Name: 결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cPILOT)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 배우세요 cPILOT 기법을 활용한 자동화된 샘플 멀티플렉싱 방법으로 단백질체학 연구의 처리량과 정확성을 높이세요. 이 프로토콜은 로봇 플랫폼을 통해 여러 샘플을 병렬로 분석하여 알츠하이머병 및 노화 관련 연구에 효율적으로 적용할 수 있습니다.

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저자는 밴더빌트 대학 스타트업 펀드와 NIH 상(R01GM117191)을 RASR에 수여합니다.

<ol><li>Diamandis, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+as+a+diagnostic+and+a+cancer+biomarker+discovery+tool%3A+opportunities+and+potential+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry as a diagnostic and a cancer biomarker discovery tool: opportunities and potential limitations.</a> Molecular and Cell Proteomics. 3 (4), 367-378 (2004).</li>
<li>Qian, W. -J., Jacobs, J. M., Liu, T., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+challenges+in+liquid+chromatography-mass+spectrometry-based+proteomics+profiling+for+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Advances and challenges in liquid chromatography-mass spectrometry-based proteomics profiling for clinical applications.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 5 (10), 1727-1744 (2006).</li>
<li>Arul, A. B., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Multiplexing+Strategies+in+Quantitative+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sample Multiplexing Strategies in Quantitative Proteomics.</a> Analytical Chemistry. 91 (1), 178-189 (2019).</li>
<li>Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+Throughput+in+Targeted+Proteomics+Assays%3A+54-Plex+Quantitation+in+a+Single+Mass+Spectrometry+Run%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run.</a> Analytical Chemistry. 85 (11), 5340-5346 (2013).</li>
<li>Shiio, Y., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteome+analysis+using+isotope-coded+affinity+tags+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteome analysis using isotope-coded affinity tags and mass spectrometry.</a> Nature Protocol. 1 (1), 139-145 (2006).</li>
<li>Gygi, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Thompson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMTpro%3A+Design%2C+Synthesis%2C+and+Initial+Evaluation+of+a+Proline-Based+Isobaric+16-Plex+Tandem+Mass+Tag+Reagent+Set%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">TMTpro: Design, Synthesis, and Initial Evaluation of a Proline-Based Isobaric 16-Plex Tandem Mass Tag Reagent Set.</a> Analytical Chemistry. 91 (24), 15941-15950 (2019).</li>
<li>Frost, D. C., Feng, Y., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((21-plex+DiLue+Isobaric+Tags+for+High-Throughput+Quantitative+Proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">21-plex DiLue Isobaric Tags for High-Throughput Quantitative Proteomics.</a> Anal. Chem. 92 (12), 8228-8234 (2020).</li>
<li>Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging+%28cPILOT%29+approach+with+selective+MS%283%29+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition.</a> Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).</li>
<li>Robinson, R. A., Evans, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+sample+multiplexing+for+nitrotyrosine-modified+proteins+using+combined+precursor+isotopic+labeling+and+isobaric+tagging%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enhanced sample multiplexing for nitrotyrosine-modified proteins using combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging.</a> Analytical Chemistry. 84 (11), 4677-4686 (2012).</li>
<li>King, C. D., Dudenhoeffer, J. D., Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+Sample+Multiplexing+of+Tissues+Using+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+%28cPILOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Enhanced Sample Multiplexing of Tissues Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT).</a> Journal of Visual Experiments. (123), e55406(2017).</li>
<li>King, C. D., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Performance+on+Orbitraps+To+Study+the+Peripheral+Proteome+of+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluating Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Performance on Orbitraps To Study the Peripheral Proteome of Alzheimer's Disease.</a> Analytical Chemistry. , (2020).</li>
<li>Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cPILOT+analysis+of+the+APP%2FPS-1+mouse+liver+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+%26+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome.</a> Proteomics & Clinical Applications. 9 (9-10), 872-884 (2015).</li>
<li>Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+multiplexing+with+cysteine-selective+approaches%3A+cysDML+and+cPILOT%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Society+of+Mass+Spectrometer%22%5BJournal%5D)">Sample multiplexing with cysteine-selective approaches: cysDML and cPILOT.</a> Journal of American Society of Mass Spectrometer. 26 (4), 615-630 (2015).</li>
<li>Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS3+eliminates+ratio+distortion+in+isobaric+multiplexed+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics.</a> Nature Methods. 8 (11), 937-940 (2011).</li>
<li>Frost, D. C., Rust, C. J., Robinson, R. A. S., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+N%2CN-Dimethyl+Leucine+Isobaric+Tag+Multiplexing+by+a+Combined+Precursor+Isotopic+Labeling+and+Isobaric+Tagging+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Increased N,N-Dimethyl Leucine Isobaric Tag Multiplexing by a Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging Approach.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10664-10669 (2018).</li>
<li>Gu, L., Robinson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+endogenous+measurement+of+S-nitrosylation+in+Alzheimer%27s+disease+using+oxidized+cysteine-selective+cPILOT%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT.</a> Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).</li>
<li>Amin, B., Ford, K. I., Robinson, R. A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+to+study+aging+in+rabbit+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics to study aging in rabbit liver.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 187, 111227(2020).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

cPILOT은 단일 실험에서 최대 24개의 샘플을 분석할 수 있는 향상된 멀티플렉싱 전략입니다. 멀티플렉싱 용량은 사용 가능한 동위원소 및 동소바릭 태그 조합의 수에 따라 달라집니다. 단일 실험에서 16개의 샘플을 태그할 수 있는 TMTpro7의도입은 cPILOT의 한계를 32-플렉스로 밀어낼 수 있다. cPILOT은 여러 파이펫팅 단계로 구성되어 있으며 샘플 준비를 수행하기 위해 광범위한 관리 및 사용자 기술이 필요합니다. 전문 사용자도 마찬가지인 수동 오류는 불가피하며, 이는 로봇 플랫폼을 사용하여 cPILOT 전략에서 샘플을 처리하도록 유도합니다. cPILOT은 펩티드의 pH 의존적 태깅을 활용하기 때문에, pH는 빛과 무거운 절제된 시료 세트를 위해 유지되어야 한다. 온화한 산성 기본 pH는 N-테르미니와 리신 잔류물의 디메틸화를 초래할 수 있습니다. cPILOT의 장점은 펩타이드 N-테르미니가 디메틸 군으로 점유되기 때문에 동소바릭 태그의 절반만 필요하다는 것이다. 이렇게 하면 비용의 절반으로 라벨을 붙일 샘플수가 더 많이 듭니다. 더 큰 샘플 번호를 처리하려면 시약 노출 시간이 첫 번째 및 일괄 처리의 마지막 샘플과 유사해야 합니다. 로봇 액체 처리 장치를 사용하여 최대 32개의 샘플을 병렬로 수용할 수 있는 파이펫 디스펜서를 가장 잘 달성할 수 있습니다.
