Name: 항생제 치료 모기를 가진 세균성 구강 먹이 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: 배우세요 항생제 처리 모기의 장내 세균 분리 및 재도입 방법을 통해 숙주 생리에 미치는 미생물 영향을 분석하는 기술입니다. 이 연구는 질병 매개체 관리 전략에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(81902094, 81600497)과 후난성 과학 기술 계획 프로젝트(2019RS1036)의 지원을 받았습니다.

1. 미드구트 해부 및 재배 가능한 박테리아 격리
<ol><li>해부를 위해 모기를 준비하십시오.<ol>
<li>모기를 수집 7-9 아스피라기와 출현 후 일. 수집된 모기를 3-5분 동안 4°C의 온도로 조절하여 마취하고 해부전까지 얼음차가운 페트리 접시에 모기를 마취시합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>실험실 기기와 모기 표면을 살균합니다.<ol>
<li>실험 벤치를 살균하고, 현미경, 집게 및 유리 슬라이드를 75% 에탄올을 분사하여 환경으로부터 박테리아에 의한 오염을 방지합니다.</li>
		<li>멸균 1x 인산완충식식염(1x PBS)을 함유한 멸균 페트리 접시와 페트리 접시 2개를 함유한 멸균 페트리 접시를 준비한다.</li>
		<li>표면에 살균하여 모기를 75% 에탄올로 3분 동안 담그고 흔들어서, 에탄올이 해부된 장 식물에 영향을 미치는 경우 1x PBS 버퍼로 두 번 헹구는다.</li>
	</ol></li>
	<li>모기 미드구트를 해부합니다.<ol>
<li>표면 멸균 모기를 멸균 1x PBS 버퍼한 방울로 유리 슬라이드에 옮기. 해부 현미경으로 해부.</li>
		<li>해부 현미경의 하부 배율하에서, 조심스럽게 탈출을 방지하기 위해 모기의 다리, 날개 및 머리를 제거합니다. 모기의 마지막 소미트를 직접 절단하여 제거하여, 그것을 당기기보다는, 파손에서 소화관을 방지하기 위해.</li>
		<li>모기의 흉부와 복부의 끝을 집게로 고정하십시오. 모기의 소화관을 부드럽게 꺼냅니다. 취득한 소화관에는 보통 작물, 전구, 미드구트, 힌구트 및 말피기히안 튜브가 포함되어 있습니다.</li>
		<li>해부 현미경을 더 높은 배율로 조정합니다. 모기의 미드구트를 얻기 위해 해부 소화관에서 작물, 전동, 힌구트, 말피기히안 튜브를 제거합니다.</li>
		<li>작물이 팽창하고 모기가 설탕 식사를 한 후 미드구트와 유사하기 때문에 작물을 제거하는 동안주의하십시오. 길고 얇은 배설관 그룹인 말피기히안 튜브는 미드구트와 힌구트 사이의 경계에 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>창 자 박테리아를 분리.<ol>
<li>해부된 미드구트를 멸균 1.5mL 튜브에 멸균 1x PBS 버퍼 200 μL로 전달합니다.</li>
		<li>멸균 유봉으로 멸균 벤치에 미드구트를 완전히 갈아 버퍼에 장내 세균을 완전히 방출할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>직렬은 동종모를 10배 희석 3개로 희석합니다. LB(루리아 국물) 한마판에 각 희석의 50μL을 추가한 다음 접시에 펴놓습니다. 미드구트가 높은 농도의 장내 식물을 함유하고 있다면, 단일 식민지를 골라내기 위해 더 많은 직렬 희석을 하는 것이 필수적입니다.</li>
		<li>단일 식민지가 보일 때까지 플레이트를 37°C에서 1-2일 동안 배양합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>종 식별<ol>
<li>단일 콜로니를 선택하고 LB 국물 배지 의 50 mL을 포함하는 150 mL 원추형 플라스크로 각각 접종한다.</li>
		<li>하룻밤 사이에 37 °C에서 박테리아를 흔들어.</li>
		<li>세균성 게놈 DNA 추출 키트에 의해 총 DNA를 추출합니다. 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의한 16S rDNA 증폭. 참고: 16S rDNA에는 여러 세그먼트가 보존됩니다. 이러한 보존 된 지역에 따라 박테리아에 대한 보편적 인 프라이머는 모든 박테리아의 16S rDNA 조각을 증폭하도록 설계 될 수 있습니다. 이들 프라이머는 박테리아에 특이적이며, 16S rDNA의 가변 영역의 차이는 상이한 박테리아를 구별하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 16S rDNA는 세균성 식별을 위해 널리 사용된다.</li>
		<li>아가로즈 젤 전기포고및 상업용 젤 회수 키트에 의해 PCR 제품에서 DNA 조각을 복구하고 정화합니다.</li>
		<li>정제된 DNA 단편에 DNA 시퀀싱을 수행하여 세균성 유전자 서열을 얻습니다.</li>
		<li>GenBank에서 제공되는 세균 성 서열과 16S rRNA 유전자 서열을 비교합니다. 박테리아 및 고고학 데이터베이스를 선택합니다. 참고: 종 수준에 대한 식별은 가장 가까운 GenBank 항목에 대한 ≥99% 16S rDNA 서열 유사성으로 정의되었다. 분리는 16S rDNA 서열 유사성이 &99% 및 ≥95%였을 때 해당 속에 할당되었다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 항생제 치료 및 박테리아 재도입
<ol><li>항생제 용액을 준비합니다.<ol>
<li>필요한 양의 자당, 페니실린 및 연쇄 절제술을 계량하여 mL당 페니실린 20 단위 및 20 μg의 연쇄상 구균을 포함하여 10 % 자당 용액을 준비합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>항생제 용액으로 모기에게 먹이를 주세요.<ol>
<li>모기를 4°C에서 3-5분 동안 마취시화합니다. 모기를 종이 컵으로 옮기습니다. 거즈로 상단을 덮고 모기가 탈출하지 못하도록 테이프로 거즈를 감습니다.</li>
		<li>멸균 면공을 항생제 용액에 담그고 모기컵에 조심스럽게 넣습니다. 모기가 떨어지는 면공에 익사하는 것을 방지하기 위해 사용하기 전에 면공을 짜내세요.</li>
		<li>수분 증발을 방지하기 위해 10cm 페트리 접시로 면공을 덮습니다. 면봉을 하루에 두 번 교체하여 3일 연속 교체합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>항생제 치료의 효과를 확인합니다.<ol>
<li>위의 방법에 따르면 항생제 치료 모기의 미드구트를 해부하십시오.</li>
		<li>해부된 미드구트를 멸균 1.5mL 튜브에 멸균 1x PBS 버퍼 200 μL로 이송합니다.</li>
		<li>멸균 유봉으로 멸균 된 벤치에서 미드구트를 완전히 갈아서 완충제에 장내 세균이 완전히 방출되도록하십시오.</li>
		<li>세균성 게놈 DNA 추출 키트에 의해 창자 미생물 DNA를 추출합니다.</li>
		<li>범용 유박테리아 프라이머(16S rRNA F: TCCTACGGGAGGCAGAGCAGT 및 R: GGACTACCAGGTATCTAATCCTGTT)를 사용하여 게놈 DNA에 대한 실시간 정량적 PCR(qPCR)에 의한 세균수량을 수행한다.</li>
	</ol></li>
	<li>세균 현탁액 준비<ol>
<li>분광계로 세균용 용액을 측정합니다. 1mL 튜브에 OD(OD600) 세균 현탁액 1개추가. 4°C에서 5분 동안 5,000 x g의 현탁액을 원심분리합니다.</li>
		<li>상체를 폐기하고 정지 침전을 위해 1.5mL 튜브에 멸균 1x PBS 버퍼1mL을 추가합니다.</li>
		<li>원심분리기에서 5,000 x g에서 5분 동안 4°C; 상부체를 폐기합니다.</li>
		<li>2.4.2 및 2.4.3 단계를 반복합니다.</li>
		<li>세균성 강수량에 멸균 1x PBS 버퍼 200 μL을 추가합니다.</li>
		<li>10% 자당 용액의 600 μL, 10mm ATP의 200 μL(식자극제 의 작용), 세균 현탁액 200 μL을 멸균 1.5mL 튜브에 넣습니다. 소용돌이에 의해 혼합. 또는 열 불활성화 혈액에서 세균성 펠렛을 중단하십시오.</li>
		<li>열 불활성화 혈액의 준비<ol>
<li>항응고제 튜브로 신선한 혈액을 수집합니다.</li>
