Name: 단일 핵 세포세포의 다중 파라미터 흐름 세포측정 분석을 위한 마우스 눈 전체의 소화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 학습하세요 마우스 눈 전체를 소화하여 단일 핵 세포를 분리하고 다중 파라미터 흐름 세포측정으로 대식세포, 소세포교세포, 수지상세포를 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 안과 질환에서 면역세포 역할을 연구하는 데 필수적입니다.

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JAL은 NIH 보조금 K08EY030923에 의해 지원되었다; CMC는 NIH 국립 관절염 및 근골격계 질병 연구소의 K01 교부금(5K01AR060169)과 루푸스 연구 연합의 참신연구보조금(637405)의 지원을 받았습니다.

모든 절차는 노스 웨스턴 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었다. C57BL/6 마우스는 노스웨스턴 대학(시카고, 일리노이)의 비교 의학 센터의 장벽 시설에 수용되었습니다. 모든 동물은 음식과 물에 무료로 액세스 할 수있는 12/12 h 빛 / 어두운 주기에 보관되었다.
1. 안구 조직 의 수집
<ol><li>마우스가 반응하지 않고 더 이상 흡입할 때까지 이산화탄소의 규제 투여를 사용하여 성관계를 10-12주 된 C57BL/6J 마우스를 희생하십시오. 자궁 경부 탈구 또는 안락사를 보장하기 위해 다른 승인 된 보조 방법을 수행합니다. 참고: 경외 관류는 안구 조직에 없는 순환 백혈구를 제거하기 위해 수행될 수 있다. 이 실험에서 전신 관류는 치료되지 않거나 레이저로 처리된 전체 눈에서 검출된 마이크로글리아, 단핵구, 대식세포 또는 수지상 세포의 수를 감소시키지 않습니다. 따라서, 이러한 세포 유형의 대부분은 안과 조직에 위치하고 이 단계는 선택 사항입니다.</li>
	<li>눈을 방출하려면 소켓에서 눈에 띄는 곡선 집게 한 켤레를 눈 아래에 부드럽게 놓으면서 눈 소켓 근처에서 아래로 밀어 넣습니다. 실제 눈을 압박하지 않고 눈 밑에 닫혀 있는 집게를 꼬집습니다. 주변 결막에서 눈을 떼어 (사전 간행물을 참조하십시오)23.</li>
	<li>시신경이 눈을 분리하는 유일한 남은 연결이 될 때까지 측면으로 눈을 당깁니다. 시신경은 종종 긴장으로 절단하지만, 작은 가위는 때때로 시신경을 잘라 해야합니다. 1.7mL 마이크로센심분리기 튜브에 칼슘과 마그네슘을 곁들인 차가운 1x 행크의 완충식식용액(HBSS)에 눈을 놓습니다.</li>
</ol>2. 안구 조직의 소화
<ol><li>감기 HBSS에서 0.1 mg/mL 소화 효소및 0.2 mg/mL DNase를 함유한 소화 버퍼를 준비합니다. 분해 5 mg 소화 효소에 2 mL 멸균 수 처음에. HBSS에서 10 mg/mL DNase의 초기 희석을 준비하십시오. 소화 완충제의 10mL마다(3마리에 충분)는 0.4mL의 분해된 소화 효소와 희석DNase I의 0.2mL로 감기 HBSS의 9.4mL를 혼합한다. 참고: 이러한 농도는 세포 사멸을 감소시키면서 단일 세포의 항체 염색의 최적 수준을 제공하기 위해 여러 실험을 통해 경험적으로 결정되었다. 콜라게나아제 D는 세포 생존가능성이 감소하고 CD45+ 세포를 감소시키기 위한 소화 효소의 대안으로 시험하였다. 소화를 최적화하기 위한 반복 과정에 대한 자세한 내용은 토론을 참조하십시오.</li>
	<li>10배 의 총 배율에서 해부 현미경으로, 감기 HBSS에서 미세 집게와 스프링 가위를 사용하여 나머지 결막 및 시신경을 제거하십시오.</li>
	<li>깨끗한 눈을 마른 해부 접시 또는 작은 계량 보트로 이동합니다. 2개의 천공 상처가 시각적 축을 통해 눈에 만들어지고 소화 완충제 퇴신을 위한 이 첫 번째 상처에서 90° 떨어진 후에 유리체 구멍에 30G 바늘을 장착한 주사기를 통해 소화 버퍼의 0.15-0.20 mL/눈을 주입하십시오.</li>
	<li>0.5mm x 0.5mm보다 작은 모든 조각으로 스프링 가위와 미세 한 집게를 사용하여 전체 눈을 다진. 후속 단계에서 파이펫 팁을 막히는 것을 방지하기 위해 집게를 통해 무딘 기계적 중단렌즈 조직을 분리합니다. 각 샘플에 대해 0.75mL의 소화 버퍼로 각각 집게와 가위를 작은 접시에 헹구습니다. 각 샘플에 새 접시를 사용하십시오.</li>
	<li>접시의 내용을 P1000 파이펫을 사용하여 얼음에 해리 튜브로 전달하여 파이펫 이송에 있는 물질을 잃지 않도록 주의하십시오. 소화 버퍼의 추가 1.5 mL로 접시를 헹구면 용해 관의 총 부피를 3.25-3.50 mL로 가져 오는 다.</li>
	<li>전동식 프로그램인 실온에서 200rpm에서 1분 단방향 회전으로 구성된 전자 해리튜브와 달리기 사이클 "m_brain_03_01"에 반역된 소양 튜브를 배치합니다. 모든 조직이 소화 완충제및 이 및 남은 모든 단계에 대한 로터와 접촉하여 해리 튜브의 맨 아래에 있는지 확인하십시오.</li>
	<li>37°C에서 200rpm에서 30분 동안 흔들리는 인큐베이터에 해리 튜브를 놓습니다.</li>
	<li>추가 시간 2.6 및 2.7 단계를 반복합니다. 다음 30 분 인큐베이션은 2.6 단계에서와 같이 전자 해리를 사용하여 하나의 최종 기계적 소화를 수행합니다.</li>
