트(웰당 1캡슐)로 옮직합니다. 참고: 형성된 FA 캡슐을 손상시키지 않도록 외과 용 포셉을 사용하여 이 단계를 신중하게 수행하십시오.</li>
	<li>2일마다 MM(50 μL)의 절반을 신선하고 미리 평형된 MM으로 대체합니다. 반전 된 빛 현미경을 사용하여 이미지 COC (10 배율에서). 참고: COC FA 문화에 대한 문화 조건: 38°C, 5% CO2 분위기 및 상대 습도 95%. IVM의 4 일 후에, 하이드로겔은 fibrin 성분의 점진적인 저하 때문에 거의 명확하게 나타납니다. 나머지 알기네이트는 효소적으로 분해되어야 합니다 - 알기네이트-리아제, 특히 알기네이트를 저하시키고 동물 세포에 영향을 미치지 않는 식물 유래 효소에 의해.<ol>
<li>캡슐이 들어 있는 우물에서 MM을 제거하고 DMEM에 IU/mL 알기네이트 리아아제 10μL을 추가합니다. 배양판을 인큐베이터에 25-30분 간 둡니다.</li>
		<li>용존 캡슐에서 COC를 제거합니다. 참고: 이 작업은 절단 파이펫 팁으로 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>신선한 DMEM에서 여러 세척 후, PBS를 포함하는 IVF 접시 (접시 당 5-10 COC)의 내부 링으로 COC를 전송합니다. 지금, 추가 형태학적 또는 생화학 적 분석을 위해 그들을 사용.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 초소수성 불소 에틸렌 프로필렌 (FEP) 미생물 반응기에서 캡슐화.
참고: 모든 IVM 절차가 온도 조절 테이블에서 수행되고 COC가 처리 기간 내내 38°C로 유지되도록 하십시오.
<ol><li>FEP 파우더 침대 평균 입자 크기 1 μm 5g을 함유한 30mm 페트리 접시를 준비합니다. 참고: 신선한 FEP 파우더를 사용하는 것이 중요합니다. 재사용된 FEP는 응집하고 덩어리를 형성하는 경향이 있습니다.</li>
	<li>FEP 분말의 침대에 1.6 단계에서 격리된 3-5개의 COC를 포함하는 MM(~30 μL 볼륨)의 단일 액적을 분배합니다. 이러한 입자가 액체 낙하 및 형성 된 액체 대리석 (LM)의 표면을 완전히 덮었는지 확인하기 위해 원형 모션으로 플레이트를 부드럽게 회전합니다.</li>
	<li>1,000 μL 팁이 있는 파이펫을 사용하여 형성된 LM을 선택합니다. 참고: LM(4-5mm)의 직경을 수용하기 위해 가장자리에 파이펫 팁을 잘라냅니다. 이러한 준비 된 팁의 대략적인 직경은 LM보다 약간 커야합니다.</li>
	<li>60mm IVF 페트리 요리를 준비합니다. 3-4mL의 멸균 수를 외부 고리에 추가하여 습도 챔버를 준비합니다. 다음으로 LM 하나를 중앙 우물에 배치합니다. 참고 : 이 절차는 좋은 수동 기술과 정밀도가 필요합니다 - 대리석이 부주의하게 배치되거나 낮은 높이에서 떨어지면 파괴됩니다.</li>
	<li>5 % CO2 인큐베이터에서 38 °C에서 4 일 동안 구슬을 배양하십시오.<ol>
<li>절차 다음 매일 매체를 변경: 각 LM에 MM의 30 μL을 적용, 직접 액체 접촉 코팅 FEP 분말의 소수성을 방해하기 때문에 확산을 일으킬 것입니다. 대리석 함량이 용해되면 생물 반응기에서 방출된 COC를 페트리 접시에 신선한 MM 한 방울로 옮습니다. 참고: 방출된 COC를 정확하게 전송하려면 폴리카보네이트 마이크로파이프를 사용하십시오.</li>
		<li>FEP 입자를 제거하기 위해 MM(3-4회)에서 여러 번 세차한 후, 30 μL의 신선한 MM로 FEP 파우더 침대에 옮겨 넣습니다. 분말 입자가 액체 낙하의 표면을 완전히 덮고 새로운 LM을 형성하도록 원형 모션으로 플레이트를 부드럽게 회전시킵니다.</li>
		<li>그런 다음 3.3-3.4 단계에서 절차를 따르십시오. 참고: FEP 분말의 투명한 코팅을 통해 가벼운 현미경을 사용하여 LM 함량을 모니터링할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 두 개의 3D 시스템을 사용하여 96-h IVM 절차 후 COC의 특성화
참고: 사용되는 IVM 시스템의 효율성을 결정하기 위해 가벼운 현미경으로 COCs를 형태학적으로 채점합니다. 또한, COC 생존가능성44의분석을 위해 칼세인 AM과 에디듐 호모이머(EthD-1) 염료를 사용한 이중 형광 라벨링을 사용한다.
<ol><li>빛과 형광 현미경 검사에 의해 IVM 후 난모세포의 형태학적 검사.<ol>
<li>38 °C 1x PBS로 CC (FAB를 사용하여 배양에서 파생 된 것과 LM에서 파생 된 COC 모두)를 세척하십시오. 참고: COC의 처리를 용이하게 하고 염색 절차 중에 손상시키지 않도록 하려면 96 또는 48 웰 플레이트를 사용하고 COC를 후속 우물로 이송하여 각 염색 단계를 수행하십시오.</li>
		<li>1.6mM 칼신 AM의 100 μL및 37°C에서 30-45분 동안 5.5mM EthD-1로 배양한다. 두 물질을 1x PBS로 희석합니다. 참고: 이것은 2색 형광 분석이므로 어둠 속에서 이 단계를 수행하십시오.</li>
		<li>인큐베이션 후, PBS에서 COC를 두 번 세척한 다음 형광 단백질과형광염(재료표)의빠른 광표백을 방지하도록 설계된 안티페이드 장착 배지에 담급니다. 참고: 매니큐어로 건조하지 않도록 커버 글래스의 가장자리를 보호합니다.</li>
		<li>공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 염색된 샘플을 시각화합니다. 참고: 두 프로브의 형광을 자극하기 위해 (즉, 칼세인과 에티듐 호모디머-1, EthD-1)는 488nm에 아르곤 레이저를 튜닝합니다. 방출된 형광은 트리플 이크로릭 필터 488/561/633으로 분리된 다음 녹색 필터(calcein)에 대해 505-570 nm로 측정하고 빨간색 필터(EthD-1)의 경우 630-750 nm로 측정됩니다.</li>
		<li>죽은 과립세포의 비율에 따라 공초점 형광 이미징에 기초하여 배양에서 난소 여포에 적용되는 수정된 분류를 사용하여 4가지 범주로 COC를분류한다(35).  V1: 약 100% 실행 가능한 C를 가진 COC; V2: 죽은 CC의 10%를 가진 COC; V3: 죽은 CC의 10-50%를 가진 COC; V4: 죽은 C의 50%를 보유한 COC. 참고 : 기술적으로, 살아있는 죽은 분석과 난모세포의 생존가능성을 평가하기어렵다; 따라서 미토콘드리아 초구조 또는 활성을 분석하여 예를 들어 추정되어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전염 전자 현미경 검사에 의해 IVM 후 난모세포의 초구조체를 검사한다.<ol>
<li>COC를 100 μL 2.5% 글루타랄데히드에서 0.1M 나트륨 코코디레이트 버퍼(pH 7.2, 실온)로 2시간 동안 수정합니다.</li>
		<li>COC를 100 μL 0.1 M 나트륨 코코디레이트 버퍼(하룻밤 4°C)에 침수하고 동일한 버퍼로 헹구는다.</li>
		<li>1시간 동안 0.1M 나트륨 코코디레이트 버퍼(실온)에서 1% 오스뮴 테트산화물을 함유한 엽서 COC를 후퇴한다.</li>
		<li>우란아액아테이트(1%)에 염색한 후, 에탄올 희석제(50%, 60%, 70%, 90%, 100%) 증가하는 시리즈에서 탈수된 COC가 실온에서 하룻밤 동안 침투한 후, 두 번의 짧은 수지 변경이 뒤이어 LR 화이트에 포함시됩니다.</li>
		<li>다음으로, 메틸렌 블루/azure II로 시료를 지향하고 평가하기 위해 반박형 섹션(1 μm)을 염색한다.</li>
		<li>마지막으로 TEM을 통해 초구조적 수준에서 초박하고 이중으로 얼룩진 섹션을 검사합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

