여러 중추 신경계 영역에서 쥐 아교 세포의 해부 및 분리
2020년 6월 4일
여기에서는 마우스 CNS로부터 다중 신경교 세포 집단의 시험관 내 분리를 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 국소 미세아교세포, 희소돌기아교세포 전구체 세포 및 성상세포를 분리하여 다양한 배양 시스템에서 각각의 표현형을 연구할 수 있습니다.
이 프로토콜은 신경교세포가 형태학적, 기능적, 유전적으로 지역적으로 이질적이라는 것을 배우고 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 중추 신경계의 4개의 서로 다른 영역에서 3개의 분리된 신경교세포 부분 집합을 연구할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 사람은 저와 제 연구실의 대학원생인 Rachel Tinky가 맡을 것입니다.
가는 가위를 사용하여 강아지 머리의 정중선을 따라 피부층을 자르고 꼬리 방향으로 시작하여 주둥이에 도달할 때까지 배를 움직입니다. 조직 손상을 방지하기 위해 두개골 깊숙이 절개하지 마십시오. 머리를 아래로 비스듬히 기울여 피부층을 두개골의 양쪽으로 당기고 스프링 가위를 사용하여 두개골 매그넘에서 시작하여 두개골 정중선을 따라 절개합니다.
끝이 가늘고 있는 집게로 두개골 반쪽을 당겨 피질, 소뇌, 뇌간을 노출시킵니다. 일단 노출되면 두개골에서 뇌를 부드럽게 들어 올려 10ml의 PBS와 항생제 용액이 담긴 10cm 페트리 접시에 넣습니다. 뒷뇌가 부착된 상태에서 뇌가 손상되지 않은 상태로 유지되는지 확인합니다.
가늘게 구부러진 끝이 있는 집게로 소뇌를 꼬집습니다. 얼음 위에 지정된 15ml 원뿔형 튜브에 넣습니다. 피질에서 중뇌를 분리한다.
피질 수막을 제거하고 지정된 원뿔형 튜브에 넣습니다. 수막이 완전히 제거되었는지 확인하기 위해 조직을 주의 깊게 검사해야 합니다. 수막 세포가 배양에 남아 있으면 신경교세포의 성장에 해로울 수 있습니다.
척수를 절개하려면 배쪽이 위로 향하게 놓고 가느다란 용수철 가위를 사용하여 척수 조직이 노출될 때까지 왼쪽과 오른쪽을 번갈아 가며 척추뼈를 자릅니다. 척수와 수막을 부드럽게 제거하고 얼음 위의 지정된 원뿔형 튜브에 넣습니다. 0.53밀리몰 EDTA와 함께 0.05%트립신 1밀리리터를 조직이 있는 각 튜브에 추가합니다.
혼합물을 10ml 피펫으로 약 20회 분쇄합니다. 그런 다음 셀 현탁액을 빈 50ml 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 용액을 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 15분 동안 배양합니다.
8 분 후에 용해물을 부드럽게 교반합니다. 배양 후 MGM 5ml와 DNase I 200마이크로리터를 각 튜브에 하나씩 추가하여 최종 농도가 밀리리터당 50마이크로그램이 되도록 합니다. 10ml 피펫으로 각 용해물을 10회 분쇄합니다.
그런 다음 세포 현탁액을 실온에서 3분 동안 방치하여 해리되지 않은 조직이 튜브 바닥에 정착할 수 있도록 합니다. 세포 현탁액을 새로운 50ml 원추형 튜브로 옮기고 해리되지 않은 조직을 남깁니다. 원심분리 후 세포 펠릿을 MGM 5ml에 재현탁하고 20회 분쇄한 후 코팅된 T25 플라스크에 세포 현탁액을 플레이트화하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 세포를 배양합니다.
24시간 후에 미디어를 교체하여 세포 파편을 제거합니다. 희소돌기아교세포 전구체 세포 분리를 수행하려면 세포를 15시간 동안 흔든 다음 플라스크에서 상등액을 제거하고 멸균 페트리 접시에 플레이트에 담습니다. 상등액을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 30분 동안 배양합니다.
15분 후에 소용돌이치며 남아 있는 미세아교세포를 제거합니다. 비부착성 세포 상등액을 제거하고, 세포를 계수하고, 원하는 농도로 Poly-D-Lysine 코팅된 표면에 플레이트를 만듭니다. 세포를 최소 1시간 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다.