			<li>신선한 혈액의 2-3 mL을 가져 가라. 4°C에서 10분 동안 1,000 x g의 원심분리기에서 혈장 및 혈액 세포를 분리합니다. 혈액은 원심 분리 및 세척 과정에서 손실됩니다; 사용량을 미리 계산해야 합니다.</li>
			<li>플라즈마를 새로운 1.5mL 튜브로 수집하고 1시간 동안 56°C에서 열 비활성화합니다.</li>
			<li>혈액 세포의 현탁액을 위해 멸균 1x PBS 버퍼 500 μL을 1.5 mL 튜브에 추가하십시오. 원심분리기는 4°C에서 10분 동안 1,000 x g의 원심분리기를 한 다음 상체를 폐기합니다.</li>
			<li>두 번 반복 단계 2.4.7.4.</li>
			<li>열 불활성화 된 혈장으로 혈액 세포를 다시 중단하여 열 불활성화 혈액을 얻습니다.</li>
			<li>걸음 2.4.1 에서 2.4.4 단계를 수행하여 1 개의 OD 세균 펠릿을 얻습니다.</li>
			<li>열 불활성화 혈액의 1 mL로 펠렛 박테리아를 다시 중단.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>박테리아 현탁액으로 모기에 먹이.<ol>
<li>24 시간 동안 모기를 굶주리고, 항생제가 박테리아를 먹이기 전에 대사할 수 있게 합니다.</li>
		<li>멤브레인 공급 시스템을 조립합니다.</li>
		<li>멸균 된 피더 유닛을 파라필름, 또는 콜라겐 멤브레인으로 밀봉하십시오.</li>
		<li>플라스틱 링을 착용하고 먹이 중 마찰로 인해 파손되지 않도록 파라필름으로 고정하십시오.</li>
		<li>준비된 세균용 용액을 피더 유닛에 천천히 추가합니다. 2웰 피더 유닛 중 하나만 용액으로 채워지고 시약 낙하 측에서만 피더 유닛을 덮을 수 있습니다.</li>
		<li>피더 유닛을 37°C로 예열된 먹이 시스템에 연결하여 모기를 유치하기 위해 인간의 온도를 시뮬레이션합니다. 먹이 장치를 모기로 가득 찬 종이 컵에 놓고 90 분 동안 먹습니다.</li>
		<li>먹이기 후에는 모기를 3-5분 동안 4°C의 온도로 복종하여 마취하고 얼음차가운 페트리 접시에 모기를 마취시합니다.</li>
		<li>추가 연구를 위해 완전히 기만된 모기를 선택하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Tolle, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Problems+in+Pediatric+and+Adolescent+Health+Care%22%5BJournal%5D)">Mosquito-borne diseases.</a> Current Problems in Pediatric and Adolescent Health Care. 39 (4), 97-140 (2009).</li>
<li>Wu, P., Yu, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arbovirus+lifecycle+in+mosquito%3A+acquisition%2C+propagation+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Reviews+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Arbovirus lifecycle in mosquito: acquisition, propagation and transmission.</a> Expert Reviews in Molecular Medicine. 21, 1(2019).</li>
<li>Jayakrishnan, L., Sudhikumar, A. V., Aneesh, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+gut+inhabitants+on+vectorial+capacity+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vector+Borne+Diseases%22%5BJournal%5D)">Role of gut inhabitants on vectorial capacity of mosquitoes.</a> Journal of Vector Borne Diseases. 55 (2), 69(2018).</li>
<li>Jupatanakul, N., Sim, S., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insect+microbiome+modulates+vector+competence+for+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">The insect microbiome modulates vector competence for arboviruses.</a> Viruses. 6 (11), 4294-4313 (2014).</li>
<li>Moro, C. V., Tran, F. H., Raharimalala, F. N., Ravelonandro, P., Mavingui, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+culturable+bacteria+including+Pantoea+in+wild+mosquito+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Diversity of culturable bacteria including Pantoea in wild mosquito Aedes albopictus.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 70(2013).</li>
<li>Chouaia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evidence+for+multiple+infections+as+revealed+by+typing+of+Asaia+bacterial+symbionts+of+four+mosquito+species%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Molecular evidence for multiple infections as revealed by typing of Asaia bacterial symbionts of four mosquito species.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (22), 7444-7450 (2010).</li>
<li>Terenius, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Midgut+bacterial+dynamics+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Midgut bacterial dynamics in Aedes aegypti.</a> FEMS Microbiology Ecology. 80 (3), 556-565 (2012).</li>
<li>Bando, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-specific+diversity+of+Serratia+marcescens+in+Anopheles+mosquito+midgut+defines+Plasmodium+transmission+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intra-specific diversity of Serratia marcescens in Anopheles mosquito midgut defines Plasmodium transmission capacity.</a> Scientific Reports. 3, 1641(2013).</li>
<li>Telang, A., Skinner, J., Nemitz, R. Z., McClure, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenome+and+culture-based+methods+reveal+candidate+bacterial+mutualists+in+the+Southern+house+mosquito+%28Diptera%3A+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Metagenome and culture-based methods reveal candidate bacterial mutualists in the Southern house mosquito (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 55 (5), 1170-1181 (2018).</li>