체외 성장뿐만 아니라 난소 세포를 둘러싸고 동시에 성숙을 지원하는 능력은 성공적인 보조 생식 기술과 특히 인간이나 돼지와 같은 장기간 여포 성장을 겪고있는 종에서 체세포 / oocyte 상호 작용에 대한 이해를 증진하는 데 매우 중요합니다. 지속적으로 향상된 IVM 기술은 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 조기 난소 실패, 또는 결정적인 불임 (종양 요법)의 경우에 생식 옵션을 보존하는 유용한 도구가되고있다. 또한, 특정 난소 기능 장애는 변이 조절 된 여포 성장에 의해 발생할 수 있기 때문에, 난소 세포의 적절한 개발을 제어하는 분자 및 세포 메커니즘을 이해하는 것은 이러한 조건의 병리 생리학 및 합리적인 치료에 중요한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. IVM 동안 COC 3D 아키텍처의 유지 관리를 지원하는 체외 배양 시스템은 매트릭스 또는 생물 반응기 내부에 캡슐화 단계가 필요합니다. 이 작품은 돼지 난모세포의 문화에 적용할 수 있는 프로토콜을 설명합니다. 여기에 제시된 체외 배양 시스템은 모두 사용자 친화적이며 난낭 세포 ...

3차원(3D) 시스템을 포함한 다양한 문화 시스템의 개발은 개발 초기 단계인 여포로부터 분리된 난모세포의 성장과 성숙을 위한 최적의 조건을 제공하는 것을 목표로 하고 있습니다. 이는 특히 암치료후 불임으로 어려움을 겪고 있는 여성의 수가 증가하고 있다는 점에서 보조 생식 기술(ART)에 매우 중요합니다. 체외 조건에서 난모세포의 성숙 (IVM)은 이미 가축 재생을 목적으로 체외 배아 생성에 주로 사용되는 잘 확립 된기술이다 2. 그러나, 대부분의 포유류 종에서는 적혈구-난낭체 복합체(COC)의 성숙률이 높더라도 달성할 수 있다(범위 60~ 90%)3,그들의 발달 능력은 여전히 필요에 부적당하다. 이는 발아세포 단계까지도 그런 방식으로 얻어진 자고테의 발달이 낮고 대리동물로 옮겨진 후 용어에 대한 생존능력이 감소하기 때문이다. 따라서, IVM 시술4를받은 난모세포로부터 얻어진 배아의 발달 능력을 증가시킬 필요가 있다. 따라서, 새로운 성숙배지(5)가 고안되고 있으며, 다양한 성장인자와 분자를 가진 배양매체의5 보충과 함께8,6,,7, 7의 시험관내 배양문화가 시험되고있다.
완전한 IVM 시스템의 첫 번째 단계는 체외 문화 동안 난모세포의 지속 가능한 성장을위한 최적의 조건을 만드는 것입니다. 난소 세포 성장은 meiosis10,,11을재개하는 oocyte의 능력의 특정 지표 중 하나입니다. 또한, 체외 배양 시스템의 적절한 난모세포는 핵 성숙과 세포질분화(12)를지원할 수 있어야 한다. 적혈구-오낭복합체의 형태는 인간과가축(12,,13)에서체외 수정(IVF) 절차의 후속 단계에 가장 적합한 난피티를 선택하기 위해 ART 클리닉에서 사용되는 또 다른 중요한 지표이다. 고려 된 COC의 형태학적 특성 중 에는 난십성 직경, 세포질 과립 및 최초의 극지 체 무결성14,15. 게다가, 난소 세포 발달 잠재력은 나낭세포를 둘러싼 적수 세포의 외관 그리고 다짐 및 수와 상관관계가 있습니다. 체외 배양 시스템에서 적절한 난낭체에 매우 중요한 것은 또한 난퀴트-적혈구 세포의 유지보수가 적절한 상호작용및 세포골격안정성(16,,17,,18,,19)이다. 지금까지, 인간 COC 내의 체외 난십성장은20을입증되었다. 소 COC의 사용은 또한 살아있는 출생으로 귀착되었습니다. 이들은 미숙한 난소 여포에서 격리된 다음 14일 동안 배양되어 난소가 IVF절차(21)를겪을 수 있는 충분히 커졌다. 유사하게, 개코원숭이 개성적인 여포로부터 분리된 COC는, 체외 배양 후 IVM을 실시하여 정상적인 스핀들구조(22)를가진 대사 II 단계에 메이오시스를 재연할 수 있는 난모세포를 산출하였다. 그러나, 이 연구에서 저자는 그들을 비옥하 하려고 하지 않았다. 그럼에도 불구하고 이러한 결과는 유사한 절차가 이러한 특정 포유류 종뿐만 아니라 성공적인 IVF 기술에 적합한 양질의 난동을 얻을 수 있어야 할 여포에서 얻은 인간의 적혈구 -oocyte 복합체에 적용 될 수 있음을 나타냅니다.