	<li>10mL의 냉류 버퍼를 추가하여 반응을 멈추고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.</li>
</ol>3. 세포 현탁액 준비
<ol><li>단세포 서스펜션을 만들려면 50mL 원심분리기 튜브 상단에 놓인 40 μm 필터를 통해 중단된 눈 소화 반응을 부수십시오. 2.5mL 주사기의 플런저를 사용하여, 필터를 통해 소화되지 않은 눈 조직의 나머지 조각을 밀어 넣습니다.</li>
	<li>동일한 플런저를 사용하기 전에 10mL의 플로우 버퍼로 해리 튜브를 씻고 필터를 헹구고 소화되지 않은 눈 조직 조각을 필터를 통해 다시 전달합니다.</li>
	<li>5mL의 플로우 버퍼를 사용하여 3.2 단계를 반복합니다.</li>
	<li>마지막 10mL의 플로우 버퍼로 해리 튜브와 필터를 세척합니다. 참고: 소화 및 유량 버퍼의 총 부피는 각 샘플에 대해 약 38-40mL입니다.</li>
	<li>원심 분리는 4 °C에서 10 분 동안 400 x g에서 원심 튜브를 분리합니다. 셀 펠릿을 방해하지 않고 상류제를 decant.</li>
	<li>멸균 물에 10배 용액을 추가하여 1배 용액을 준비합니다. 다른 튜브에 튜브를 가볍게 하여 펠릿을 분해합니다. 적혈구를 lyse하려면 실온 (RT)에서 소용돌이치는 30 s용 1 x 용액 1 mL을 추가하십시오.</li>
	<li>플로우 버퍼20mL로 반응을 중지합니다.</li>
	<li>원심 분리는 4 °C에서 10 분 동안 400 x g에서 원심 튜브를 분리합니다. 셀 펠릿을 방해하지 않고 상류제를 decant.</li>
	<li>다른 튜브에 튜브를 가볍게 하여 펠릿을 분리합니다. 튜브 당 차가운 1x HBSS 5mL를 추가합니다.</li>
	<li>4°C에서 10분 동안 400 x g의 원심분리기 튜브. 흡인 슈퍼 네티볼.</li>
</ol>4. 단핵 교핵 세포에 대한 세포 현탁액의 염색
<ol><li>차가운 HBSS에서 라이브/데드 염료 1:5,000를 희석하여 샘플당 0.5mL의 라이브/데드 얼룩을 준비하십시오.</li>
	<li>P1000 파이펫을 사용하여 각 샘플에 라이브/데드 얼룩을 추가하여 펠릿을 완전히 분리합니다. 샘플을 1.2mL 마이크로 티터 튜브로 이송합니다.</li>
	<li>작은 알리쿼트(10μL)를 사용하여 혈류계 또는 자동 세포 카운터를 사용하여 셀을 계산합니다(참조 4.4 참조). 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 라이브 / 데드 얼룩으로 샘플을 인큐베이션하십시오.</li>
	<li>Trypan blue를 사용하여 셀을 계산하여 샘플당 라이브 셀 수를 결정합니다. 참고: 일반적으로 10-12주 된 C57BL/6J 마우스의 눈 2개가 2 x 106 살아있는 세포를 함유하고 있습니다.</li>
	<li>차가운 흐름 버퍼400 μL을 추가하여 샘플을 세척하십시오. 4°C에서 10분 동안 400 x g의 마이크로 티터 튜브 랙의 원심분리기 튜브. 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탈을 흡인시합니다.</li>
	<li>콜드 플로우 버퍼의 500 μL에서 셀을 완전히 다시 중단합니다. 4°C에서 10분 동안 400 x g의 마이크로 티터 튜브 랙의 원심분리기 튜브. 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탈을 흡인시합니다.</li>
	<li>Fc 블록의 50 μL에서 최대 5 x 106 살아있는 세포를 차단하십시오 (정제 된 쥐 의 차가운 흐름 버퍼에서 1:50 희석). 5 x 106 이상의 살아있는 세포가 면, 적절하게 볼륨을 증가시면.</li>
	<li>펠릿에 FC 블록을 추가하여 샘플을 완전히 분리합니다. 4 °C에서 20 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>5 x 106 살아있는 세포당 항체 염색 용액50 μL(용액에 포함된 각 항체의 선택 및 양을 위한 표 1 참조)을 Fc 블록의 세포에 직접 넣고 완전히 섞는다. 4 °C에서 30 분 동안 배양하십시오. 참고: 항체 수량은 유동 세포계 구성에 따라 달라지며 모든 실험실 및 기기에 대해 독립적으로 적정화되어야 합니다. 필터와 미러의 계측기 구성은 표 2를 참조하십시오. 항체를 적재하려면 제조업체의 권장 사항으로 시작하여 염색 지수를 계산합니다. 다양한 항체 농도(제조업체의 권장 량 상하)의 테스트 실행을 수행하고 염색 지수가 유지되는 항체의 가장 낮은 농도를 선택합니다. 또한 단일 색상 컨트롤보다 덜 밝은 포지티브 염색을 보장합니다. 얼룩이 없는 세포를 사용하여 음수 염색된 세포가 규모에 있고 1 x 102미만의 피크가 있는지 확인하십시오. 형광을 사용하여 하나의 대조군을 사용하여 양색 된 세포를 정의하십시오.</li>
	<li>냉류 버퍼 700μL을 추가하여 시료를 세척합니다. 4°C에서 10분 동안 400 x g의 마이크로 티터 튜브 랙의 원심분리기 튜브. 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탈을 흡인시합니다.</li>