그런 다음 매체의 95%를 부드럽게 흡입하고 따뜻한 OPC 매체를 천천히 첨가하여 우물 벽에 피펫으로 올려 OPC의 중단을 최소화합니다. 이 방법은 인터페론 감마 신호가 OPC 분화 및 성숙에 영향을 미친다는 것을 입증하는 데 사용되었습니다. 인터페론 감마 수용체가 없으면 피질 OPC는 성숙한 수초돌기아교세포로 분화하지 않으며, 이는 MBP 염색이 없는 것으로 입증됩니다.
GFAP의 발현도 분석했습니다. 인터페론 감마 결핍 세포는 GFAP를 강하게 발현하며, 이는 성상세포 표현형을 채택하고 있을 수 있음을 시사합니다. CNS 세포의 국소 이질성은 피질, 소뇌, 뇌간 및 척수의 다양한 성상세포 형태에 의해 입증됩니다.
같은 영역의 성상세포는 또한 형태학적 이질성을 나타낼 수 있으며, 이는 이 신경교세포(glial subtype)가 매우 동적이라는 개념을 뒷받침합니다. 차등 사이토카인 자극에 대한 OPC의 지역적 반응도 조사했습니다. 사이토카인 신호전달은 줄기세포와 면역세포의 행동에 큰 영향을 미치며, OPC가 성숙한 수초돌기아교세포로 분화하는 방식에 영향을 미칠 수 있습니다.
다음 지역 신경교세포 분리 세포는 면역조직화학, 정량적 real-time PCR 및 웨스턴 블로팅을 포함한 여러 기술을 사용하여 다양한 실험 조건 및 산에서 사용할 수 있습니다.
개요
본 연구는 지역별 미세아교세포(microglia), 희소돌기아교세포 전구세포(oligodendrocyte precursor cells) 및 성상교세포(astrocytes)를 포함하여 마우스 중추신경계(CNS)로부터 다양한 글리아 세포군을 in vitro에서 분리하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법론을 통해 다양한 배양 시스템에서 각 글리아 세포 유형의 뚜렷한 표현형을 연구할 수 있으며, 이들의 지역적 이질성을 확인할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 글리아 세포 생물학
배경
- 글리아 세포는 형태, 기능 및 유전학적으로 지역적 이질성을 보입니다.
- 글리아 세포의 서로 다른 집단들을 이해하는 것은 중추신경계(CNS)에서 이들의 역할을 탐구하는 데 매우 중요합니다.
- 본 프로토콜을 통해 연구자들은 서로 다른 글리아 세포 유형 간의 상호작용을 연구할 수 있습니다.
- 특정 집단을 분리함으로써 중추신경계(CNS) 기능에 대한 이들의 구체적인 기여도를 파악할 수 있습니다.
연구 목적
- 중추신경계(CNS)의 서로 다른 영역에서 특정 글리아 세포 집단을 분리하는 방법을 개발한다.
- 분리된 글리아 세포 집단의 표현형 특성을 조사한다.
- 사이토카인 자극에 대한 희소돌기아교전구세포의 지역별 반응을 검토한다.
사용된 방법
- 글리아 세포 분리를 위해 인비트로(in vitro) 세포 배양 방법론이 사용되었습니다.
- 생물학적 모델에는 마우스 중추신경계(CNS) 조각에서 유래한 글리아 세포가 포함됩니다.
- 멀티오믹스 워크플로우는 언급되지 않았습니다.
- 주요 단계에는 해부, 트립신 처리 및 세포 현탁 기술이 포함됩니다.
- 최적의 결과를 얻기 위한 배양 및 세포 플레이팅 시간이 설명되었습니다.
주요 결과
- 본 프로토콜을 통해 서로 다른 CNS 영역에서 뚜렷한 글리아 세포군을 성공적으로 분리하였습니다.
- 본 연구에서는 인터페론 감마 신호 전달이 희소돌기아교 전구세포의 분화에 영향을 미친다는 점에 주목하였습니다.
- 별아교세포는 기원이 되는 CNS 영역에 따라 형태학적 이질성을 나타냈습니다.
- 사이토카인 신호 전달이 글리아 세포의 행동에 어떠한 영향을 미치는지 이해하는 데 있어 잠재적인 시사점이 강조되었습니다.
결론
- 본 연구는 중추신경계(CNS) 기능에서 글리아 세포의 역할을 분석하는 가치 있는 방법을 제시합니다.
- 특정 글리아 세포 하위 집단의 분리가 가능해짐에 따라, 연구자들은 이들의 고유한 기여도를 더 잘 이해할 수 있습니다.