상기 설명된 결과는 2차원(2D) 시스템에서 난모세포가 배양되는 동안 기존의 IVM 프로토콜의 적용으로 얻어졌다. 2D 배양 시스템의 일상적인 절차는 미네랄 오일23,24와함께 적절한 배양 매체의 한 방울에 침지 된 난모세포를 다루고 있습니다., 체외 내 분피 배양 중 오일 오버레이는 액체 증발을 방지하여 배양시 적절한 pH 및 삼투압의 유지를 보장하는 역할을 한다고 가정합니다. 이러한 2D 배양 시스템은 성숙한 돼지난우세포(25)의87%까지도 얻을 수 있지만, 미네랄 오일 오버레이가 적절한 난소세포 개발에 필요한 지질 용해성 물질의 상당한 확산을 야기한다는 것이입증되었다(26) 또한, 스테로이드(황체호르몬 및 에스트로겐) 난모세포 배양 시 미네랄 오일로 확산되기 때문에, 돼지 난모세포의 개발 능력 달성의 핵 성숙 및 감소가 관찰되었다. 이로 인해 소수의 zygotes를 획득할 수 있으며, 이는 또한 배반물의 단계에 낮은 발달 능력을 특징으로 하며, 수령인동물(27)으로이송된 후 생존력이 떨어지는 것을 특징으로 한다. 따라서, IVM 시술 후에 수신된 난모세포에서 유래된 배아의 발달 능력을 높이기 위한 시도가 이루어지고 있으며, 특히 3차원(3D) 시스템을 사용하여 복잡한 C와 함께 배양된 난모세포의 세포질 및 핵 성숙도를 달성하기 위한 최적의 조건을 조성함으로써, 특히 3차원(3D) 시스템을 사용하고 있다. 다양한 혁신적인 체외 배양 시스템은 지난28년,29년에개발되었다.28 이들은 세포의 자연적인 공간 조직을 유지하고 전통적인 2D 문화권에서 달성할 수 없는 문화 접시에서 그들의 평탄화를 피하기 위하여 디자인되었습니다. 배양된 COC의 구조적 및 기능적 활동은 다양한구획(30)의간격 접합을 통해 적절한 아키텍처와 방해받지 않는 통신의 유지보수에 의해 보장될 수 있다. 적수-오사이클 복합체의 체외 배양3D에 대한 바이오 스캐폴드의 적합성은 세포외 매트릭스(ECM; 콜라겐 및 히알루론산)31 또는 불활성 중합체(alginate)32의다양한 성분과 같은 천연 생체 물질을 사용하여 평가되었다. 여러 종에서 테스트 이러한 시도는 oocyte meiosis 재개 및 그들의 전체 능력의 성취의 측면에서 유망한 결과를 가져왔다33,,34,,35. 그러나 지금까지 돼지를 포함한 대형 국산 동물으로부터 분리된 COC 성숙에 적합한 3D 시스템은 개발되지 않았습니다.
이 작품은 돼지 COC의 3D 문화에 사용할 수있는 두 가지 프로토콜을 설명합니다. 첫 번째 프로토콜은 피브린 알기네이트 구슬(FAB)의 캡슐화를 설명합니다. FAB는 동기적 젤화 과정을 거치는 알기네이트 및 피브린 용액을 동시에 혼합하여 형성될 수 있다. 이 조합은 두 구성 요소 모두 매트릭스 강성에 기여하기 때문에 동적 기계적 환경을 제공합니다. 마우스 난소 여포 문화와 성숙(36)에대해 유사한 해결책이 이전에 사용되었습니다. 제시된 프로토콜의 경우, 알기네이트-피브린 네트워크의 조기 분해를 피하기 위해, 염화칼슘 용액의 농도가 적절히 높아 빠르고 안정적인 겔화 과정을 보장한다. 역동적인 기계적 환경은 COCs가 상주하고 크기가 증가하는 자연적인 여포 내 환경에서 이와 유사한 조건을 만듭니다. 또한, 이 작품은 이들 중간 의 한 방울에 일시 중단되고 불소 에틸렌 프로필렌 (FEP; 헥사플루오로 프로필렌과 테트라 플루오로로틸렌) 분말 입자로 캡슐화되는 COC 3D 배양 시스템의 대표적인 결과를 보여 주며 미생물 반응기 (액체 대리석, LM)를 형성합니다. LM은 이전에 살아있는미생물(37),종양 스페로이드(38) 및 배아 줄기세포(39)의 성장을 지원하는 것으로39나타난 3D 생물반응기의 한 형태이다.38 LM은 양 오사이클배양(40)에도성공적으로 사용되었습니다. LM을 이용한 대부분의 실험에서, 생물반응기는 1 μm41의입자 크기로 폴리테트라플루오로로틸렌(PTFE) 분말 침대를 사용하여 제조하였다. 제시된 프로토콜은 FEP를 사용하며, 이는 플루오로폴리머 PTFE에 대한 조성 및 특성에서 매우 유사하다. 그러나 FEP는 PTFE보다 더 쉽고 부드럽고 특히 중요한 것은 매우 투명합니다.
두 3D 시스템은 체외 배양 환경에서 기체를 유지합니다. 그(것)들은 또한 그들의 편평하고 간격 접합의 결과로 중단을 방지하고, oocyte와 주변 여포 세포 사이 그들의 기능적인 관계를 보존하여 COCs 3D 조직을 유지합니다.