<li>Wang, Y., Gilbreath, T. M., Kukutla, P., Yan, G., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+gut+microbiome+across+life+history+of+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae+in+Kenya%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dynamic gut microbiome across life history of the malaria mosquito Anopheles gambiae in Kenya.</a> PloS One. 6 (9), (2011).</li>
<li>Xiao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mesh-Duox+pathway+regulates+homeostasis+in+the+insect+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Mesh-Duox pathway regulates homeostasis in the insect gut.</a> Nature Microbiology. 2 (5), 17020(2017).</li>
<li>Guégan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+impacts+of+anthropogenic+stressors+on+Aedes+albopictus+mosquito+vector+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">Short-term impacts of anthropogenic stressors on Aedes albopictus mosquito vector microbiota.</a> FEMS Microbiology Ecology. 94 (12), 188(2018).</li>
<li>Valzania, L., Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-induced+transcription+factor+signaling+is+essential+for+larval+growth+of+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-induced transcription factor signaling is essential for larval growth of the mosquito Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (3), 457-465 (2018).</li>
<li>Coon, K. L., Vogel, K. J., Brown, M. R., Strand, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquitoes+rely+on+their+gut+microbiota+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Mosquitoes rely on their gut microbiota for development.</a> Molecular Ecology. 23 (11), 2727-2739 (2014).</li>
<li>de O Gaio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+midgut+bacteria+to+blood+digestion+and+egg+production+in+Aedes+aegypti+%28diptera%3A+culicidae%29%28L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Contribution of midgut bacteria to blood digestion and egg production in Aedes aegypti (diptera: culicidae)(L).</a> Parasites & Vectors. 4 (1), 105(2011).</li>
<li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota%2C+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561(2012).</li>
<li>Dong, Y., Morton, J. C., Ramirez, J. L., Souza-Neto, J. A., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entomopathogenic+fungus+Beauveria+bassiana+activate+toll+and+JAK-STAT+pathway-controlled+effector+genes+and+anti-dengue+activity+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The entomopathogenic fungus Beauveria bassiana activate toll and JAK-STAT pathway-controlled effector genes and anti-dengue activity in Aedes aegypti.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 42 (2), 126-132 (2012).</li>
<li>Anglero-Rodriguez, Y. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Aedes+aegypti-associated+fungus+increases+susceptibility+to+dengue+virus+by+modulating+gut+trypsin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">An Aedes aegypti-associated fungus increases susceptibility to dengue virus by modulating gut trypsin activity.</a> Elife. 6, 28844(2017).</li>
<li>Wu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+commensal+bacterium+promotes+mosquito+permissiveness+to+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">A gut commensal bacterium promotes mosquito permissiveness to arboviruses.</a> Cell Host & Microbe. 25 (1), 101-112 (2019).</li>
<li>Möhlmann, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+gut+bacteria+on+the+infection+and+transmission+of+pathogenic+arboviruses+by+biting+midges+and+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Impact of gut bacteria on the infection and transmission of pathogenic arboviruses by biting midges and mosquitoes.</a> Microbial Ecology. , (2020).</li>
<li>Llorca, M., Gros, M., Rodríguez-Mozaz, S., Barceló, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+preservation+for+the+analysis+of+antibiotics+in+water%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography.+A%22%5BJournal%5D)">Sample preservation for the analysis of antibiotics in water.</a> Journal of Chromatography. A. 1369, 43-51 (2014).</li>