cPILOT에 의해 여러 샘플을 처리하기 위해 자동화를 통합하기 위해 수동 워크플로우가 개정되었습니다. 이 연구에 사용되는 로봇 액체 처리기는 96 채널 및 8 채널 파이펫 팅 능력을 가진 두 개의 포드를 가지고 있으며, 그리퍼는 플레이트를 사용 가능한 28 데크 위치에 배치합니다. 액체 처리기는 양압 장치, 궤도 셰이커 및 96 웰 플레이트에서 시료를 가열/냉각하는 장치와 통합됩니다. 양압 장치는 세척 중에 SPE 플레이트에서 완충교환을 수행하는 데 도움이 되며, 궤도 셰이커는 시료를 소용돌이/혼합하는 데 도움이 됩니다. 로봇 플랫폼은 버퍼와 샘플을 96웰 플레이트, 인큐베이션, 소용돌이 샘플 및 전송 플레이트로 흡인 및 분배하도록 프로그래밍되었습니다. 아세토닐릴 및 물과 같이 점도가 다른 액체에는 또한 방법으로 프로그래밍할 수 있는 특정 파이펫 팅 고려 사항이 필요합니다.
CPILOT 워크플로우는 BCA의 단백질 정량화에서 부터 이소바릭 태그(즉, TMT)로 펩티드를 라벨링하는 것까지 액체 처리기 시스템에서 수행되었다. 전체 프로토콜은 잘 당 2mL를 보유 할 수있는 96 깊은 우물 플레이트를 사용하도록 조정되었습니다. 버퍼는 실험의 시작 전에 준비되었고 병렬 샘플 처리를 허용하도록 96 웰 플레이트에 첨가하였다. 본 연구에서는, 마우스 간 균모의 22개의 워크플로복제를 깊은 우물 판에 첨가하고 cPILOT 프로토콜을 통해 취해졌다. 마지막으로, 22-플렉스 평형 마우스 간 태그 펩티드로 구성된 단일 샘플이 질량 분광계에 주입되었다. 샘플에서 펩타이드 풍부에 대응하는 리포터 이온 강도는 액체 처리기로 처리된 시료가 수동프로토콜(도시되지 않은 데이터)보다낮은 CV를 갖는 것으로 나타났다. 로봇 플랫폼은 또한 샘플 처리의 재현성을 크게 향상시켰습니다. 재현성과 견고성은 많은 수의 샘플을 처리하는 동안 매우 중요한 요소입니다. 파이프 팅 오류는 데이터의 완전한 잘못된 해석으로 이어질 수 있으며 여기에 로봇 플랫폼은 낮은 샘플 간 변형을 제공. 또한 cPILOT용 로봇 플랫폼을 사용하면 시료를 준비하는 데 필요한 시간이 단축되었습니다. 예를 들어, 자동화된 방법을 개발한 후 수동 cPILOT의 경우 7.5h에 비해 22개의 샘플을 처리하는 데 2.5h가 필요했습니다. 수동 및 자동화된 cPILOT 워크플로우의 비교를 추가로 평가하기 위한 실험이 실험실에서 진행 중입니다. 우리의 실험실에서 이전 보고서에 따르면, 매뉴얼 cPILOT에서 단백질 리포터 이온 강도의 CV%의 CV%는 이 값을 초과하는 일부 이상치와 평균 20%였다12.
cPILOT은 펩티드 수준에서 화학 유도 전략으로, 세포, 조직 및 체액과 같은 임의의 샘플 유형에 사용될 수 있다. cPILOT은 향상된 샘플 멀티플렉스를 제공하며 자동화를 통합하면 프로테오믹스에서 고처리량 샘플 멀티플렉스를 용이하게 할 수 있습니다. 이 처리량은 질병 및 생물학 이해 및 바이오마커 발견을 더 발전시키기 위하여 필요합니다.