<table><tbody><tr><td><강>일반</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>항생제 항진균제(100x) 100ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td>처리 매체에 대한 2.5% 최종 농도. PBS 중 1%(단계 1.2)</td></tr><tr><td>DMEM/F12(500ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8062</td><td>취급 및 숙성 매체</td></tr><tr><td>DPBS(Ca, Mg 제외), 1x, 500ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FCS (100 ml)</td><td>Thermo Fisher</td><td>16140063</td><td>Handling Medium과 Maturation Medium 모두에 대해 10%의 최종 농도를 제공합니다. (단계: 1.5. 2.6.)</td></tr><tr><td>PBS(1x, pH 7.4) 500ml</td><td>Thermo Fisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>TBS 스톡 솔루션(10x, pH 7.4) 500ml</td><td>케이맨 화학 물질</td><td>600232</td><td>1x 최종 농도. 다른 브랜드는 사용</td></tr> <tr><td>< 강> 성숙 매체 < / 강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>hCG (10 000 U의 1 바이알)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>CG10</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>BioVendor</td><td>RP1782721000</td> < 강> 피브린 - 알긴산 비드 < <td></td></tr><tr><td>/ 강 ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>알긴산 리아제</td><td>시그마 알드리치</td><td>A1603</td> <td>(단계 2.11.1)</td></tr><tr><td>트롬빈</td><td>시그마-알드리치</td><td>T9326-150UN(</td><td>2.1단계)</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>C5670</td><td>(2.1단계)</td></tr><tr><td>피브리노겐(250mg)</td><td>시그마-알드리치</td><td>F3879</td><td>(2.2단계)</td></tr>알<tr><td>긴산나트륨</td> 시<td>그마-알드리치</td><td>W201502</td>(<td>2.3단계) 알긴산 용액에 사용</td></tr><tr><td><강>액체 대리석</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FEP</td><td>Dyneon GmbH 3M AdMD</td><td>A-66670</td><td></td></tr><tr><td>Morphological examination</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, 포유류 세포용</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3224</td><td>(Step 4.1.) 방출 형광: 칼세인의 경우 494nm, EthD-1의 경우 528nm; 측정: 칼세인의 경우 517nm, 617nm - EthD-1</td></tr><tr><td>VECTASHIELD 페이드 방지 장착 매체</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>장착 매체</td></tr><tr><td><강>초미세 구조 검사</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td>2.5% 최종 농축기(단계 4.2.1.)</td></tr><tr><td>LR 백색 수지</td><td>시그마 Aldrich</td><td>L9774</td> <td>(단계 4.2.4.)</td></tr><tr><td>메틸렌 블루</td><td>시그마-알드리치</td><td>M9140</td><td>(단계 4.2.5.)</td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>O5500</td><td>(단계 4.2.3.)</td></tr><tr><td>나트륨 카코딜레이트 트리하이드레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>C0250</td><td>0.1M 소듐 카코딜레이트 완충액(pH 7.2)</td></tr><tr><td>우라닐 아세테이트</td><td>POCH</td><td>868540111</td> 제조에 사용<td>(단계 4.2.4.)</td></tr><tr><td>< 강력> 특정 기기, 도구 < / 강력 ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>30 mm Pteri 접시</td><td>TPP</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>60 mm IVF 페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>353653</td><td></td></tr><tr><td>Ez-Grid 프리미엄 세포 처리 피펫터</td><td>RI Life Sciences</td><td>8-72-288</td><td></td></tr><tr><td>Ez-Tip</td><td>RI Life Sciences</td><td>8-72-4155 / 20</td><td></td></tr><tr><td>가열 테이블</td><td>SEMIC</td><td></td><td>다른 브랜드는 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AIC-PE</td><td>다른 브랜드는 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>멸균 페트리 접시 (10cm)</td> <td>NEST 생명 공학</td><td>704002</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &micro의 멸균 주사기 필터; m</td><td>GOOGLAB SCIENTIFIC</td><td>GB-30-022PES</td><td></td></tr><tr><td>보온병</td><td>케추아</td><td>5602589</td><td>다른 브랜드도 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