<li>Berendsen, B., Elbers, I., Stolker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+stability+of+antibiotics+in+matrix+and+reference+solutions+using+a+straightforward+procedure+applying+mass+spectrometric+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+%26+Contaminants%3A+Part+A%2C+Chemistry%2C+Analysis%2C+Control%2C+Exposure+%26+Risk+Assessment%22%5BJournal%5D)">Determination of the stability of antibiotics in matrix and reference solutions using a straightforward procedure applying mass spectrometric detection.</a> Food Additives & Contaminants: Part A, Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 28 (12), 1657-1666 (2011).</li>
<li>Hill, C. L., Sharma, A., Shouche, Y., Severson, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+midgut+microflora+and+dengue+virus+impact+on+life+history+traits+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Dynamics of midgut microflora and dengue virus impact on life history traits in Aedes aegypti.</a> Acta Tropica. 140, 151-157 (2014).</li>
<li>Eng, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+functional+implications+of+an+endogenously+expressed+tRNA+fragment+in+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Multifaceted functional implications of an endogenously expressed tRNA fragment in the vector mosquito Aedes aegypti.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (1), 0006186(2018).</li>
<li>Kajla, M. K., Barrett-Wilt, G. A., Paskewitz, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria%3A+A+novel+source+for+potent+mosquito+feeding-deterrents%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Bacteria: A novel source for potent mosquito feeding-deterrents.</a> Science Advances. 5 (1), 6141(2019).</li>
<li>Gonçalves, G. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+MALDI-TOF+MS+to+identify+the+culturable+midgut+microbiota+of+laboratory+and+wild+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Use of MALDI-TOF MS to identify the culturable midgut microbiota of laboratory and wild mosquitoes.</a> Acta Tropica. 200, 105174(2019).</li>
<li>Kuss, S. K., et al. Intestinal microbiota promote enteric virus replication and systemic pathogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuss%2C+SK+%22Science%22">Science</a>. 334 (6053), New York, N.Y. 249-252 (2011).</li>
<li>Rani, A., Sharma, A., Rajagopal, R., Adak, T., Bhatnagar, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+diversity+analysis+of+larvae+and+adult+midgut+microflora+using+culture-dependent+and+culture-independent+methods+in+lab-reared+and+field-collected+Anopheles+stephensi-an+Asian+malarial+vector%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial diversity analysis of larvae and adult midgut microflora using culture-dependent and culture-independent methods in lab-reared and field-collected Anopheles stephensi-an Asian malarial vector.</a> BMC Microbiology. 9 (1), (2009).</li>
<li>Apte-Deshpande, A., Paingankar, M., Gokhale, M. D., Deobagkar, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serratia+odorifera+a+midgut+inhabitant+of+Aedes+aegypti+mosquito+enhances+its+susceptibility+to+dengue-2+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Serratia odorifera a midgut inhabitant of Aedes aegypti mosquito enhances its susceptibility to dengue-2 virus.</a> PLoS One. 7 (7), 40401(2012).</li>
<li>Behura, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+microbiota+and+metagenomics%2C+and+its+relevance+to+disease+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mosquito microbiota and metagenomics, and its relevance to disease transmission.</a> Nature. 436, 257-260 (2013).</li>
<li>Dickson, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+laboratory+colonies+of+Aedes+aegypti+harbor+the+same+adult+midgut+bacterial+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Diverse laboratory colonies of Aedes aegypti harbor the same adult midgut bacterial microbiome.</a> Parasites & Vectors. 11 (1), 1-8 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

