단일 핵 세포세포의 다중 파라미터 흐름 세포측정 분석을 위한 마우스 눈 전체의 소화

이 프로토콜은 대식세포, 단핵구, 미세아교세포 및 수지상 세포를 포함하는 단핵 식세포의 다중 매개변수 유세포 분석을 위해 전체 마우스 눈을 단일 세포 현탁액으로 소화하도록 설계되었습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 표면 마커 발현을 사용하여 밀접하게 관련된 세포 유형을 구별하기 위해 형광단 강도의 정량 분석을 사용할 수 있다는 것입니다. 당사의 프로토콜은 laser-induced choroidal neovascularization model에서 상주 및 침투 집단을 모두 포함하는 대식세포 이질성 분석에 최적화되어 있습니다.

그러나 이러한 개념과 기술은 당뇨병성 망막병증, 실험적 자가면역 포도막염 및 루푸스 발현과 같은 다른 모델에도 동일하게 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜을 시도할 때 모든 유세포 분석기가 정확히 동일한 방식으로 구성되지 않기 때문에 유세포 분석기의 구성을 이해하는 것이 중요한 시작점입니다. 따라서 형광 접합 항체의 부피를 적정해야 할 수 있으며 세포분석기의 구성에 따라 프로토콜을 최적화하기 위해 형광단을 조정해야 할 수 있습니다.

원고 지침에 따라 소화 버퍼를 준비하는 것으로 시작합니다. 해부 현미경과 총 배율 10X를 사용하여 눈에서 남아 있는 결막과 시신경을 제거합니다. 깨끗한 눈을 마른 해부 접시나 작은 계량 보트로 옮긴 다음 가시축을 통해 90도 각도로 두 개의 천공을 만듭니다.

30게이지 바늘이 달린 주사기를 사용하여 0.15-0.2ml의 소화 완충액을 각 눈의 유리체강에 주입합니다. 스프링 가위와 가는 집게로 눈을 다진 다음 무딘 기계적 파괴로 렌즈 조직을 분리하여 후속 단계에서 피펫 팁이 막히는 것을 방지합니다. 집게와 가위를 0.75ml의 소화 완충액으로 헹구고 각 샘플에 대한 접시를 교체합니다.

P1000 피펫을 사용하여 접시의 내용물을 얼음 위의 해리 튜브로 옮기고 재료가 손실되지 않도록 주의합니다. 추가로 1.5ml의 소화 완충액으로 접시를 헹구고 해리 튜브에 추가하면 총 부피가 3.25에서 3.5ml 사이가 됩니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 전자 해리기에서 조직을 해리하고, 모든 조직이 역 해리 튜브의 바닥에 있고 분해 완충액과 접촉하는지 확인합니다.

그런 다음 해리관을 섭씨 37도 및 200RPM에서 30분 동안 배양합니다. 조직 해리를 두 번 더 반복하여 해리 사이에 30분 동안 섭씨 37도 및 200RPM에서 샘플을 배양합니다. 반응을 중지하려면 10ml의 저온 흐름 버퍼를 추가하고 샘플 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

단일 세포 현탁액을 생성하려면 50ml 원추형 원심분리기 튜브 상단에 배치된 40마이크로미터 필터를 통해 중단된 눈 소화 반응을 걸러냅니다. 2.5ml 주사기의 플런저를 사용하여 소화되지 않은 안구 조직의 남은 조각을 필터를 통해 밀어 넣습니다. 10ml의 유량 버퍼로 해리 튜브를 세척하고 필터를 헹굽니다.

그런 다음 동일한 플런저를 사용하여 소화되지 않은 눈 조직 조각을 다시 필터에 통과시킵니다. 5ml의 플로우 버퍼로 이 과정을 반복합니다. 그런 다음 해리 튜브와 필터를 최종 10ml의 유량 버퍼로 세척합니다.

원뿔형 튜브를 400배 G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 디캔팅합니다. 튜브를 다른 튜브에 대고 튕겨 펠릿을 부수십시오. 그런 다음 용해 용액 1ml를 넣고 실온에서 30초 동안 튜브를 휘젓고 적혈구를 용해합니다.