	<li>선택적으로, 항체 염색 후, 시료는 플로우 버퍼에서 2% 파라포름알데히드의 500 μL로 고정될 수 있다. 실온에서 15분 동안 샘플을 수정합니다. 이어서, 4.10에 기재된 대로 한 번의 세척을 수행한다. 고정 샘플을 4°C에 저장합니다. 카운트 구슬은 흐름 세포 측정 데이터 수집 당일에 추가되어야 합니다. 고정 된 샘플은 1-2 일 동안 유동 세포계에서 실행해야합니다. 주의: 파라포름알데히드는 부식성 및 건강 상의 위험입니다.</li>
	<li>차가운 흐름 버퍼 500 μL을 사용하여 샘플을 다시 세척하십시오. 4°C에서 10분 동안 400 x g의 마이크로 티터 튜브 랙의 원심분리기 튜브. 셀 펠릿을 방해하지 않고 상류체의 절반을 흡인시합니다.</li>
	<li>펠릿을 다시 중단하고 96 우물, U-바닥 분석 플레이트로 전송합니다. 4°C에서 5분 동안 400 x g의 원심분리기 플레이트. 상류제를 장식하려면 접시를 뒤집어 한 번의 강한 흔들림으로 액체를 싱크대 분지로 빼내고 펠릿을 방해하지 마십시오.</li>
	<li>새로운 1.2 mL 마이크로 티터 튜브에 잘 소용돌이 카운트 구슬의 50 μL을 배치합니다.</li>
	<li>콜드 플로우 버퍼의 200 μL에서 96 개의 웰 플레이트에서 펠릿을 다시 중단합니다. 이전 단계에서 구슬 위에 셀 혼합물을 추가합니다. 250 μL /마이크로 티터 튜브의 총 부피로 유동 세포계에서 실행합니다.</li>
</ol>5. 유동 세포측정 데이터 수집
<ol><li>켜고 흐름 세포계를 준비합니다. 여기에 나열된 지침은 수정된 4개의 레이저 사이토미터(표2)에대한 것입니다.</li>
	<li>각 샘플의 작은 알리쿼트가 포함된 테스트 샘플을 실행하여 각 검출기에 대해 모든 세포가 스케일에 있는지 확인합니다. 모든 셀이 스케일에 있도록 전압을 조정합니다.</li>
	<li>염색 칵테일(표3)에사용되는 모든 불소에 대해 단일 색상 컨트롤(SCC)을 실행합니다. 마이크로 티터 튜브를 더 큰 5mL 폴리스티렌 튜브에 넣고 유동 세포계 단계에 배치합니다. 참고: BV421(퍼시픽 블루), FITC, PE, Alexa647(APC), 알렉사700과 같은 루트 형광은 칵테일과 동일한 항체를 필요로 하지 않습니다(즉, CD64 PE용 CD19 PE). 그러나, PE-CF594, PE-Cy7 또는 APC-Cy7과 같은 탠덤 형광은 공주형 형광의 잠재적 해리로 인한 칵테일과 같은 SCC에 대해 동일한 항체를 필요로 한다.<ol>
<li>햄스터 안티 마우스 CD11c BV421의 1 μL과 함께 1.2 mL 티터 튜브에 2 방울의 보정 구슬을 추가하여 BV421에 대한 SCC를 만듭니다. 보상 구슬은 CD11c BV421이 5.3.3에 설명된 바와 같이 카파가 아닌 IgG 람다 하위형이기 때문에 사용된다. 4 °C에서 15 분 동안 배양하십시오. 0.2mL의 흐름 버퍼를 추가합니다.</li>
		<li>아민 반응성 구슬에서 1방울의 포지티브 염색 구슬(녹색 캡)을 추가하고 라이브/데드 염료 1μL을 추가하여 라이브/데드 염료에 대한 SCC를 만듭니다. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 배양하십시오. 아민 반응성 구슬에서 음수 구슬(흰색 캡)을 한 방울 더 넣습니다. 0.2mL의 흐름 버퍼를 추가합니다.</li>
		<li>안티래트 및 항햄스터 Ig 카파 비드 세트에서 양성 염색 구슬(green cap)의 한 방울을 첨가하고, 1.2mL 티터 튜브에 나열된 항체 수량(표3)을첨가하여 나머지 SCC를 생성한다. 4 °C에서 15 분 동안 배양하십시오. 안티 랫과 안티 햄스터 이그 카파 구슬 세트에서 네거티브 구슬 (흰색 모자)의 한 방울을 추가합니다. 0.2mL의 흐름 버퍼를 추가합니다.</li>
		<li>소용돌이 모든 비드 혼합물은 완전히. 최대 3 일 동안 4 °C에서 SCC를 저장합니다. 참고: 형광 기자 마우스에 대한 SCC는 얼룩이 없는 세포입니다.</li>
		<li>SCC를 실행할 때, SCC 샘플이 동일한 검출기 채널의 세포 샘플에 대한 형광보다 큰 피크를 가지는 것과 같은 전압을 설정합니다. 또한, 모든 SCC가 관심 채널의 히스토그램 피크와 다른채널(그림 1)의히스토그램 피크 사이에 최소 0.5 로그 차이가 있도록 전압을 설정해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>"낮은" 유지 이벤트/초 아래 4000에서 샘플을 실행합니다. 유량을 적절히 낮출 수 없는 경우 추가 냉류 버퍼로 샘플을 희석합니다. 카운트 계산에 필요한 볼륨을 기록합니다(대표 결과 참조).</li>
	<li>샘플당 최소 3 x 106 이벤트를 수집합니다. 이것은 당신의 세포계에 사건으로 계산하는 안료 과립 및 파편 때문에 세포 수 보다는 더 높을 지도 모릅니다.</li>
	<li>6.4항에서 적절한 게이팅 전략에 대해 라이브/데드 이외의 각 형광에 대해 형광 마이너스 원(FMO)을 기록합니다. FMO는 하나를 제외한 모든 형광으로 염색된 샘플입니다.</li>
	<li>제조업체 또는 시설 지침에 따라 흐름 사이토미터를 청소하고 종료합니다.</li>
</ol>6. 유동 세포측정 데이터 의 화형
<ol><li>분석 소프트웨어를 사용하여 새 워크시트를 엽니다. 모든 샘플 및 단일 색상 컨트롤에 대해 사이토미터에서 FCS 파일을 가져옵니다.</li>
	<li>SCC를 사용하여 보상 행렬을 만듭니다.</li>
	<li>얼룩진 샘플 및 FmOs에 보상 매트릭스를 적용합니다.</li>
	<li>FmOs를 사용하여 게이트를 그리는 양색 얼룩을 결정합니다.</li>
</ol>