포르신 오시테 캡슐화를 위한 프로틸분해 된 알기네이트 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

생식 생물학에서 인공 수정 및 배아 전달 기술로 시작된 생명 공학 혁명은 체외 성숙 (IVM), 체외 수정 (IVF) 및 체세포에서 핵 전송에 의한 국산 동물의 복제와 같은 보조 생식 기술의 개발로 이어졌습니다. IVM은 특히 중요한 방법입니다. 상업적으로 중요하거나 멸종 위기에 처한 종의 생성 간격 의 감소, 체외 인간 생식에 관한 연구, 세포 치료를 위한 형질 전환 동물의 생산 과 같은 응용 분야에 대한 성숙하고 양질의 난모세포의 공급을 위한 플랫폼 기술입니다. 난모세포 품질이라는 용어에는 성숙을 완료하고 수정되어 건강한 자손이 될 수 있는 능력이 포함됩니다. 이것은 좋은 품질의 난모세포가 IVF 절차를 포함하여 성공적인 수정을 위해 가장 중요하다는 것을 의미합니다. 이것은 인간 난모세포의 뿐 아니라 또한 그밖 큰 포유류 종의 성장을 지원하는 믿을 수 있는 문화 방법을 개발하는 많은 어려움을 제기합니다. IVM의 첫 번째 단계는 난모세포의 체외 배양입니다. 이 작품은 돼지 난모세포의 3D 문화에 대한 두 가지 프로토콜을 설명합니다. 첫 번째, 3D 모델 적혈구-oocyte 복합체(COC)는 피브린-알기네이트 비드 상호 침투 네트워크에 캡슐화되어 피브린과 알기네이트의 혼합물이 동시에 겔화된다. 두 번째 하나에서, COC는 액체 대리석 (LM)으로 정의 된 미생물 반응기를 형성하기 위해 응소 에틸렌 프로필렌 (FEP; 헥사 플루오로 프로필렌과 테트라 플루오로로틸렌의 합합체) 분말 입자로 캡슐화 된 중간 방울로 중단됩니다. 두 3D 시스템은 체외 배양 환경에서 기체를 유지합니다. 또한 COC 3D 조직을 유지하여 수축및 갭 접합의 결과적으로 중단을 방지하여 난소 세포와 주변 여포 세포 사이의 기능적 관계를 보존합니다.