- 이 프로토콜은 글리아 세포의 역동성과 환경적 신호에 대한 반응을 탐구하는 향후 연구를 지원합니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
글리아 세포의 지역적 불균질성은 중추신경계(CNS) 약물 발견 과정에서 타겟 검증 및 메커니즘적 리스크 감소에 영향을 미칩니다. 본 프로토콜은 표현형 스크리닝 및 분석법 개발을 지원하기 위해 네 가지 마우스 CNS 영역에서 미세아교세포, 희소돌기아교 전구세포 및 성상교세포를 분리하는 방법을 제시합니다. 정의된 세포 구성을 갖춘 질환 관련 시스템을 제공함으로써, 전임상 모델의 예측 신뢰도를 높이고 리드 화합물 발굴 전략 수립에 기여합니다.
바이오제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 피질, 소뇌, 뇌줄기 및 척수 영역 전반에 걸쳐 글리아 하위 집단의 표현형을 조사함으로써 표적 생물학을 명확히 하고 기전 가설의 위험 요소를 제거할 수 있습니다.
- 운영적 가치: 미세아교세포, OPC 및 성상교세포의 재현 가능한 분리를 제공하여 일관된 표적 결합 및 경로 조절 연구가 가능하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 화합물 스크리닝 및 사이토카인으로 매개되는 OPC 분화 및 성숙 효과 평가를 위해 지역적으로 정의된 글리아 배양물을 생성합니다.
- 운영적 가치: 기계적 해리 및 정의된 매트릭스 플레이팅을 통해 글리아 준비 과정을 표준화하여 분석 준비도와 확장성을 보장합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: 인터페론 감마 및 기타 사이토카인에 대한 국소 글리아 반응 평가를 지원하여, 바이오마커 정렬 및 병태생리학적 관련성에 대한 정보를 제공합니다.
- 운영적 가치: 글리아-뉴런 상호작용을 모델링하고 전임상 워크플로우에서 표적 매개 결과를 평가할 수 있는 공배양 및 단일 세포 유형 시스템을 가능하게 합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 리드 물질 발굴 전 타겟 검증, 분석법 개발 및 메커니즘적 리스크 제거를 위해 검증된 글리아 세포군을 제공함으로써 초기 발견 워크플로우에 통합됩니다.
- 발견 생물학: 중추신경계(CNS) 표적 조절 시 지역적 글리아 세포의 이질성과 사이토카인 신호 전달 경로에 대한 가설 검증을 용이하게 합니다.
- 스크리닝: 재현 가능한 화합물 스크리닝 및 표현형 판독을 위해 세포 구성이 정의된 표준화된 글리아 세포 현탁액을 제공합니다.
- 분석: 글리아 분화, 마커 발현(예: MBP, GFAP) 및 사이토카인 자극에 대한 기능적 반응의 정량적 측정을 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 지역적 글리아 표현형을 질환 관련 시스템과 연결하여, 전임상 모델에서 위험 조정된 진전 결정 과정을 지원합니다.
- 기업적 재활용: 지속적인 R&D 활용을 위해 여러 CNS 지역 및 실험 조건에 적용 가능한 확장 가능한 글리아 분리 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 메커니즘적 모호성의 감소와 지역 특이적 기능적 통찰력을 통한 글리아 표적 검증의 예측 신뢰도 향상.
- 운영적 가치: 표준화된 해리, 플레이팅 및 세포 분리 워크플로우를 통해 연구소 간 재현성과 확장성 보장.
- 전략적 가치: 글리아 표적 결합을 명확히 하고 CNS 프로그램의 후기 단계 생물학적 리스크를 줄임으로써 go/no-go 의사결정에 정보 제공.
- 포트폴리오 영향: 지역적 글리아 표현형 데이터와 사이토카인 반응 프로파일을 기반으로 리스크가 조정된 표적 우선순위 설정 가능.
실행 시 고려 사항
- CNS 영역을 분리하고 오염 없이 뇌수막을 제거하려면 신경해부학 및 무균 조직 박리에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 글리아 세포의 해리, 도말 및 증식을 위해 원심분리기, 피펫, CO2 배양기 및 코팅된 배양 플라스크가 필요합니다.
- 팀 간의 트립신 처리, DNase 처리 및 트리투레이션(trituration) 프로토콜을 표준화하여 일관된 글리아 세포 수득률과 생존율을 확보해야 합니다.
- 대체 모델 시스템(예: 인간 iPSC 유래 글리아)에 적용하려면 영역별 마커와 해리 효율에 대한 검증이 필요합니다.
- 제한 사항으로는 글리아 세포의 무결성을 유지하고 배양 중 뇌수막 세포의 과성장을 방지하기 위해 신속한 조직 처리가 필요하다는 점이 있습니다.