숙주 세균 상호 작용에 대 한 연구는 다른 창 자 미생물 다양 한 메커니즘을 통해 그들의 호스트 생리학에 영향을 발견. 이 기사에서는 모기 미드구트 해부, 재배장 세균 배양, 항생제 치료, 관심 있는 박테리아 재도입 등 모기 장내 미생물의 각 역할을 조사하는 방법을 소개합니다.
성공적인 항생제 치료를 위해, 다음과 같은 세부 사항은 실험을 수행에서 고려되어야한다. 본 프로토콜에서, 모기는 3일11,,16일동안 mL당 페니실린 20단위 및 연쇄상구균 20μg를 포함하여 10% 자당 용액으로 촉촉한 면공을 사용하여 치료하였다. 페니실린은 그람 양성 박테리아에 대한 광범위한 항생제로 봉사하고, 연쇄상 구균은 그람 음성 박테리아에 대한 광범위한 항생제로 봉사20. 항생제의 적절한 보존은 효율적인 항생제 치료에 필수적이다<sup class="...

모기는 Zika 바이러스, 뎅기열 바이러스 및 플라스모듐 기생충1을포함하여 백 개의 병원체를 통해 전송하는 인간 병원성 질병의 가장 중요한 벡터로 간주됩니다. 모기가 외란에 대한 영양분을 얻기 위해 혈액 식사를 할 때, 그들은 실수로 소화관을 통해 감염된 호스트에서 병원균을 섭취 할 수있습니다 2. 중요한 것은, 혈액 식사 소화와 병원체 입구 둘 다에 있는 중추적인 역할을 하는 모기 midgut는, 높게 다이내믹한 microbiome3를항구합니다.
여러 연구는 배양 의존적 방법 또는 박테리아 염기서열 분석4,,5,,6을사용하여 실험실 사육 및 현장 수집 모기 미생물을 특징으로한다. 판토에아, 세라티아, 클레브시엘라, 엘리자베스키아, 엔테로코커스를 포함한 종은 다양한 연구에서 모기로부터 일반적으로 분리된다5,,7,,8,,9. 흥미롭게도, 모기 장 내 미생물은 발달 단계, 종, 지리적 기원 및 수유 행동4에의해 영향을 받는 지역 사회의 다양성과 박테리아 종의 양 모두에서 동적으로 변동한다. 연구에 따르면 혈액 공급은 Enterobacteriaceae에서 종의 급속한 확장과 전반적인 다양성10,,11의감소와 함께 총 세균 부하를 극적으로 증가시킨다. 또한, 애벌레 단계의 모기 장내 미생물은 일반적으로 곤충이 새끼와 백과 기 전에 변형을 겪을 때 근절된다; 따라서 새로 등장한 성인 모기는 미생물4를다시 채워야 합니다.
장내 미생물은 영양 흡수, 면역, 발달, 번식 및 벡터역량(12)을포함한 다양한 측면에서 곤충 생리학을 조절한다. 악악 모기 유충은 박테리아 구강 공급이 발달하는 동안 첫 번째 인스타 를 넘어 개발하지 못하며, 이는 모기 장내 미생물이 애벌레 발달에 필수적임을 나타낸다13,,14. 게다가, 창 자 박테리아의 고갈 혈액 식사 소화 및 영양 흡수를 지연, oocyte 성숙에 영향을 미치는, 그리고 oviposition감소 15. 또한, 장내 미생물을 가진 모기는 항생제 처리한 모기에 비해 더 높은 면역 반응을 유도하고,16을감염시키기 위하여 그밖 병원체에 대하여 지속적으로 상승된 항균 펩티드 발현을 가진. 항생제는 일반적으로 이러한 연구에서 팬 창 자 박테리아를 제거 하기 위해 구두 관리, 다음 실험 은 축 축 모기와 모기와 대학 미생물의 차이 비교 하기 위해 실시. 그러나, 모기 midgut는 세균의 다양한 지역 사회를 항구하고, 각 박테리아 종은 호스트 생리학을 향해 명백한 효력을 발휘할 수 있었습니다.
모기 미생물은 다양한 효과로 벡터 역량을 조절합니다. 뎅기열 의 필드 유래 모기로부터 분리된 프로테우스에 의한 식민지화는 뎅기열 바이러스 감염에 대한 조절된 항균 펩티드 발현 및 저항을 부여한다16. 내모병원성 곰팡이 보베리아 bassiana는 arbovirus 감염에 대하여 통행료 및 JAK-STAT 면역 통로를 활성화합니다17. 대조적으로, Aedes aegypti midgut에서 분리된 곰팡이 탈라로미세스는 창자 트립신활동(18)을조절하여 뎅기열 바이러스 감염을 용이하게 한다. 또한, 세라티아 마르케센은 19모기의 장 상피에 있는 뮤신 층을소화하는 SmEnhancin에게 불린 분비 단백질을 통해 arbovirus 전송을 승진시다.
이 절차는 모기 미드구트의 해부, 재배 가능한 박테리아 식민지의 격리, 박테리아 종의 식별 및 구강 수유를 통한 재도입을 위한 체계적이고 직관적인 방법을 제공합니다. 