두 IVM 시스템을 모두 사용하는 COC에서, 과립 세포는 서로 단단히 부착하고, 복구 된 COC의 대부분은 적혈구 세포의 그대로 층을 가졌다(그림 1A, B). 추가적으로, 적수 세포의 상당한 비율이 유지되었다.
COC 생존가능성 분석에서 얻은 결과는 두 시스템이 시험관내 조건에서 3D에서 돼지 난우세포의 캡슐화를 위해 적용된 것이 최적의 성장 조건을 보장하는 것을 확인하였다(그림2). 두 그룹에서는 V1 = 13 %, V2 = 87 % FAB 및 10 % V1, LM의 경우 90 % V2만 관찰하였다(표1).
전염 전자 현미경 검사법(TEM)에 의해 관찰된 미토콘드리아는 난모세포로 균등하게 분포되었고, IVM 후 의 형상은 쉘과 같은<sup class="xref...

여기에 제시 된 3D 문화 조건에서 돼지 난모세포의 캡슐화를위한 두 가지 프로토콜이 있습니다. 첫 번째, 적수-oocyte 복합체 (COC) 피브린-알자네이트 구슬에 캡슐화 된다. 두 번째, 그들은 불소 에틸렌 프로필렌 분말 입자로 동봉되어 (미생물 반응기). 두 시스템 모두 최적의 조건을 통해 3D 조직을 유지관리합니다.