질량 분광법(MS)기반 프로테오믹스는 질병 특정 바이오마커를 식별하고, 질병 진행을 이해하고, 치료 개발을 위한 리드를 만드는 데 필수적인 연구 도구입니다. 이는 혈청/혈장, 근해 액액 및 조직1,2와같은 다양한 질병 관련 임상 샘플로부터 달성될 수 있다. 프로테오믹스 바이오마커 의 발견 및 검증은 최근 샘플 멀티플렉스 전략3,4의힘으로 인해 상당한 고려를 얻고 있다. 샘플 멀티플렉싱은 단일 MS 주입5,6내에서 두 개 이상의 샘플 조건의 동시 비교 및 정량화를 가능하게 하는 기술이다. 샘플 멀티플렉싱은 화학, 효소 또는 대사 태그로 여러 샘플의 펩티드 또는 단백질을 바코딩하고 단일 MS 또는 MS/MS 실험에서 모든 샘플에서 MS 정보를 획득함으로써 달성됩니다. 사용 가능한 등소 태그 중에는 iTRAQ(iTRAQ), 상업용 탠덤 질량 태그(TMT), 및 집에서 합성된 이소바릭 N, N-디메틸 류신(DiLeu) 시약이 각각 16-플렉스7 및 21-plex8까지기능한다.
결합된 전구체 동위원소 라벨링 및 동위원소 태그(cPILOT)는 향상된 샘플 멀티플렉싱 기술입니다. cPILOT은 펩타이드 N-테르미니의 등소 라벨링을 빛과 결합 [−(CH3)2]및 무거운 [−(13 C2H3)2]동위원소는 낮은 pH (2.5)에서 동위원소로, 이는 TMT를 사용하여 후속 고pH(8.5) 동위원소 라벨링에 사용할 수 있도록 유지합니다. DiLeu, 또는 iTRAQ 태그3,9,10,11,12,13,14. cPILOT 전략의 이중 라벨링 방식은 예 펩티드를 사용하여 2개의 샘플을 가진 보충 도 1에서 묘사된다. MS2 수준에서 TMT 기반 정량화의 정확도와 정밀도는 간섭효과(15)로불리는 공동 절연 및 공동 단편화 이온을 오염시키는 존재로 인해 손상될 수 있다. 부정확한 리포터 이온 비율의 이러한 제한은 삼중 궤도랩 질량 분광계의 도움으로 극복할 수 있다. 예를 들어, 간섭 효과는 질량 분광계에서 MS1 수준에서 정점에 피크를 격리하고, 선형 이온 트랩에서 MS2 단편화로 빛 또는 무거운 피크를 적용한 다음 HCD-MS3에 대해 가장 강렬한 MS2 단편을 적용하여 정량적 정보를 얻을 수 있다. 리포터 이온생성에 사용할 수 있는 리신 아민 없이 펩티드를 선택할 확률을 높이기 위해, y-1단편을 기반으로 한 선택적 MS3 획득도 사용될 수 있으며, cPILOT9로정량화 가능한 펩타이드의 높은 비율을 초래할 수 있는 접근법이다. 빛과 무거운 라벨링의 조합은 개별 동소 막대 태그로 달성되는 2배의 비율로 샘플 멀티플렉싱 기능을 증가시킵니다. 우리는 최근에 DiLeu 시약16을가진 단 하나 실험에서 24개의 견본까지 결합하기 위하여 cPILOT를 이용했습니다. 또한 cPILOT은 단백질질화(17)및 기타 글로벌 프로테옴(9)을 포함한 산화후 번역 후 변형을 연구하는 데 사용되었으며, 알츠하이머병 마우스모델(11)에서여러 조직 샘플에 걸쳐 응용 프로그램을 시연하고 있다.
견고한 샘플 준비는 cPILOT 실험에서 중요한 단계이며 시간이 많이 걸리고, 힘들고, 광범위할 수 있습니다. 향상된 샘플 멀티플렉스는 광범위한 파이펫팅과 고도로 숙련된 실험실 인력이 필요하며 실험의 재현성에 큰 영향을 미칠 수 있는 몇 가지 요인이 있습니다. 예를 들어, 모든 샘플에 대해 유사한 반응 시간을 보장하고 빛과 무거운 절제된 시료에 적합한 버퍼 pH를 유지하기 위해 시료를 주의 깊게 다루어야 합니다. 또한 수십~수백 개의 시료를 수동적으로 준비하면 높은 실험 적 오류를 유발할 수 있습니다. 따라서 샘플 준비 가변성을 줄이고 정량적 정확도를 개선하며 실험 처리량을 높이기 위해 자동화된 cPILOT 워크플로우를 개발했습니다. 워크플로우의 여러 측면을 완료할 수 있는 로봇 액체 처리 장치를 사용하여 자동화가 달성됩니다(그림1). 단백질 정량화에서 펩타이드 라벨링에 대한 샘플 제제는 자동화된 액체 처리기에 수행되었다. 자동화된 액체 처리기는 고체 위상 추출(SPE) 플레이트, 궤도 셰이커 및 가열/냉각 장치 간의 완충 교환을 위한 양압 장치(PPA)와 통합됩니다. 로봇 플랫폼에는 플레이트와 버퍼를 수용할 수 있는 28개의 데크 위치가 포함되어 있습니다. 96채널 고정 볼륨 피펫팅 헤드(5-1100 μL)와 8채널 가변 볼륨 프로브(1-1000 μL)의 두 개의 포드가 데크 위치 내에서 플레이트를 전송합니다. 로봇 플랫폼은 소프트웨어를 사용하여 제어됩니다. 사용자는 로봇 액체 처리기를 사용하기 전에 전문적으로 교육을 받아야 합니다. 본 연구는 단일 일괄 처리로 12개 이상의 샘플을 처리하기 위한 노동 집약적일 수 있는 수동 cPILOT 워크플로우 자동화에 중점을 둡니다. cPILOT접근법(11)의처리량을 높이기 위해 cPILOT 프로토콜을 로봇 액체 처리기로 전송하여 10개 이상의 샘플을 병렬로 처리했습니다. 또한 자동화를 통해 샘플 준비 프로세스의 다양한 단계에서 각 샘플에 대해 유사한 반응을 허용하므로 고도로 숙련된 사용자가 수동 cPILOT 중에 수행해야 합니다. 이 프로토콜은 cPILOT을 수행하기 위해 자동화된 액체 처리 장치의 구현에 중점을 둡니다. 본 연구는 이 자동화된 시스템을 사용하기 위한 프로토콜을 설명하고 마우스 간 균질화의 22-plex "개념 증명" 분석을 사용하여 성능을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>0.6 mL 에펜도르프 튜브, 500 pk</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td>0.6 mL 에펜도르프 튜브의 모든 브랜드는</td></tr><tr><td>0.65 &마이크로로 충분합니다. m Ultrafree MC DV 원심 필터 장치</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30DV00</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 에펜도르프 튜브, 500 pk</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>1.5 mL 에펜도르프 튜브의 모든 브랜드로 충분합니다</td></tr><tr><td>2 ml 블랙 딥 웰 플레이트</td><td>Analytical Sales and Services, Inc.</td><td>59623-23BKGC</td><td>어떤 브랜드의 검은 96-웰 플레이트로도 충분합니다</td></tr><tr><td>2 ml 클리어 딥 웰 플레이트</td><td>VWR</td><td>75870-796</td><td></td></tr><tr><td>아세트산</td><td>J.T. 베이커</td><td>9508-01</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴 - MS 등급</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>A955-4</td><td>4 L 수량은 필요하지 않습니다</td></tr><tr><td>Agilent 500&micro; L 플레이트</td><td>Agilent</td><td>203942-100</td><td>완충액 추가용 시약 플레이트</td></tr><tr><td>Ammonium formate</td><td>Acros Organics</td><td>208-753-9</td><td></td></tr><tr><td>수산화암모늄 용액(28 - 30%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320145-500ML</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>Mettler Toledo</td><td>AL54</td><td></td></tr><tr><td>BCA 단백질 분석 키트</td><td>Pierce Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Biomek i7 hybrid</td><td>Beckmann</td><td></td><td>양압, 가열/냉각 및 시료 와류를 사용할 수 있는 모든 액체 취급 장치.