그것은 모기 난소 발달 및 oviposition에, commensal 박테리아, Chryseobacterium meningosepticum와혈액 공급의 대표적인 결과를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>아데노신 5&프라임;-트리포스페이트 디소듐 염 수화물</td><td>시그마</td><td>A2383</td><td>아데노신 5&프라임;-트리인산 디소듐 염 수화물은 아데노신 삼인산(ATP) 표준 용액을 준비하는 데 사용되었습니다</td></tr>. <tr><td>Aedes aegypti</td><td></td><td></td><td>암컷 모기</td></tr><tr><td>항응고제 튜브</td><td>BD Vacutainer</td><td>363095</td><td>신선한 혈액</td></tr><tr><td>수집 원심분리기 튜브</td><td>Sangoon Biotech</td><td>F601620-0010</td><td>1.5 ml, 자연스러운, 눈금이 매겨진, 멸균</td></tr><tr><td>면봉</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 일회용 티슈 연삭 유봉</td>, <td>Sangon Biotech</td><td>F619072-0001</td><td>70mm 길이, 원추형, 파란색, 멸균</td></tr><tr><td>에탄올 절대</td><td>Paini</td><td></td><td>75% 에탄올 집게로 희석</td></tr><tr><td></td><td>RWD</td><td>F11029</td><td>해부</td></tr><tr><td>Hemotek 멤브레인 공급 시스템</td><td>Hemotek</td><td></td><td>공급 시스템의 구성 요소&nbsp; Hemotek 온도 컨트롤러, 피더 하우징 어셈블리, 금속 피더 조립.</td></tr><tr><td>인큐베이터 쉐이커</td><td></td><td>ZQZY-78AN</td><td></td></tr><tr><td>접종 루프</td><td>Sangon Biotech</td><td>F619312-0001</td><td>10 &mu; 엘, 옐로우</td></tr><tr><td>LB 한천 분말</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507003</td><td>트립톤 10.0g, 효모 추출물 5.0g, NaCl 10.0g, 한천 15.0g.</td></tr><tr><td>LB 육수 분말</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507002</td><td>트립톤 10.0g, 효모 추출물 5.0g, NaCl 10.0g.</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi508</td><td></td></tr><tr><td>종이컵</td><td></td><td></td><td>장소 모기</td></tr><tr><td>파라필름</td><td>Sangon Biotech</td><td>F104002</td><td>4 inx 125피트</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Sangon Biotech</td><td>F611203</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 G 프로카인 염 수화물</td><td>Sangon Biotech</td><td>A606248</td><td>백색 분말. 물에 용해되고 메탄올에 용해되며 물에 약간 용해되며 에탄올</td></tr><tr><td>Single Channal Pipettor</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610494</td><td>Streptomycin sulfate는 원핵 단백질의 합성을 방해하는 글루코사민 항생제입니다.</td></tr><tr><td>설탕</td><td>Sangon Biotech</td><td>A502792</td><td>물, 에탄올 및 메탄올에 용해되며 글리세롤과 피리딘에 약간 용해됩니다.</td></tr><tr><td>TIANamp 박테리아 DNA 키트</td><td>TIANGEN</td><td>DP302</td><td>추출물 DNA&nbsp;</td></tr><tr><td>유틸리티 패브릭-모기장 화이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>와류 믹서</td><td>Scintic Industries</td><td>S1-0246</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml EP 튜브</td><td>Sangon Biotech</td><td>F600620</td><td></td></tr><tr><td>10X PBS 버퍼</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607016</td><td>이 제품은 10X 솔루션입니다. 사용하기 전에 10회 희석하십시오. pH 값은 7.4입니다.</td></tr></tbody></table>