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다중 파라미터 유동 세포측정은 복잡한 조직에서 다중 세포 유형의 정량적 분석을 가능하게 한다. 이 보고서에서는 마우스 눈의 레이저 부상 후 단핵 세포, 수지상 세포 및 대식세포 서브셋을 포함한 단일 핵 세포 개체 개체 집단의 유동 세포 측정 검출을 설명합니다. Liyanage 등은 최근 호중구, 호산구, 림프구, DC, 대식세포, 침투 대식세포 및단핵구(27)를검출하기 위한 유사한 게이팅 전략을 보고했다. 우리의 게이팅 전략은 주로 CD64의 추가에 의해 다릅니다. Liyanage 등은 DC를 CD4 -CD8-B220-CD11b+CD11c+ 세포, 및 대식세포CD4-CD8-B220-CD11b+CD11c-NK1.1-Ly6G- 셀로 식별합니다. 우리는<sup...

타고난 면역 계통은 보충 활성화 및 염증을 자극하는 다중 세포 모형을 포함합니다. 타고난 면역 세포는 자연 살인자 (NK) 세포, 비만 세포, basophils, 호산구, 호중구 및 단핵 phagocytes를 포함합니다. 단핵 세포, 대식세포 및 수지상 세포로 구성된 단핵 phagocytes는, 포도막염, 당뇨병 망막증 및 나이 관련 황반 변성을 포함하여 다중 안과 조건의 병리생리학에 연루되었습니다 (AMD)1. 이 프로토콜에서는, 우리는 neovascular AMD2의마우스 모형에 있는 다중 파라미터 유량 세포측정 분석을 사용하여 단핵 phagocytes의 식별에 집중할 것입니다. 이 프로토콜은 당뇨병 망막증 및/또는 방류염의 마우스 모델에 적응할 수 있지만 이러한 질병의 전신 특성 때문에 더 광범위한 안구 해부를 권장합니다.
단일 핵 세포는 중첩 세포 표면 마커를 표현합니다. 오래 지속되는 조직 상주 대식세포 및 마이크로글리아는 노른자 낭 유래 에리스로마일로이드 전구체3로부터유래하며, 대식세포및 수지상세포를 재활용하면서 골수 유래 대식세포 수지상 세포 전구4와분화한다. 단핵구, 대식세포 및 수지상 세포에 공통적인 마우스 세포 표면 마커는 CD45, CD11b5,F4/806,Cx3cr17및 세포내 마커 Iba18을포함한다. 이러한 과제를 극복하기 위해 다중 조직에서 대식세포, 단핵구 및 수지상 세포의 전사 분석은 CD64를 대식세포 별 세포 표면 마커6으로정의한다. 대식세포는 아이리스, 코로이드, 주모체 및 시신경에서 건강한 눈3에서기술되었다. 대안적으로, 수지상 세포 식별은 더 어렵습니다; 수지상 세포 식별의 가장 구체적인 방법은 Zbtb46-GFP 리포터 마우스9를사용하여 운명 매핑이 필요합니다. 이러한 리포터 라인과 무관한 CD64의 부재와 함께 CD11c 및 MHCII의 발현은 잠재적 수지상 세포6,10을식별할 수 있다. 수지상 세포는 정상눈(11)에서각막, 결막, 홍채 및 코로이드에서 확인되었습니다. Microglia는 망막에 위치한 전문 대식세포이며, 혈액 망막 장벽에 의해 보호되고, 노른자 낭 전구세포(12)로부터유래된다. 그 결과, 망막 마이크로글리아는 CD45발현(13)과 높은 수준의 Tmem119의 희미한 수준에 의해 단세포 유래 대식세포로부터 분화될 수 있으며, 이는 유동 세포측정항체(14)로이용된다. microglia 활성화시, 그러나, CD45는15및 Tmem119가 마이크로글리아 생물학의 복잡성을 보여주는 다운 규제3일수 있고 이것은 AMD와 그것의 마우스 모형 둘 다에서 관련될 가능성이 높습니다. 마지막으로, 단핵구는 고전과 비고전을 포함하여 적어도 두 개의 특수형으로 나눌 수 있습니다. 클래식 단핵구디스플레이 CCR2+Ly6C높은CX3CR1낮은 발현, 비클래식 단핵구는 CCR2-Ly6C로우CX3CR1하이 마커5를보여줍니다.
마커 발현의 정량적 분석의 필요성으로 인해, 즉, 낮은/딤 수준대 높은, 다중 파라미터 흐름 세포분석은 눈 및 기타 조직에서 단핵구, 대식세포, 마이크로글리아 및 수지상 세포 간의 차별을 위한 이상적인 방법입니다. 추가적인 이점은 하위 집단의 식별, 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 사용하여 전사 또는 프로테오믹 분석을 위한 세포 집단을 분류하는 기능, 운명 매핑을 포함한다. 다중 파라미터 흐름 세포측정의 주요 단점은 조직 아키텍처의 부족이다. 각막, 결막, 홍채, 렌즈, 망막 및 choroid-sclera 복합체 : 이것은 다양한 안구 하위 구획으로 안과 해부에 의해 극복 될 수있다. 추가적으로, 확인 면역 형광 화상 진찰은 수행될 수 있습니다, 그러나 마커의 수 및 강력한 수량의 부족에 의해 제한됩니다.
게놈 넓은 협회 연구는 AMD16과다중 보완 유전자를 연결했다. 보완 활성화는 아나필라톡신 생산, 백혈구 모집 및 결과 염증으로 이어집니다. 보완 수용체 결핍 마우스에서 레이저 부상은 단핵 phagocyte 모집 및 레이저 유도 된 천골 신혈관화 (CNV)영역(17)을감소시킨다. 유사하게, C-C 모티프 케모키네 수용체 2(CCR2) 녹아웃 마우스는 조직에 대한 단세포 모집에 결핍되어, 단일핵 세포모집및 레이저 유도 CNV영역(18)을모두 감소시키는 것을 보여준다. 이러한 데이터 링크는 실험적인 CNV 및 아마도 신생 혈관 AMD와 상호 핵 phagocytes를 보완합니다. 이 협회의 지원에서, 보충 수용체는 신생아 AMD19,20을가진 환자에 있는 말초 혈액 단핵구에 소화된다. 이 데이터는 AMD와 단핵 phagocytes 사이 강한 협회를 보여줍니다.
본 원고에서는, 다중 파라미터 유동 세포측정을 이용하여 마우스 눈내의 단일핵 식세포 집단을 특성화하기 위해 실험레이저 유도 CNV 모델을 사용할 것이다. 레이저 유도 CNV는 현재 제1회 선 neovascular AMD치료(21)의효능을 입증한 중혈관 AMD의 표준 마우스 모델이다. 이 프로토콜은 마우스 눈의 enucleation, 안구 해부, 단일 세포 현탁액으로의 소화, 항체 염색, 단일 색상 제어를 사용하여 레이저 전압의 결정 및 형광을 뺀 하나(FMO) 컨트롤을 사용하여 게이팅 전략을 설명합니다. 레이저 유도 CNV 모델에 대한 자세한 설명은 이전간행물(22)을참조하십시오. 이 프로토콜을 사용하여 마이크로글리아, 단핵구, 수지상 세포 및 대식세포 집단을 정의합니다. 또한, 우리는 MHCII와 CD11c를 사용하여 레이저 유도 된 CNV 모델 내에서 대식세포 하위 집합을 더욱 정의할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>0.6ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.7ml 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>10ml 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>431031</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원추형</td><td>ThermoFisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 500ml</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>2.5ml 주사기</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>7886-1</td><td></td></tr><tr><td>20% 파라포름알데히드 용액</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>25ml 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>431032</td><td></td></tr><tr><td>30G 바늘</td><td>Exel</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>3ml 루어 잠금 주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955457</td><td></td></tr><tr><td>41 x 41 x 8mm 폴리스티렌 무게 접시</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원뿔</td>형 <td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-well, 뚜껑이 없는 