</td></tr><tr><td>C18 포장재(2.5 &마이크로; m, 100 &Aring;)</td><td>브루커</td><td></td>: <td>이 아이템은 더 이상 브루커에서 구매할 수 없습니다. </td></tr><tr><td>플레이트 로터가 있는 원심분리기</td>: <td>Thermo Scientific</td><td>69720</td><td></td></tr><tr><td>Micro 21R Centrifuge</td><td>Sorval</td><td>5437</td><td></td></tr><tr><td>Dionex 3000 UHPLC</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>이 모델은 더 이상 사용할 수 없습니다. 오토샘플러가 있는 모든 나노 LC로 충분합니다.</td></tr><tr><td>디티오트레이오톨 (DTT)</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 (13CD2O) 용액; D2O에서 20 중량 %, 98 원자 % D, 99 원자 % 13C</td><td>시그마 알드리치, 화학</td><td>596388-1G</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 (CH2O) 용액; H2O에서 36.5 - 38%</td><td>시그마 알드리치, 생명 과학</td><td>F8775-25ML</td><td></td></tr><tr><td>포름산</td><td>플루카 분석</td><td>94318-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>융합 루모스 질량 분광계</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>이 모델은 더 이상 사용할 수 없습니다. 다른 고분해능 기기(예: Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion 또는 Orbitrap Fusion Lumos)를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>하이드록실아민 하이드로클로라이드</td><td>Sigma Aldrich, 화학</td><td>255580-100G</td><td></td></tr><tr><td>요오드아세트아미드(IAM)</td><td>Acros Organics</td><td>144-48-9</td><td></td></tr><tr><td>등압 태깅 키트(TMT 11-plex)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90061</td><td></td></tr><tr><td>L-1-토실아미도-2 페닐에틸 콜로메틸 케톤(TPCK) 처리 트립신 소 췌장</td><td>Sigma Aldrich, Life Science</td><td>T1426-100MG</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteine</td><td>Sigma Aldrich, Chemistry</td><td>168149-25G</td><td></td></tr><tr><td>Mechanical Homogenizer(i.e. FastPrep-24 5G)</td><td>MP Biomedicals</td><td>116005500</td><td></td></tr><tr><td>pH 10 버퍼</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-261</td><td>pH 버퍼 10의 모든 브랜드가 충분한</td></tr><tr><td>pH 7 버퍼</td>입니다 <td>Fisher Scientific</td><td>06-664-260</td><td>모든 브랜드의 pH 버퍼 7이 충분한</td></tr><tr><td>pH 미터입니다(Tris 호환 가능)</td><td>Fisher Scientific (Accumet)</td><td>13-620-183</td><td>pH 미터의 어떤 브랜드든 충분합니다</td></tr><tr><td>. 단백질 소프트웨어 (예: Proteome Discoverer)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reservior plate 200ml</td><td>Agilent</td><td>204017-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, 98%</td><td>CP Sigma Aldrich, Chemistry</td><td>190020-1G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cyanoborohydride; 시약 등급, 95%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156159-10G</td><td></td></tr><tr><td>Speed-vac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD1010</td><td>딥 웰 플레이트를 수용할 수 있는 모든 브랜드의 speed vac으로 충분합니다</td></tr><tr><td>교반 플레이트</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>모든 브랜드의 교반 플레이트로 충분합니다</td></tr><tr><td>Targa 20 mg SPE 플레이트</td><td>Nest Group, Inc.</td><td>HNS S18V</td><td>이들은 C18 카트리지입니다.</td></tr><tr><td>트리에틸 암모늄 바이카보네이트(TEAB) 버퍼</td><td>Sigma Aldrich, 생명 과학</td><td>T7408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Biorad</td><td>161-0716</td><td></td></tr><tr><td>Biomek 24-Place Tube Rack Holder</td><td>Beckmann</td><td>373661</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Biorad</td><td>161-0731</td><td></td></tr><tr><td>물 - MS 등급</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td>4L 수량은 필요하지 않습니다.</td></tr></tbody></table>

결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cpilot)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

당사는 높은 처리량 정량적 프로테오믹스 워크플로우, 결합된 전구체 동소라벨링 및 동위원소 태깅(cPILOT)을 결합하여 탠덤 매스 태그 또는 동소바릭 N, N-N-디메틸 류신 이소바릭 태그가 있는 최대 22또는 24개의 샘플을 멀티플렉싱할 수 있는 단일 실험에서 각각 도입했습니다. 이 향상된 샘플 멀티플렉스는 질량 분광법 획득 시간을 상당히 줄이고 고가의 상업용 동소리 시약의 유용성을 증가시킵니다. 그러나, 시료 처리 및 파이프팅 단계의 수동 프로세스는 노동 집약적, 시간이 많이 소요될 수 있으며, 샘플 손실 및 정량적 오류를 소개할 수 있다. 이러한 제한은 자동화의 통합을 통해 극복 될 수있다. 여기서 우리는 수동 cPILOT 프로토콜을 대량 샘플 수(즉, 96 개의 샘플)를 병렬로 준비할 수있는 자동화 된 액체 처리 장치로 옮겼습니다. 전반적으로 자동화는 cPILOT의 타당성과 재현성을 증가시키고 유사한 자동화 장치를 사용하는 다른 연구진의 광범위한 사용을 가능하게 합니다.