20ml의 흐름 완충액과 원추형 튜브의 원심분리기로 400배 G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 반응을 중지합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 디캔팅합니다. 튜브를 다른 튜브에 대고 튕깁니다.

그런 다음 차가운 HBSS 5ml를 넣으십시오. 원심분리를 반복하고 상층액을 제거합니다. P1000 피펫을 사용하여 각 샘플에 0.5ml의 살아있는 사체 염색을 추가하고 펠릿을 완전히 해리합니다.

샘플을 1.2ml 마이크로타이터 튜브로 옮기고 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다. 한편, 트리판 블루(trypan blue)와 혈구계(hemocyometer)로 샘플의 10마이크로리터 분취액을 계산합니다. 배양 후 400마이크로리터의 저온 흐름 완충액을 추가하여 각 샘플을 세척합니다.

마이크로타이터 튜브 랙의 튜브를 섭씨 4도에서 10분 동안 400배 G로 원심분리하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 흡인합니다. 500마이크로리터의 저온 흐름 버퍼에 세포를 완전히 재현탁합니다. 그런 다음 원심분리를 반복하고 상층액을 제거합니다.

50마이크로리터의 FC 블록에서 최대 500만 개의 살아있는 세포를 차단합니다. 세포 펠릿을 완전히 해리하고 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 샘플에 50마이크로리터의 항체 염색 용액을 추가합니다.

완전히 섞어 섭씨 4도에서 30분 더 배양합니다. 단일 마우스의 두 눈에서 분석된 모든 이벤트에 대한 전방 산란 영역 대 측면 산란 영역 속성이 여기에 표시됩니다. APC-Cy7에 PE를 플로팅하여 비드 수를 세척하고 확인하여 PE 양성 및 APC-Cy7 음성 이벤트의 밀집된 클러스터를 생성했습니다.

다음으로, 모든 이벤트에서 살아있는 세포의 싱글릿을 식별했습니다. Singlet은 전방 산란 면적 대비 전방 산란 면적에서 양의 상관관계를 보인 반면, Doublet 및 Triplet cell은 전방 산란 높이보다 전방 산란 면적이 더 컸습니다. 살아있는 세포는 전방 산란 영역 양성이고 살아있는 사체 염색은 음성입니다.

살아있는 singlet cell에서 mononuclear phagocyte를 묘사하기 위한 초기 게이팅 전략이 여기에 나와 있습니다. CD45 대 CD11b 플롯을 사용하여 라이브 싱글렛을 시각화했습니다. CD45 FMO에 CD45 양성 세포가 없다는 것은 게이트 선택을 확인했다.

다음으로, 호중구, 호산구, B 세포, K 세포 및 T 세포는 CD11b에 대한 계통 게이트가 있는 CD45 양성 라이브 싱글렛을 플롯하여 제외했습니다. CD45-dim 세포는 CD45-high 세포와 구별되었습니다. 대식세포 하위 집합(macrophage subset)도 확인되었습니다.

미세아교세포는 CD64 양성 MHC2 낮은 염색을 가진 CD45-dim 세포에서 규명되었습니다. MHC2 음성 대식세포는 CD64 양성 MHC2 음성으로 확인되었습니다. CD11c 음성 및 CD11c 양성 대식세포는 CD64 양성 CD11c 음성으로 입증되었습니다.

및 MHC2 양성 세포에서 CD64 양성 CD11c 양성. 레이저 치료는 MHC2 음성, CD11c 음성 및 CD11c 양성 대식세포의 양을 증가시키는 것으로 밝혀졌습니다. 수지상 세포 수는 또한 레이저 치료에 의해 상향 조절되었으며 미세아교세포와 단핵구 수는 영향을 받지 않았습니다.

전신 관류는 대식세포 수에 영향을 미치지 않았습니다. 이 절차에 따라 분석만 수행하는 대신 florescence activated cell sorting을 통해 대식세포 이질성과 이것이 기능에 미치는 영향을 전사체 또는 단백질체 연구를 통해 특성화할 수 있습니다.