항생제 치료 모기를 가진 세균성 구강 먹이 분석

A Bacterial Oral Feeding Assay with Antibiotic-Treated Mosquitoes

모기 midgut 호스트 신진 대사에 영향을 미치는 매우 동적 미생물군유전체를 항구, 재생, 피트 니스, 그리고 벡터 능력. 연구 는 창 자 미생물의 효과 전체적으로 조사 하기 위해 실시 되었습니다.; 그러나, 다른 미생물 호스트쪽으로 뚜렷한 효력을 발휘할 수 있었습니다. 이 문서는 각 특정 모기 창 자 미생물및 잠재적인 기계장치의 효력을 연구하는 방법론을 제공합니다.
이 프로토콜에는 두 부분이 포함되어 있습니다. 첫 번째 부분은 모기 midgut를 해부하는 방법을 소개합니다, 재배 박테리아 식민지를 분리하고, 박테리아 종을 확인하는 방법. 두 번째 부분은 항생제 처리된 모기를 생성하고 1개의 특정 박테리아 종을 다시 소개하는 절차를 제공합니다.

항생제로 치료된 모기의 중간구와 항생제 없이 DNA 추출을 위해 꺼내졌고, qPCR은 보편적인 세균성 프라이머로 수행되었다. 도 1은 대조군 및 항생제 치료 군에서 세균성 16S rRNA의 발현을 나타낸다. 결과는 창자 박테리아의 대략 98%가 제거되고, 페니실린과 연쇄상 구균의 창자 살균이 성공했다는 것을 보여줍니다.
설명된 방법으로, 박테리아 긴장은 고립되고 확인되었습니다. C. meningosepticum은 크리서박테리움에속하는 비발효, 산화제 양성 그람 음성 호기성 유산균이다. 도 2는 C. meningosepticum와항생제 처리 모기의 혈액 공급 후 모기 당 누워 평균 계란을 보여줍니다. 도 3은 C. meningosepticum을포함하는 혈액 식사 후...

이 문서는 모기 midgut 경작 미생물의 격리 및 식별, 모기 창자 박테리아의 항생제 고갈을 포함하여 개별 모기 창자 박테리아의 효력을 조사하고, 1개의 특정 박테리아 종을 재소개하기 위하여 프로토콜을 제시합니다.

The mosquito midgut harbors a highly dynamic microbiome that affects the host metabolism, reproduction, fitness, and vector competence. Studies have been ...

모기 midgut 호스트 신진 대사에 영향을 미치는 미생물의 복잡 한 지역 사회를 항구, 재생, 피트 니스, 그리고 수 의사 능력. 각 창 자 미생물은 다른 효과. 이 비디오는 각 박테리아 긴장 또는 호스트 생리학의 각각의 역할을 연구하는 절차를 소개합니다.장 세균 성 식민지의 문화를 취득하려면, 멸균 상태에서 모기 midgut을 해부. 해부 미드구트를 접고, 세로토요고를 하고, 한천 판 에 퍼짐. 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 16 개의 SRNA 유전자 서열을 통해 박테리아 종을 식별합니다.장 내 미생물을 제거하기 위해 3 일 연속 항생제를 함유 한 COD 엠보스로 모기를 먹이. 항생제 치료의 효과는 후속 극단주의자 이전에 식민지 형성 단위 분석에 대한 무균 모기의 midgut를 해부함으로써 확인할 수 있습니다. 그런 다음 이전에 구강 수유 분석을 통해 모기 장에서 격리 된 특정 박테리아 종을 다시 소개합니다.호스트 생리학에 박테리아의 효력은 처리되지 않은 모기, 항생제 처리한 모기 및 모기를 비교하여 평가될 수 있었습니다, 모기는 특정 구속을 재도입했습니다. 미드구트 해부와 재배 가능한 박테리아 격리. 우선, 수집 상자에 모기를 흡인기로 케이지에 모기를 수집하고 세포를 수집합니다.3~5분 동안 4도의 온도에 복종하여 모기를 마취합니다. 모기를 얼음 차가운 페트리 접시에 넣음으로써 마취하십시오. 환경으로부터 박테리아에 의한 오염을 피하기 위해 75%에탄올을 살포하여 벤치를 소독하고 현미경을 해부하고 집게를 제거하십시오.표면테이핑하여 75%에탄올로 3분간 흔들어 서 모기를 살균하고 PBS 버퍼로 두 번 헹구는 표면. PBS 한 방울이 들어 있는 멸균 유리 슬라이드에 모기를 따로 양분하십시오. 조심스럽게 집게를 사용하여 모기의 다리, 날개와 머리를 제거합니다.모기의 가슴을 고정하고 복부의 마지막 부분은 집게하고 소화관을 격리하기 위해 떨어져 당겨. 집게를 사용하여 소화관에서 작물과 말피기안 튜브를 제거하십시오. 작물은 설탕 물을 섭취 한 후 midgut및 부푼 의 pnterior에 위치합니다.말피기히안 튜브는 미드구트와 힌구트의 교차점의 날씬한 배설튜브 그룹입니다. 200 마이크로 리터 멸균 PBS 버퍼와 EP 튜브에 해부 메이크업을 배치하고 깨끗한 벤치에 멸균 연삭 목사와 분쇄. 시리얼은 LB 한천 판과 필사적 인 접시에 각 망상의 50 마이크로 리터에서 3 개의 템포 망상에 동종을로드합니다.단일 식민지가

a-bacterial-oral-feeding-assay-with-antibiotic-treated-mosquitoes

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Liu, X. 외. 항생제 처리된 모기를 이용한 박테리아 경구 먹이 검사. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 모기 중장 해부를 통해 장내 박테리아를 분리하는 과정을 보여줍니다. 중장은 소화관에서 추출되어 균질화되어 박테리아를 방출한 후 영양 한천 위에 플레이트되어 박테리아 집락을 배양합니다.