도 2는 워크플로 복제를 포함하는 22-플렉스 cPILOT 실험으로부터 모든 22 리포터 이온 채널에서 확인된 펩티드의 대표적인 MS 데이터를 나타낸다. 도 2(상단)는 펩티드에 편입된 단일 디메틸 그룹을 나타내는 4Da m/z 간격으로 분리된 이중 충전 피크 쌍을 묘사한다. 가볍고 무거운 절제된 피크 쌍은 펩티드의 서열을 산출하기 위해 독립적으로 분리되고 단편화되었다. 펩타이드의 서열은 G(디메틸)AAELMQQK(TMT-11plex)이며 단백질 베타인 호모시스테인 S-메틸 트랜스퍼라제에 해당한다. 빛과 무거운 디메틸화피크(도시되지 않음)에대해 가장 강렬한 단편이 MS3 단편화및 리포터 이온(m/z 126-131)을 위해 더 격리되었다(m/z 126-131)는 도 2(아래)에 도시되었다. 리포터 이온 강도는 샘플내펩타이드 풍부에 직접 비례한다. 샘플의 펩타이드 풍부는 로봇 플랫폼의 파이펫팅 능력이 22개의 샘플에서 상당히 균일하다는 것을 의미합니다. 전반적으로, 이 22-플렉스 cPILOT 실험결과 1326 (1209 빛/1181 무거운) 단백질 식별 3098 (6137 빛/5872 무거운) 펩티드(표 4). 그림 3은 로그10 풍부함과 전체 리포터 이온 강도의 상자 플롯을 보여 주며, 22개 채널에서 샘플 간 가변성이 적다. 총 자동화에 대한 평가는 22개의 샘플에서 각 단백질에 걸쳐 리포터 이온 풍부의 오차를 검사하여 수행하였다. 도 4는 로봇 플랫폼을 사용하여 샘플 처리가 CV 값이 매우 낮게 생성되었다는 것을 보여줍니다. 구체적으로, 3098펩타이드를 통해 리포터 이온 풍부의 평균 CV는 각각 12.36% 및 15.03%로 가볍고 무거운 디메틸화 펩타이드에 대해 확인되었다. 이들 펩타이드 중 2032는 최소 임계값 이상의 리포터 이온 신호를 가지고 있으며 정량화 가능한 것으로 간주되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig1.jpg"> 그림 1. 자동화된 cPILOT 프로토콜과 병행하여 22개의 샘플을 처리하는 실험 워크플로우. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig2.jpg"> 그림 2. 22개의 견본에 걸쳐 펩티드의 정량화. 실시예 MS(위)와 MS3(하단) 펩티드 G(디메틸)AAELMQQK(TMT-11plex)의 스펙트럼은 22-플렉스 자동 cPILOT 실험에서 정량화되어 가벼운 디메틸화(왼쪽 아래) 및 무거운 디메틸화(오른쪽 아래) 피크이다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig3.jpg"> 그림 3. 총 리포터 이온 강도대비 100개의 풍부한 22개의 샘플이 프로테오메 디스커버러 2.3을 사용한다. RAW 파일은 동적 수정으로 TMT와 별도로 빛과 무거운 펩티드, 단백질 ID를 두 번 검색, 빛 (+28.031 Da) 및 무거운 (+36.076 &amp; +35.069 Da) 정적 수정으로 펩타이드 N-테르미니에서 디메틸화. 위의 모든 수정과 결합된 검색은 Proteome Discover 2.3을 사용하여 모든 채널에서 펩타이드 강도의 로그 10 풍부를 획득하여 실행하였다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61342/61342fig4.jpg"> 그림 4. 126-131 m/z채널에 걸쳐 합계 기자 이온 강도에서 펩티드 풍부의 변화의 공동 효율적인 바이올린 플롯. 펩타이드는 빛(2373)과 중성(2533)의 평균 CV 값12.36 및 15.03으로 정량화되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 도 1. 단일 펩타이드를 곁들인 cPILOT의 일러스트레이션. TMT126을사용하여 두 개의 상이한 샘플 및 동위원소 태깅의 등소 라벨링을 나타내고, 결과 혼합물은 LC-MS3에대한 MS에 주입되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61342/61342supfig1large.jpg" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>변수 이름</td>
			<td>값</td>
			<td>설명</td>
		</tr>
<tr>
<td>데솔삼1</td>
			<td>1065</td>
			<td>디솔트 1 단계에 사용할 부피</td>
		</tr>
<tr>
<td>디솔트삼2</td>
			<td>392</td>
			<td>디솔트 2 단계에 사용할 부피</td>
		</tr>
<tr>
<td>데솔삼3</td>
			<td>100</td>
			<td>디솔트 단계 3에 사용할 부피</td>
		</tr>
<tr>
<td>Devmode</td>
			<td>False</td>
			<td>거짓은 인큐베이션 시간을 30초로 줄입니다- True는 프로토콜의 인큐베이션 타이밍을 따릅니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>DTTVol</td>
			<td>3</td>
			<td>DTT 의 볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>필터 플레이트</td>
			<td>Targa</td>
			<td>탈염에 사용되는 플레이트</td>
		</tr>
<tr>
<td>필터 플레이트Vol</td>
			<td>600</td>
			<td>탈염용 볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>하워터와세스</td>
			<td>False</td>
			<td>SPE 플레이트의 물 세초 수</td>
		</tr>
<tr>
<td>IAMVol</td>
			<td>2</td>
			<td>요오도아세타미드의 부피</td>
		</tr>
<tr>
<td>펩티드TMTVol</td>
			<td>12.5</td>
			<td>TMT 라벨링을 위한 펩타이드의 부피</td>
		</tr>
<tr>
<td>압력</td>
			<td>100</td>
			<td>PPA의 mbar 압력</td>
		</tr>
<tr>
<td>템오프셋</td>
			<td>1</td>
			<td>온도 변화</td>
		</tr>
<tr>
<td>TMTVol</td>
			<td>10</td>
			<td>추가할 등부 태그 볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>트리스볼</td>
			<td>800</td>
			<td>소화 전에 샘플을 희석하는 부피</td>
		</tr>
<tr>
<td>트립신볼</td>
			<td>2</td>
			<td>트립신의 볼륨</td>
		</tr>
<tr>
<td>유즈팝타이머</td>
			<td>사실</td>
			<td>True는 필요한 경우 플레이트에 압력을 가할 수 있는 옵션을 표시합니다.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1. 자동화된 cPILOT 프로토콜에 사용되는 변수 목록입니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td>딜소스</td>
			<td>딜웰</td>
			<td>Dest</td>
			<td>데스트웰</td>
			<td>딜볼륨</td>
