결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cPILOT)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스

당사의 자동화된 cPILOT 프로토콜을 사용하면 연구원이 높은 처리량 방식으로 샘플을 쉽게 분석할 수 있습니다. 이것은 우리가 질병 또는 다른 조건에 관하여 생물학 정보에 훨씬 더 빨리 얻을 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 여러 샘플을 병렬로 처리하여 높은 처리량 샘플을 사용하는 동안 실행 가능한 오류를 줄이는 데 도움이 된다는 것입니다.

우리의 실험실은 노화와 알츠하이머 병과 관련된 응용 프로그램에 관심이 있습니다. 그러나, 이 기술은 또한 관련된 생물학적 조직이있는 곳에 어떤 질병 또는 도전을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 먼저 양압 장치, 가열 및 냉각 장치 및 진공 펌프를 켜는 것으로 시작합니다.

모든 액세서리를 액체 처리기와 연결하면 컴퓨터에 연결되어 작동할 준비가 된 파란색 표시등이 표시됩니다. Aliquot 300 간 의 마이크로 리터는 500 마이크로 리터 튜브로 동형화하고 2 밀리리터 깊은 우물 접시에 놓습니다. 프로토콜이 시작될 때까지 샘플을 섭씨 4도에 저장합니다.

소프트웨어에서 메서드를 열고 필요한 팁과 labware를 위치에 배치합니다. 그런 다음 최종 데크 레이아웃을 교차 검사하고 다음을 클릭하여 프로토콜을 계속합니다. 230 마이크로리터 팁을 적재하고 저수지에서 8개의 어어 우레아의 90마이크로리터를 흡인합니다.

그런 다음 검은 색 2 밀리리터 깊은 우물 접시 중 하나를 행에 분배. TL1의 팁을 언로드하고 모든 우물에 우레아가 추가 될 때까지이 단계를 반복합니다. 데나처레이션 버퍼를 추가한 후 90개의 마이크로리터 팁을 사용하여 마우스 간 균질 10마이크로리터를 깊은 우물 판에 옮긴다.

팁을 언로드한 다음 90개의 마이크로리터 팁 중 한 줄을 적재하고 시약 플레이트 1에서 DTT 3개의 마이크로리터를 흡인시합니다. DTT를 분배하여 깊은 우물 판의 1개와 두 줄을 열수 있습니다. 300 RPM에서 회전하는 동안 알루미늄 호일로 샘플 플레이트를 밀봉하고 섭씨 37도에서 600초 동안 배양합니다.

인큐베이션 후, 90 마이크로리터 팁의 한 행을 로드하고, 시약 플레이트에서 IAM의 6마이크로리터를 3열에서 1개소로 흡인시키고, 시료 플레이트 중 하나를 행으로 분배한다. 냉각 장치의 300 RPM에서 회전하면서 샘플 플레이트를 밀봉하고 섭씨 4도에서 30 분 동안 인큐베이션하십시오. 그런 다음 샘플 플레이트의 봉인을 풀고 90 개의 마이크로 리터 팁의 한 행을로드합니다.

시약 플레이트에서 시스틴 5개의 마이크로리터를 2열에서 1개 소리터로 흡인시키고 샘플 플레이트 의 1개와 2열로 분배합니다. 플레이트를 실온에서 30분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 30분 동안 1800 RPM의 시간 초과 쉐이크를 수행합니다.

그런 다음 20 밀리머 트리 버퍼의 800 마이크로 리터를 샘플 플레이트에 각각 10 밀리마일알슘 염화칼슘을 첨가하여 두 개의 어금니로 우레아 농도를 희석시합니다. 트립신 20 마이크로리터를 96웰 플레이트의 첫 번째 행에 추가하고 접시를 데크의 지정된 위치에 놓습니다. 샘플 플레이트에 트립신을 추가한 후, 밀봉하여 가열 및 냉각 장치에 섭씨 37도 및 600 RPM에서 15시간 동안 배양합니다.

포믹산 플레이트 3행으로부터 5%의 마이크로리터 150마이크로리터를 흡입하여 1열과 2열의 샘플 플레이트에 분배하여 소화를 중단한다. 펩티드를 탈염시키기 위해 진행합니다. 1070 마이크로리터 팁을 사용하여 아세토닐릴 600 마이크로리터를 흡인합니다.

그런 다음 C-18을 활성화하기 위해 솔리드 상 추출 또는 SPE 플레이트의 1및 2 개 행에 분배합니다. 다음으로, 소화된 샘플을 두 번의 패스로 SPE 플레이트에 적재합니다. 두 줄의 팁을 로드하고, 소화된 샘플의 534 마이크로리터를 흡인하고, SPE 플레이트 의 1개와 두 줄에 분배합니다.

플레이트에 압력을 가하고 모든 샘플이 로드될 때까지 이 단계를 반복합니다. 물로 세척하여 펩티드를 청소하고 0.1 %의 포믹 산에서 60 ~ 40 아세토나이트로 펩티드를 희석시. 그런 다음 양압 장치를 사용하여 펩티드를 엘로테하기 위해 수집 판 위에 플레이트를 놓습니다.