모기 중장에서 박테리아 분리

출처: Liu, X. 외. 항생제 처리된 모기를 이용한 박테리아 경구 먹이 검사. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 항생제 함유 자당 용액을 사용해 모기에서 토종 장내 미생물군이 고갈되는 과정을 보여줍니다. 이후 막 영양 시스템을 통해 박테리아 현탁물을 투여하여 모기 장 내에 정의된 박테리아 집단을 확립하는 통제된 재정착이 이루어집니다.

성체 모기에서 정의된 장내 세균 집단 확립

이 비디오는 암컷 모기에 대한 새로운 작용 모드를 가진 테스트 화합물의 폐사율과 번식력을 평가하기 위한 혈액 공급 분석을 보여줍니다. 이 기술은 새로운 종류의 살충제를 스크리닝하여 모기의 저항성 개체군을 죽이고 질병 확산을 통제하는 데 도움이 됩니다.

모기 먹이 분석: 성체 암컷 모기의 폐사율 및 생식력에 대한 테스트 복합 효과를 평가하는 방법

인간 말라리아 기생충에 설치류 말라리아 기생충의 생활 주기 그리고 생물학의 눈에 띄는 유사성 때문에, 설치류 말라리아 모형은 말라리아 연구를 위해 필수불가결하게 되었습니다. 본 명세서에서, 우리는 야생형 및 형질전환 설치류 말라리아 종의 표현형 분석에 사용되는 가장 중요한 기술중 일부를 표준화하였다.

설치류 말라리아 기생충 무성 및 성적 혈액 단계 및 모기 단계의 현상형 분석

프로토콜 개발 larvicides, adulticides 및 endectocides의 새로운 클래스에 대 한 미 숙 하 고 성인 모기에 화학 물질의 독성 평가 대 한 설명 합니다. 프로토콜의 단일-지점 복용량 및 복용량 응답 분석 결과 접촉에 독성을 결정 하기 위해 또는 섭취를 통해 후속 평가에서 여러 화학의 높은 처리량 테스트...

모기에 소설 Insecticidal 화학 물질의 독성을 테스트 하기 위한 프로토콜

모기 품 어진 바이러스 전송의 효율적인 제어를 위해 각각 모기의 벡터 잠재력의 지식은 특정 관심의 이다. 우리는 Aedes albopictus Zika 바이러스의 전송에 대 한 3 개의 다른 Culex taxa의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 강제 타 액 분 비를 설명 합니다.

모기의 벡터 역량을 분석 하는 방법으로 타 액 분 비를 강제

무혈 인공 식단을 배합하여 아노헬레스 모기를 포로로 먹이는 프로토콜이 제시됩니다. 이 규정식은 척추동물 혈액에 유사한 성과가 있고 난족증과 계란 성숙을 시작하고 실행 가능한 성인 자손을 일으킵니다.

무혈 식단으로 무혈 모기를 후두

이 프로토콜의 목표는 인공 막 피더를 통해 Aedes aegypti 모기에 동물 유래 및 인공 혈액 식사를 제공하고 섭취한 식사의 양을 정확하게 정량화하는 것입니다.

Aedes aegypti 모기에서 동물 유래 혈액 및 인공 식사 먹이주기 및 정량화

세균에 의해 생산된 dsRNA의 경구 투여는, 예쁜꼬 마선충에서 일상적으로 사용되는 RNA 간섭(RNAi)에 대한 전달 방법으로서, 성인 모기에 성공적으로 적용되었다. 우리의 방법은 주사를 사용하지 않고도 강력한 역 유전학 연구 및 전송 차단 벡터 연구를 가능하게합니다.

성인 Anopheles 감비아 모기에 효과적인 경구 RNA 간섭 (RNAi) 투여

표준 막 공급 분석(SMFA)은 잠재적인 항말라리아 화합물의 평가 및 식별을 위한 황금 표준으로 간주됩니다. 이 인공 먹이 시스템은 Plasmodium falciparum 기생충의 강도와 유병률에 대한 이러한 화합물의 영향을 추가로 평가하기 위해 모기를 감염시키는 데 사용됩니다.

Anopheles 모기 벡터에서 플라스모듐 팔시파룸 감염 검출을 위한 표준 막 공급 분석

경구 수유 및 흉강내 주사 감염을 포함하는 이 방법론은 아르보 바이러스 감염에 대한 중장 및/또는 침샘 장벽의 영향을 효과적으로 평가할 수 있습니다.

경구 수유 및 미세 주입에 의한 성인 모기의 실험적 바이러스 감염

배우세요 항생제 처리 모기의 장내 세균 분리 및 재도입 방법을 통해 숙주 생리에 미치는 미생물 영향을 분석하는 기술입니다. 이 연구는 질병 매개체 관리 전략에 활용됩니다.

항생제 치료 모기를 가진 세균성 구강 먹이 분석

더 많은 동영상 탐색