			<td>스톡소스</td>
			<td>스톡웰</td>
			<td>샘플Vol</td>
			<td>샘플 ID</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>A1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>A2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>A3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>A4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>A5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>A6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>A7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>A8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>A9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>A10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>A11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>A12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>B1</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>B2</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>B3</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>B4</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>B5</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>B6</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>B7</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>B8</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>B9</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>21</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>B10</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>22</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>B11</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>23</td>
		</tr><tr><td>8M_Urea</td>
			<td>1</td>
			<td>샘플</td>
			<td>B12</td>
			<td>90</td>
			<td>Stock_Samples</td>
			<td>A1</td>
			<td>10</td>
			<td>24</td>
		</tr></tbody></table>표 2. 마우스 간 균형 및 8 M 우레아의 부피.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>소스웰</td>
			<td>소스웰2</td>
			<td>기자 이온</td>
			<td>데스트웰1</td>
			<td>데스트웰2</td>
			<td>볼륨</td>
			<td>샘플 ID</td>
		</tr>
<tr>
<td>A1</td>
			<td>C1</td>
			<td>126</td>
			<td>A1</td>
			<td>E1</td>
			<td>10</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>A3</td>
			<td>C3</td>
			<td>127N</td>
			<td>A2</td>
			<td>E2</td>
			<td>10</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>A5</td>
			<td>C5</td>
			<td>127C</td>
			<td>A3</td>
			<td>E3</td>
			<td>10</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>A7</td>
			<td>C7</td>
			<td>128N</td>
			<td>A4</td>
			<td>E4</td>
			<td>10</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>A9</td>
			<td>C9</td>
			<td>128C</td>
			<td>A5</td>
			<td>E5</td>
			<td>10</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>A11</td>
			<td>C11</td>
			<td>129N</td>
			<td>A6</td>
			<td>E6</td>
			<td>10</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>B2</td>
			<td>D2</td>
			<td>129C</td>
			<td>A7</td>
			<td>E7</td>
			<td>10</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>B4</td>
			<td>D4</td>
			<td>130N</td>
			<td>A8</td>
			<td>E8</td>
			<td>10</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>B6</td>
			<td>D6</td>
			<td>130C</td>
			<td>A9</td>
			<td>E9</td>
			<td>10</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>B8</td>
			<td>D8</td>
			<td>131N</td>
			<td>A10</td>
			<td>E10</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B10</td>
			<td>D10</td>
			<td>131C</td>
			<td>A11</td>
			<td>E11</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3. 펩타이드, 단백질 및 펩타이드 스펙트럼 일치(PSM)의 총 수.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">자동화된 cPILOT</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>빛</td>
			<td>무거운</td>
		</tr>
<tr>
<td>단백질</td>
			<td>1209</td>
			<td>1181</td>
		</tr>
<tr>
<td>펩 티 드</td>
			<td>6137</td>
			<td>5872</td>
		</tr>
<tr>
<td>PSM</td>
			<td>14948</td>
			<td>16762</td>
		</tr>
</tbody></table>표 4. 가볍고 무거운 라벨이 붙은 샘플로 동면 태그를 바코딩합니다.