흐름을 아래로 끌어와서 소프트웨어에서 필요한 팁과 labware를 설정하고 데크 레이아웃을 교차 검사한 다음을 클릭하여 디메틸화 프로토콜을 계속합니다. 펩티드를 1%의 아세트산으로 재구성한다. 디메틸화 라벨링을 수행하려면 90마이크로리터 팁을 적재하고 시약 플레이트 2의 두 번째 줄에서 60 밀리머 라이트 포름알데히드의 16 마이크로리터를 흡인한다.

샘플 플레이트 중 하나를 행에 분배한 다음 팁을 언로드합니다. 90 마이크로리터 팁의 한 행을로드하고 시약 플레이트 2의 행 3에서 60 밀리마일러 무거운 포름알데히드의 16 마이크로 리터를 흡인. 샘플 플레이트 의 두 행을 분배하고 팁을 언로드합니다.

90 마이크로리터 팁의 두 행을로드하고 24 밀리머 나트륨 시아노보로 하이드라이드의 16 마이크로 리터와 시약 플레이트 3의 열 1 개와 두 개의 밀리머 나트륨 시아노보로데우티라이드의 2열을 적재한 다음 시약 판 의 1개와 2개를 줄이면 시약을 분배하여 디메틸화 반응을 시작합니다. 팁을 내리고 궤도 셰이커를 사용하여 1800 RPM에서 15분 동안 시간 초과 된 쉐이크를 수행합니다. 그런 다음 90 마이크로 리터 팁의 두 행을로드하고 시약 플레이트 3 개 행 3 개 및 4 개에서 1 % 암모니아의 32 마이크로 리터를 흡인합니다.

반응을 중지하기 위해 샘플 플레이트 2의 행 1 개와 두 개의 행으로 분배합니다. 탈염을 위한 새로운 2밀리리터 딥 웰 플레이트에 동일한 양의 빛과 무거운 디메틸화 펩타이드를 결합합니다. 결합 된 빛과 무거운 펩티드를 탈염 한 후 펩티드를 건조시키고 등소 적재를 수행합니다.

궤도 셰이커에 100 밀리머 트리에틸모늄 중탄산염 버퍼의 100 마이크로 리터로 펩티드를 재구성. 그런 다음 90 마이크로리터 팁을 사용하여 합산 된 디메틸화 펩타이드의 25 마이크로 리터를 흡착하고 TMT 처리 플레이트의 첫 번째 행으로 분배하십시오. 90 마이크로리터 팁의 한 행을로드하고 TMT의 10 마이크로 리터를 흡인.

TMT 처리 플레이트의 첫 번째 행에 분배하고 팁을 언로드한 다음 1800 RPM에서 1시간 동안 시간 조정된 쉐이크를 수행합니다. TEAB 플레이트 2열에서 8개의 마이크로리터를 흡인시키고 TMT 처리 플레이트 중 하나를 행으로 분배합니다. 1800 RPM에서 15 분 동안 쉐이크 한 후, TMT 라벨 펩티드의 30.5 마이크로 리터를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오.

그런 다음 원고 방향에 따라 데이터 수집 및 분석을 진행합니다. 22개의 리포터 이온 채널에서 확인된 펩티드의 대표적인 MS 데이터는 22개의 플렉스 결합 전구체 동소성 라벨링 및 동소바릭 태깅 실험에서 본번 이에 도시된다. 펩티드의 서열은 베타인-호모시스테인 S-메틸트랜스퍼라제에 대응한다.

빛과 무거운 절제된 봉우리 모두에 대한 가장 강렬한 조각 이온은 MS3 단편화에 대해 더 격리되었습니다. 리포터 이온 강도는 샘플내펩타이드 풍부에 직접 비례한다. 전반적으로, 이러한 결합된 전구체 동소성 라벨링 및 동소바릭 태깅 실험은 시료 처리 시간을 단축하고 여러 채널 또는 조건에 걸쳐 단백질 발현을 시각화할 수 있게 하였다.

로그 10 풍부와 모든 22개 채널의 총 리포터 이온 강도의 상자 플롯은 샘플 간 가변성이 낮습니다. 총 자동화에 대한 평가는 22개의 샘플에서 각 단백질에 걸쳐 리포터 이온 풍부의 오차를 검사하여 수행하였다. 로봇 플랫폼을 사용하여 샘플 처리는 매우 낮은 변동 계수를 초래했습니다.

3098펩티드에 걸쳐, 리포터 이온 풍부의 평균 변동 계수는 각각 12.36 및 15.03%였다. 이 프로토콜을 시도할 때는 동위원소 및 동소근 수준이 단일 실험에 사용된다는 점을 명심하는 것이 중요합니다. 따라서 실험에 사용할 태그로 각 샘플을 지정하기 위해 신중한 계획을 수행해야 합니다.

이 방법은 다른 로봇 시스템에 쉽게 통합될 수 있으며 조직 이나 세포 용액 및 기타 생물 유체와 같은 다양한 조직에 적용 될 수 있습니다.