U-하단 분석 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>아민 반응성 비드</td><td>ThermoFisher</td><td>A10628</td><td></td></tr><tr><td>분석 소프트웨어</td><td>FlowJo</td><td>v 10</td><td></td></tr><tr><td>안티 랫 및 안티 햄스터 Ig 카파 비드 세트</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기 슬라이드</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>보상 비드</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>카운트 비드</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>곡선 겸자</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-123</td><td></td></tr><tr><td>소화 효소</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td><td>DC3-420T</td><td></td></tr><tr><td>해리 튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>전자 해리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva 소프트웨어</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fc 블록, 쥐 안티 마우스 CD16 / CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>미세 집게</td><td>Integra Miltex</td><td>17035X</td><td></td></tr><tr><td>플로우 버퍼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플로우 튜브</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Hamster 안티 마우스 CD11c BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562782</td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td>bucket Fisher Scientific</td><td>07-210-123</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead dye</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>용해 용액, 10x 용액</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Micro titer tube and rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-380</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 마우스 CD64 PE</td><td>BioLegend</td><td>139304</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티 NK1.1 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562864</td><td></td></tr><tr><td>P1000 피펫 팁</td><td>Denville Scientific</td><td>P2404</td><td></td></tr><tr><td>P1000 피펫</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>P2 피펫 팁</td><td>eppendorf</td><td>22491806</td><td></td></tr><tr><td>P2 피펫</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>P20 피펫 Gilson</td><td></td><td>FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>P200 피펫 팁</td><td>Denville Scientific</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>P200 피펫터</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipet man</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 B220 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562313</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD11b APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD19 AlexaFluor 700</td><td>BD Biosciences</td><td>557958</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD19 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD4 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562314</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD45 FITC</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD45 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552848</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 CD8 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562315</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 Ly6C</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>561085</tr><tr><td>쥐 안티 마우스 Ly6G PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562700</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 MHC II AlexaFluor 700</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 Siglec F PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td></td></tr><tr><td>쥐 안티 마우스 Tim4 AlexaFluor647</td><td>BD Biosciences</td><td>564178</td><td></td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터</td><td>Labnet</td><td>311DS</td><td></td></tr><tr><td>스프링 가위</td>, <td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr>, <tr><td>멸균 세포 여과기, 40mm 나일론 메쉬,</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr>, <tr><td>멸균수, 500ml,</td><td>Gibco</td><td>A12873-01</td><td></td></tr>, <tr><td>스윙 버킷, 원심분리기</td>, <td>eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>, Trypan blue, 0.4% 용액</td>, <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 핵 세포세포의 다중 파라미터 흐름 세포측정 분석을 위한 마우스 눈 전체의 소화

Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

타고난 면역 계통은 방류염, 당뇨병 망막병증 및 나이 관련 황반 변성을 포함하여 안구 병리학에서 중요한 역할을 합니다. 선천성 면역 세포, 특히 단핵 phagocytes는, 이 인구를 확인하는 도전을 만드는 중첩된 세포 표면 마커를 표현합니다. 다중 파라미터 흐름 세포측정은 마우스 눈에서 단핵구, 대식세포, 마이크로글리아 및 수지상 세포를 분화하기 위해 다중 세포 표면 마커의 동시적 정량적 분석을 가능하게 한다. 이 프로토콜은 전체 마우스 눈의 enucleation, 안구 해부, 단일 세포 현탁액으로의 소화 및 골수성 세포 마커에 대한 단일 세포 현탁액의 염색을 설명합니다. 또한 단일 색상 컨트롤을 사용하여 전압을 결정하고 형광을 사용하여 양성 게이트를 구분하는 데 적합한 방법을 설명합니다. 다중 파라미터 흐름 세포측정의 주요 한계는 조직 아키텍처의 부재이다. 이러한 제한은 개별 안구 구획의 다중 파라미터 흐름 세포측정또는 무료 면역형광 염색에 의해 극복될 수 있다. 그러나 면역 형광은 대부분의 현미경에 정량적 분석의 부족과 형광수 감소에 의해 제한됩니다. 우리는 레이저 유도 된 천체 신생 혈관화에서 단핵 phagocytes의 고도로 정량적 분석을 제공하기 위해 다중 파라메트릭 흐름 세포측정제의 사용을 설명합니다. 또한, 다중 파라미터 흐름 세포측정은 전사 또는 프로테오믹 연구를 위한 대식세포 서브세트, 운명 매핑 및 세포 분류의 식별에 사용될 수 있다.

도 1은 적색 레이저용 SCC 및 세포에 대한 보상되지 않은 주파수 히스토그램을 보였다: Alexa647, Alexa700, 및 APC-Cy7. 도 1A에서,마젠타 라인은 Alexa647에 대한 SCC의 피크를 묘사하고, 시안 선은 의도된 0.5 로그 차이를 나타냈다. Alexa700 및 APC-Cy7의 피크는 시안 선의 왼쪽(덜 밝은)에 있었다는 점에 유의하십시오. 또한 세포는 모두 마젠타 선의 왼쪽에 있었다는 점에 유의하십시오. SCC 피크의 오른쪽에 있는 모든 세포는 보상되지 않았습니다. 특정 채널은 플루오로크롬 염료의 화학에 기초하여 다른 채널로 유출하는 것으로 알려졌다(즉,. 바이올렛 레이저: BV421 -&gt; V500, 옐로우 그린 레이저: PE-&gt; PE-CF594, 레드 레이저: Alexa647 -&gt; Alexa700, Alexa700 -&gt; APC-Cy7, 크로스 레이저: PE-Cy7 -&gt...