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

돼지 난모세포의 캡슐화를 위한 이 프로토콜은 COC의 구형 조직을 유지할 수 있게 합니다. 이것은 난모세포와 주변 여포 세포 사이 간격 접합의 그들의 평평하고 그 결과로 중단을 방지합니다. 두 설명 된 프로토콜의 주요 장점은 사용자 친화적이며 oocyte 및 화학 세포 생존모두의 효과적인 제어를 허용하는 것입니다.두 배양 시스템은 생식 생물학의 기본 연구를 위한 귀중한 도구이며, 향상된 불임 처리를 위한 임상 관련성이 있을 수 있습니다. 또한 새로운 생명 공학 방법 개발 및 가축 개선을 위해 신청할 수 있습니다. 난소를 헹구고 HM 매체로 채워진 비커로 옮기고 후속 조작 중에 섭씨 38도의 인큐베이터에 보관하십시오.큰 돼지 여포에서 여포 액을 흡습하고 원심분리기는 실온에서 10 분 동안 100 배 G로 흡입합니다. 이어서, 0.2마이크로미터 멤브레인 모공 필터에 부착된 멸균 주사기를 사용하여 상체를 걸러내고, 음의 80°C로 동결한다. 중형 여포에서 COC를 분리하려면 2~3개의 난소를 HM으로 채워진 멸균 10센티미터 페트리 접시로 옮기습니다. 돌출난소 여포의 표면을 멸균 수술 번호 15 블레이드로 부드럽게 잘라 여포 액과 COC가 페트리 접시로 흘러 나갑니다.일회용 주사기에 부착된 28 게이지 바늘로 여포 내용을 흡인하고 다른 페트리 접시로 옮킨다. IVF 페트리 요리를 준비하려면 중앙 우물에 HM 1 밀리리터를 추가하고 외부 고리에 3~4방울의 HM을 배치합니다. 그런 다음 폴리카보네이트 마이크로파이프를 사용하여 손상되지 않은 COC를 외부 고리에 HM을 떨어 뜨리고 3~4회 간단히 헹구는 다.완료되면 개별적으로 중앙 우물로 옮기. 인큐베이터에 IVF 플레이트를 저장합니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 혈소판 및 피브리노겐 솔루션을 준비합니다.시술 당일, 얼음에 피브리노겐 용액을 천천히 해동하고 사용하기 직전에 실온으로 가져옵니다. 0.5% 알자네이트 용액과 피브리노겐 용액을 1 대 1 비율로 혼합하여 최종 부피 2 밀리리터를 원량화하고 혼합물을 부드럽게 소용돌이시다. 유리 현미경 슬라이드에 파라핀 필름의 얇은 스트립을 적용하여 배양 챔버를 복구합니다.파이펫 7.5 마이크로리터 는 분리 스페이서와 파라핀 필름 코팅 유리 슬라이드에 FA 혼합물의 7.5 마이크로 리터 방울, 두 행에 배치 8 ~ 10 방울을 배치. 마이크로파이프를 사용하여 3~5개의 COC를 FA 드롭의 중심으로 전송하고 최소 용량의 성숙 배지를 사용합니다. 각 FA 드롭 위에 7.5 마이크로리터의 혈소판을 추가하여 커버합니다.젤이 거의 즉각적으로 형성되기 때문에 혼합 할 필요가 없습니다. 이전에 준비된 유리 슬라이드로 인큐베이션 챔버를 덮은 다음 챔버를 거꾸로 뒤집어 촉촉한 필터 종이가 늘어선 100mm 페트리 접시에 놓습니다. 페트리 접시를 5~7분 동안 섭씨 38도의 이산화탄소5%에 넣습니다.인큐베이션 후 각 FA 캡슐을 성숙 배지 100마이크로리터를 함유한 96웰 플레이트의 우물로 옮기다. 매 2일마다 매체의 절반을 신선한 미리 평형된 성숙 매체로 교체하십시오. 이미지 COC는 10배배율로 반전된 광 현미경을 사용하고 있다.4일 동안 COC를 배양한 후, 우물에서 성숙 배지를 제거하고 DMEM에서 밀리리터 대지 용해물당 10개의 국제 유닛 100마이크로리터를 추가합니다. 배양판을 인큐베이터에 25~30분 간 둡니다. 용존 된 캡슐에서 COC를 제거합니다.DMEM에서 여러 번 세척한 다음 PBS가 함유된 IVF 접시의 내부 링으로 옮겨 넣습니다. 30mm 페트리 접시에 FEP 파우더 5그램을 신는다. FEP 분말에 3~5개의 COC를 함유한 성숙 배지의 단일 액자를 분배한다.입자가 액체 방울의 표면을 완전히 덮고 액체 대리석을 형성하도록 원형 동작으로 부드럽게 회전하거나 LM. 60mm IVF 페트리 접시를 몇 개 준비하고, 외부 고리에 멸균 물의 3 ~4 밀리리터를 추가하여 습도 챔버를 만듭니다. 1000 마이크로리터 파이펫으로 형성된 LM을 집어 중앙 우물에 놓습니다.5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 38도에서 4일간 구슬을 배양합니다. 매체를 변경하려면 각 LM에 성숙 배지 30 마이크로리터를 적용하여 확산됩니다. 대리석 내용이 녹으면 바이오 반응기에서 방출된 COC를 페트리 접시에 신선한 성숙 매체 한 방울로 옮기습니다.성숙 배지에서 3~4개의 세차후, COC를 신선한 배지 30마이크로리터와 함께 FEP 파우더 침대에 옮겨 보세요. 분말 입자가 액체 낙하의 표면을 완전히 덮고 새로운 LM을 형성하도록 원형 모션으로 플레이트를 부드럽게 회전시키고 LM을 IVF 페트리 접시로 옮킵니다. 두 시험관 성숙 시스템은 서로 단단히 부착된 과립세포와 적혈구의 손상되지 않은 층을 가진 COC를 생산하였다.COC 생존 가능성 분석은 두 캡슐화 시스템에서 최적의 성장 조건을 달성했다는 것을 확인했습니다. 두 그룹 모두에서 높은 생존성 난모세포 사이트만 관찰되었습니다. 난모세포는 전염 전자 현미경으로 이미지되었다.미토콘드리아는 고르게 분포되어 껍질 모양이 있었다. 그들 중 극소수만이 길었고, 그들의 군집은 산발적으로 관찰되었다. 내피 성 망상은 미토콘드리아와 연관되었거나 난소 세포질에서 무료였습니다.액체 방울은 작고 어둡고 둥근 구조물로 나타났으며 골기 장치는 팽창 된 시스테네로 나타났습니다. 배양실에서 배양판으로 FA 캡슐을 옮길 때와 형식 LM을 집어 들고 IVF 페트리 접시로 옮길 때 정확하고 주의해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

3D 섬유소 - 알지네이트요 interpenetrating 네트워크에 난소 대과의 캡슐에 대한 새로운 방법을 설명합니다. 이 시스템은 성숙 oocytes을 만들어 미숙 모공의 개발을 지원하기 위해 proteolytic 저하로 구조적 지원을 결합한 제품입니다. 이 방법은 확장을 제한하지 않고 세포 세포 접촉을 유지하기 위해 문화 셀 집계에 적용될 수 있습니다.