결합된 전구체 동위원소 라벨링 및 동위원소 태그(cPILOT)는 사용 가능한 동면 태그와 함께 동시에 분석할 수 있는 샘플 수를 증가시킬 수 있는 향상된 샘플 멀티플렉스 전략입니다. 로봇 플랫폼의 통합은 실험 처리량, 재현성 및 정량적 정확도를 크게 증가시켰습니다.

결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cPILOT)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

당사의 자동화된 cPILOT 프로토콜을 사용하면 연구원이 높은 처리량 방식으로 샘플을 쉽게 분석할 수 있습니다. 이것은 우리가 질병 또는 다른 조건에 관하여 생물학 정보에 훨씬 더 빨리 얻을 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 샘플을 병렬로 처리하여 높은 처리량 샘플을 사용하는 동안 실행 가능한 오류를 줄이는 데 도움이 된다는 것입니다.우리의 실험실은 노화와 알츠하이머 병과 관련된 응용 프로그램에 관심이 있습니다. 그러나, 이 기술은 또한 관련된 생물학적 조직이있는 곳에 어떤 질병 또는 도전을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 먼저 양압 장치, 가열 및 냉각 장치 및 진공 펌프를 켜는 것으로 시작합니다.모든 액세서리를 액체 처리기와 연결하면 컴퓨터에 연결되어 작동할 준비가 된 파란색 표시등이 표시됩니다. Aliquot 300 간 의 마이크로 리터는 500 마이크로 리터 튜브로 동형화하고 2 밀리리터 깊은 우물 접시에 놓습니다. 프로토콜이 시작될 때까지 샘플을 섭씨 4도에 저장합니다.소프트웨어에서 메서드를 열고 필요한 팁과 labware를 위치에 배치합니다. 그런 다음 최종 데크 레이아웃을 교차 검사하고 다음을 클릭하여 프로토콜을 계속합니다. 230 마이크로리터 팁을 적재하고 저수지에서 8개의 어어 우레아의 90마이크로리터를 흡인합니다.그런 다음 검은 색 2 밀리리터 깊은 우물 접시 중 하나를 행에 분배. TL1의 팁을 언로드하고 모든 우물에 우레아가 추가 될 때까지이 단계를 반복합니다. 데나처레이션 버퍼를 추가한 후 90개의 마이크로리터 팁을 사용하여 마우스 간 균질 10마이크로리터를 깊은 우물 판에 옮긴다.팁을 언로드한 다음 90개의 마이크로리터 팁 중 한 줄을 적재하고 시약 플레이트 1에서 DTT 3개의 마이크로리터를 흡인시합니다. DTT를 분배하여 깊은 우물 판의 1개와 두 줄을 열수 있습니다. 300 RPM에서 회전하는 동안 알루미늄 호일로 샘플 플레이트를 밀봉하고 섭씨 37도에서 600초 동안 배양합니다.인큐베이션 후, 90 마이크로리터 팁의 한 행을 로드하고, 시약 플레이트에서 IAM의 6마이크로리터를 3열에서 1개소로 흡인시키고, 시료 플레이트 중 하나를 행으로 분배한다. 냉각 장치의 300 RPM에서 회전하면서 샘플 플레이트를 밀봉하고 섭씨 4도에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오. 그런 다음 샘플 플레이트의 봉인을 풀고 90 개의 마이크로 리터 팁의 한 행을로드합니다.시약 플레이트에서 시스틴 5개의 마이크로리터를 2열에서 1개 소리터로 흡인시키고 샘플 플레이트 의 1개와 2열로 분배합니다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 30분 동안 1800 RPM의 시간 초과 쉐이크를 수행합니다.그런 다음 20 밀리머 트리 버퍼의 800 마이크로 리터를 샘플 플레이트에 각각 10 밀리마일알슘 염화칼슘을 첨가하여 두 개의 어금니로 우레아 농도를 희석시합니다. 트립신 20 마이크로리터를 96웰 플레이트의 첫 번째 행에 추가하고 접시를 데크의 지정된 위치에 놓습니다. 샘플 플레이트에 트립신을 추가한 후, 밀봉하여 가열 및 냉각 장치에 섭씨 37도 및 600 RPM에서 15시간 동안 배양합니다.포믹산 플레이트 3행으로부터 5%의 마이크로리터 150마이크로리터를 흡입하여 1열과 2열의 샘플 플레이트에 분배하여 소화를 중단한다. 펩티드를 탈염시키기 위해 진행합니다. 1070 마이크로리터 팁을 사용하여 아세토닐릴 600 마이크로리터를 흡인합니다.그런 다음 C-18을 활성화하기 위해 솔리드 상 추출 또는 SPE 플레이트의 1및 2 개 행에 분배합니다. 다음으로, 소화된 샘플을 두 번의 패스로 SPE 플레이트에 적재합니다. 두 줄의 팁을 로드하고, 소화된 샘플의 534 마이크로리터를 흡인하고, SPE 플레이트 의 1개와 두 줄에 분배합니다.플레이트에 압력을 가하고 모든 샘플이 로드될 때까지 이 단계를 반복합니다. 물로 세척하여 펩티드를 청소하고 0.1 %의 포믹 산에서 60 ~ 40 아세토나이트로 펩티드를 희석시. 그런 다음 양압 장치를 사용하여 펩티드를 엘로테하기 위해 수집 판 위에 플레이트를 놓습니다.