본 프로토콜은 단핵세포, 마이크로글리아, 대식세포 및 수지상 세포를 포함하는 특정 안구 단핵 교핵 세포집단을 식별하기 위해 다중 파라미터 유동 세포측정 분석을 목적으로 전체 눈을 단일 세포 현탁액으로 소화하는 방법을 제공한다.

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

이 프로토콜은 대식세포, 단핵구, 미세아교세포 및 수지상 세포를 포함하는 단핵 식세포의 다중 매개변수 유세포 분석을 위해 전체 마우스 눈을 단일 세포 현탁액으로 소화하도록 설계되었습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포 표면 마커 발현을 사용하여 밀접하게 관련된 세포 유형을 구별하기 위해 형광단 강도의 정량 분석을 사용할 수 있다는 것입니다. 당사의 프로토콜은 laser-induced choroidal neovascularization model에서 상주 및 침투 집단을 모두 포함하는 대식세포 이질성 분석에 최적화되어 있습니다.그러나 이러한 개념과 기술은 당뇨병성 망막병증, 실험적 자가면역 포도막염 및 루푸스 발현과 같은 다른 모델에도 동일하게 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜을 시도할 때 모든 유세포 분석기가 정확히 동일한 방식으로 구성되지 않기 때문에 유세포 분석기의 구성을 이해하는 것이 중요한 시작점입니다. 따라서 형광 접합 항체의 부피를 적정해야 할 수 있으며 세포분석기의 구성에 따라 프로토콜을 최적화하기 위해 형광단을 조정해야 할 수 있습니다.원고 지침에 따라 소화 버퍼를 준비하는 것으로 시작합니다. 해부 현미경과 총 배율 10X를 사용하여 눈에서 남아 있는 결막과 시신경을 제거합니다. 깨끗한 눈을 마른 해부 접시나 작은 계량 보트로 옮긴 다음 가시축을 통해 90도 각도로 두 개의 천공을 만듭니다.30게이지 바늘이 달린 주사기를 사용하여 0.15-0.2ml의 소화 완충액을 각 눈의 유리체강에 주입합니다. 스프링 가위와 가는 집게로 눈을 다진 다음 무딘 기계적 파괴로 렌즈 조직을 분리하여 후속 단계에서 피펫 팁이 막히는 것을 방지합니다. 집게와 가위를 0.75ml의 소화 완충액으로 헹구고 각 샘플에 대한 접시를 교체합니다.P1000 피펫을 사용하여 접시의 내용물을 얼음 위의 해리 튜브로 옮기고 재료가 손실되지 않도록 주의합니다. 추가로 1.5ml의 소화 완충액으로 접시를 헹구고 해리 튜브에 추가하면 총 부피가 3.25에서 3.5ml 사이가 됩니다. 텍스트 원고에 설명된 대로 전자 해리기에서 조직을 해리하고, 모든 조직이 역 해리 튜브의 바닥에 있고 분해 완충액과 접촉하는지 확인합니다.그런 다음 해리관을 섭씨 37도 및 200RPM에서 30분 동안 배양합니다. 조직 해리를 두 번 더 반복하여 해리 사이에 30분 동안 섭씨 37도 및 200RPM에서 샘플을 배양합니다. 반응을 중지하려면 10ml의 저온 흐름 버퍼를 추가하고 샘플 튜브를 얼음 위에 놓습니다.단일 세포 현탁액을 생성하려면 50ml 원추형 원심분리기 튜브 상단에 배치된 40마이크로미터 필터를 통해 중단된 눈 소화 반응을 걸러냅니다. 2.5ml 주사기의 플런저를 사용하여 소화되지 않은 안구 조직의 남은 조각을 필터를 통해 밀어 넣습니다. 10ml의 유량 버퍼로 해리 튜브를 세척하고 필터를 헹굽니다.그런 다음 동일한 플런저를 사용하여 소화되지 않은 눈 조직 조각을 다시 필터에 통과시킵니다. 5ml의 플로우 버퍼로 이 과정을 반복합니다. 그런 다음 해리 튜브와 필터를 최종 10ml의 유량 버퍼로 세척합니다.원뿔형 튜브를 400배 G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 디캔팅합니다. 튜브를 다른 튜브에 대고 튕겨 펠릿을 부수십시오. 그런 다음 용해 용액 1ml를 넣고 실온에서 30초 동안 튜브를 휘젓고 적혈구를 용해합니다.20ml의 흐름 완충액과 원추형 튜브의 원심분리기로 400배 G에서 섭씨 4도에서 10분 동안 반응을 중지합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 디캔팅합니다. 튜브를 다른 튜브에 대고 튕깁니다.그런 다음 차가운 HBSS 5ml를 넣으십시오. 원심분리를 반복하고 상층액을 제거합니다. P1000 피펫을 사용하여 각 샘플에 0.5ml의 살아있는 사체 염색을 추가하고 펠릿을 완전히 해리합니다.샘플을 1.2ml 마이크로타이터 튜브로 옮기고 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다. 한편, 트리판 블루(trypan blue)와 혈구계(hemocyometer)로 샘플의 10마이크로리터 분취액을 계산합니다. 배양 후 400마이크로리터의 저온 흐름 완충액을 추가하여 각 샘플을 세척합니다.마이크로타이터 튜브 랙의 튜브를 섭씨 4도에서 10분 동안 400배 G로 원심분리하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 흡인합니다. 500마이크로리터의 저온 흐름 버퍼에 세포를 완전히 재현탁합니다. 그런 다음 원심분리를 반복하고 상층액을 제거합니다.50마이크로리터의 FC 블록에서 최대 500만 개의 살아있는 세포를 차단합니다. 세포 펠릿을 완전히 해리하고 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 샘플에 50마이크로리터의 항체 염색 용액을 추가합니다.완전히 섞어 섭씨 4도에서 30분 더 배양합니다. 단일 마우스의 두 눈에서 분석된 모든 이벤트에 대한 전방 산란 영역 대 측면 산란 영역 속성이 여기에 표시됩니다. APC-Cy7에 PE를 플로팅하여 비드 수를 세척하고 확인하여 PE 양성 및 APC-Cy7 음성 이벤트의 밀집된 클러스터를 생성했습니다.다음으로, 모든 이벤트에서 살아있는 세포의 싱글릿을 식별했습니다. Singlet은 전방 산란 면적 대비 전방 산란 면적에서 양의 상관관계를 보인 반면, Doublet 및 Triplet cell은 전방 산란 높이보다 전방 산란 면적이 더 컸습니다. 살아있는 세포는 전방 산란 영역 양성이고 살아있는 사체 염색은 음성입니다.살아있는 singlet cell에서 mononuclear phagocyte를 묘사하기 위한 초기 게이팅 전략이 여기에 나와 있습니다. CD45 대 CD11b 플롯을 사용하여 라이브 싱글렛을 시각화했습니다. CD45 FMO에 CD45 양성 세포가 없다는 것은 게이트 선택을 확인했다.다음으로, 호중구, 호산구, B 세포, K 세포 및 T 세포는 CD11b에 대한 계통 게이트가 있는 CD45 양성 라이브 싱글렛을 플롯하여 제외했습니다. CD45-dim 세포는 CD45-high 세포와 구별되었습니다. 대식세포 하위 집합(macrophage subset)도 확인되었습니다.미세아교세포는 CD64 양성 MHC2 낮은 염색을 가진 CD45-dim 세포에서 규명되었습니다. MHC2 음성 대식세포는 CD64 양성 MHC2 음성으로 확인되었습니다. CD11c 음성 및 CD11c 양성 대식세포는 CD64 양성 CD11c 음성으로 입증되었습니다.및 MHC2 양성 세포에서 CD64 양성 CD11c 양성. 레이저 치료는 MHC2 음성, CD11c 음성 및 CD11c 양성 대식세포의 양을 증가시키는 것으로 밝혀졌습니다. 수지상 세포 수는 또한 레이저 치료에 의해 상향 조절되었으며 미세아교세포와 단핵구 수는 영향을 받지 않았습니다.전신 관류는 대식세포 수에 영향을 미치지 않았습니다. 이 절차에 따라 분석만 수행하는 대신 florescence activated cell sorting을 통해 대식세포 이질성과 이것이 기능에 미치는 영향을 전사체 또는 단백질체 연구를 통해 특성화할 수 있습니다.