Proteolytically 분해 3 차원 시스템에서 난소 대과의 캡슐화 및 문화에 대한 방법

그들의 입체적인 맥락에서 정상 세포의 문화 세포 변형 및 tumorigenesis에 필요한 초기 이벤트를 연구하는 다른 방법을 나타냅니다. 이 방법은 난소암 형성 초기에 이벤트를 연구 정상 난소와 oviductal 세포를 성장하는 데 사용됩니다.

난소와 Oviducts의 3 차원 조직 문화 알긴산의 Hydrogels

다음 섹션에서 우리는 생명 의학 애플 리케이션에서 사용할 수 알지네이트요 microspheres의 준비 절차를 설명합니다. 우리는 특히 1 형 당뇨병에 대한 잠재적인 치료로서 세포 및 단백질 캡슐의 이중 목적 multilayered 알지네이트요 microspheres를 만들기위한 기술을 설명합니다.

바이오 메디컬 응용 프로그램을위한 알긴산 Microspheres의 생성

이 동영상은 3D 배양을 확립하기 위해 돼지 적운-난모세포 복합체(COC)를 피브린-알긴산 비드에 캡슐화하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 체외 성숙 시스템은 정상적인 세포 간 통신을 유지하여 난모세포 성숙을 보장하고 생존력을 유지합니다.

돼지 COC의 3D 배양: 피브린-알긴산 고분자 하이드로겔 비드에서 적운 난모세포 복합체를 캡슐화하는 절차

이 비디오에서는 소수성 미생물반응기에서 돼지 난모세포를 캡슐화하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

Liquid Marble Microbioreactor 시스템: 돼지 난모세포 캡슐화를 위한 3D 배양 프로토콜

우리는 동축 노즐을 사용하여 만능 줄기 세포(PS 세포)를 알기네이트 하이드로겔 캡슐에 캡슐화하는 방법을 확립했습니다.  이는 세포가 과도하게 응집되는 것을 방지하고 현탁 배양에서 세포가 겪는 전단 응력을 제한합니다.  이 기술은 PS 세포의 대량 생산과 줄기 세포 틈새 시장에 대한 연구에 적용할 수 있습니다.

동축 노즐을 사용하여 다 능성 줄기 세포의 알긴산 캡슐화

폴리 (N- 이소 프로필 아크릴 아미드) - -graft 콘드로이틴 설페이트 이루어지는 주사 조직 공학적 지지체는 (PNIPAAm-g-CS) 함유 알긴산 미립자를 제조 하였다. 속성 및 생체 적합성 시험 관내에서 팽윤 접착력은 본 연구에서 분석된다. 여기서 개발 된 특성화 기술 thermogelling 다른 시스템들에 적용 할 수있다.

조직 공학 알긴산 미세 입자와 Thermogelling 폴리 (N- 이소 프로필) -graft - 콘드로이틴 황산 복합 재료의 합성

예를 들어 L-크실 로스를 생산하여 보조 인자 재생 및 재사용을위한 개선 된 공동 고정화 전체 세포 생체 촉매에 대한 프로토콜이다 선보였다. 보조인 재생 기능적 상보 효소 발현이 대장균 균주를 결합함으로써 달성된다; 전체 세포 생 촉매 고정화 칼슘 알기 네이트 비드에 세포 캡슐화함으로써 달성된다.

공동 인자 재생 및 개선 재사용에 대한 알긴산 구슬의 다중 생체 촉매의 고정화

이 동영상과 원고는 단순 교반 용기를 사용하여 큰 배치로 생산할 수있는 0.5 % ~ 10 % 알긴산 염 비즈로 포유류 세포를 캡슐화하는 유제 기반 방법을 설명합니다. 캡슐화 된 세포는 시험 관내에서 배양 되거나 세포 치료 응용을 위해 이식 될 수 있습니다.

간단한 교반 용기를 사용하여 알긴산 염 비즈에서 포유류 세포 캡슐화

본 프로토콜은 단일 에멀젼 제형 기반 facile 미세 유체 기술을 통해 폴리 (락틱-코-글리콜 산) 기반 고도로 개방 된 다공성 미세 구체 (HOPM)의 제조를 설명합니다. 이 마이크로스피어는 조직 공학 및 약물 스크리닝에 잠재적으로 응용될 수 있습니다.

미세유체 기술을 통한 고도로 개방된 다공성 마이크로스피어(HOPM) 제작

우리는 시험관 내 배우자 형성을 보완하는 새로운 스캐폴드가 없는 아가로스 곰팡이에서 난소 난포를 배양하는 방법을 설명합니다.

스캐폴드 프리 마우스 난소 난포 배양을 위한 맞춤형 아가로스 몰드의 생산 및 사용

배우세요 돼지 난포세포 복합체(COC)를 섬유소-알기네이트 비드와 FEP 분말로 캡슐화하여 3D 구조를 유지하고 생존율을 높이는 방법을. 생식생물학 연구와 불임 치료에 활용할 수 있습니다.

포르신 오시테 캡슐화를 위한 프로틸분해 된 알기네이트 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기

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