흐름을 아래로 끌어와서 소프트웨어에서 필요한 팁과 labware를 설정하고 데크 레이아웃을 교차 검사한 다음을 클릭하여 디메틸화 프로토콜을 계속합니다. 펩티드를 1%의 아세트산으로 재구성한다. 디메틸화 라벨링을 수행하려면 90마이크로리터 팁을 적재하고 시약 플레이트 2의 두 번째 줄에서 60 밀리머 라이트 포름알데히드의 16 마이크로리터를 흡인한다.샘플 플레이트 중 하나를 행에 분배한 다음 팁을 언로드합니다. 90 마이크로리터 팁의 한 행을로드하고 시약 플레이트 2의 행 3에서 60 밀리마일러 무거운 포름알데히드의 16 마이크로 리터를 흡인. 샘플 플레이트 의 두 행을 분배하고 팁을 언로드합니다.90 마이크로리터 팁의 두 행을로드하고 24 밀리머 나트륨 시아노보로 하이드라이드의 16 마이크로 리터와 시약 플레이트 3의 열 1 개와 두 개의 밀리머 나트륨 시아노보로데우티라이드의 2열을 적재한 다음 시약 판 의 1개와 2개를 줄이면 시약을 분배하여 디메틸화 반응을 시작합니다. 팁을 내리고 궤도 셰이커를 사용하여 1800 RPM에서 15분 동안 시간 초과 된 쉐이크를 수행합니다. 그런 다음 90 마이크로 리터 팁의 두 행을로드하고 시약 플레이트 3 개 행 3 개 및 4 개에서 1 % 암모니아의 32 마이크로 리터를 흡인합니다.반응을 중지하기 위해 샘플 플레이트 2의 행 1 개와 두 개의 행으로 분배합니다. 탈염을 위한 새로운 2밀리리터 딥 웰 플레이트에 동일한 양의 빛과 무거운 디메틸화 펩타이드를 결합합니다. 결합 된 빛과 무거운 펩티드를 탈염 한 후 펩티드를 건조시키고 등소 적재를 수행합니다.궤도 셰이커에 100 밀리머 트리에틸모늄 중탄산염 버퍼의 100 마이크로 리터로 펩티드를 재구성. 그런 다음 90 마이크로리터 팁을 사용하여 합산 된 디메틸화 펩타이드의 25 마이크로 리터를 흡착하고 TMT 처리 플레이트의 첫 번째 행으로 분배하십시오. 90 마이크로리터 팁의 한 행을로드하고 TMT의 10 마이크로 리터를 흡인.TMT 처리 플레이트의 첫 번째 행에 분배하고 팁을 언로드한 다음 1800 RPM에서 1시간 동안 시간 조정된 쉐이크를 수행합니다. TEAB 플레이트 2열에서 8개의 마이크로리터를 흡인시키고 TMT 처리 플레이트 중 하나를 행으로 분배합니다. 1800 RPM에서 15 분 동안 쉐이크 한 후, TMT 라벨 펩티드의 30.5 마이크로 리터를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오.그런 다음 원고 방향에 따라 데이터 수집 및 분석을 진행합니다. 22개의 리포터 이온 채널에서 확인된 펩티드의 대표적인 MS 데이터는 22개의 플렉스 결합 전구체 동소성 라벨링 및 동소바릭 태깅 실험에서 본번 이에 도시된다. 펩티드의 서열은 베타인-호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라제에 대응한다.빛과 무거운 절제된 봉우리 모두에 대한 가장 강렬한 조각 이온은 MS3 단편화에 대해 더 격리되었습니다. 리포터 이온 강도는 샘플내펩타이드 풍부에 직접 비례한다. 전반적으로, 이러한 결합된 전구체 동소성 라벨링 및 동소바릭 태깅 실험은 시료 처리 시간을 단축하고 여러 채널 또는 조건에 걸쳐 단백질 발현을 시각화할 수 있게 하였다.로그 10 풍부와 모든 22개 채널의 총 리포터 이온 강도의 상자 플롯은 샘플 간 가변성이 낮습니다. 총 자동화에 대한 평가는 22개의 샘플에서 각 단백질에 걸쳐 리포터 이온 풍부의 오차를 검사하여 수행하였다. 로봇 플랫폼을 사용하여 샘플 처리는 매우 낮은 변동 계수를 초래했습니다.3098펩티드에 걸쳐, 리포터 이온 풍부의 평균 변동 계수는 각각 12.36 및 15.03%였다. 이 프로토콜을 시도할 때는 동위원소 및 동소근 수준이 단일 실험에 사용된다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 따라서 실험에 사용할 태그로 각 샘플을 지정하기 위해 신중한 계획을 수행해야 합니다.이 방법은 다른 로봇 시스템에 쉽게 통합될 수 있으며 조직 이나 세포 용액 및 기타 생물 유체와 같은 다양한 조직에 적용 될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

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배우세요 cPILOT 기법을 활용한 자동화된 샘플 멀티플렉싱 방법으로 단백질체학 연구의 처리량과 정확성을 높이세요. 이 프로토콜은 로봇 플랫폼을 통해 여러 샘플을 병렬로 분석하여 알츠하이머병 및 노화 관련 연구에 효율적으로 적용할 수 있습니다.

결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cPILOT)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스

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