digestion-whole-mouse-eyes-for-multi-parameter-flow-cytometric

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 생쥐의 눈에서 유리체강내 전달 후 형광 생체 입자의 미세아교세포 흡수를 측정하기 위한 유세포 분석을 보여줍니다. 유세포분석법은 CD11b를 발현하는 살아있는 세포를 검출하고 녹색 형광을 보이는 식세포 미세아교세포를 Ly6C 발현 단핵구 및 Ly6G 발현 호중구를 포함한 다른 골수성 세포와 구별합니다.

유세포 분석을 사용한 유리체 내 전달 형광 입자의 미세아교세포 흡수 측정

미세 아교 세포는 세포 외 환경에서 소재를 탐식거나 삼키는 고용량으로 중추 신경계 (CNS)의 상주 면역 세포이다. 여기 시냅스 구성 요소의 미세 아교 세포 - 매개 말림을 시각화 및 측정 광범위하게 적용, 신뢰성, 높은 정량 분석​​은 설명한다.

말림 분석 : CNS 식세포와 신경 세포 사이의 상호 작용을 평가하기위한 프로토콜

조직의 항상성 및 부적절한 식세포 기능의 유지 보수 병리에 연루되었습니다에 대한 소교 식균 작용은 매우 중요하다. 그러나, 생체 내에서 미세 아교 세포의 기능을 평가하는 것은 기술적으로 어려운 것이다. 우리는 정확하게 모니터링 및 생리 학적 환경에서 미세 아교 세포의 식세포 가능성을 정량화하기위한 간단하지만 강력한 기술을 개발했다.

망막 미세 아교 식세포의 기능을 평가<em&gt; 생체</em&gt;은 유동 세포 계측법 기반 분석을 사용하여

안구 혈액 순환에서 표지 된 혈액 세포의 라이브 셀 이미징은 당뇨 망막 병증 및 연령 관련 황반변 성의 염증 및 허혈에 대한 정보를 제공 할 수있다. 망막 순환에서 혈액 세포를 표지하고 표지 된 세포를 영상화하는 프로토콜이 기술되어있다.

마우스 망막 순환에서 유동 역학을 연구하기위한 적혈구 및 백혈구의 형광 염료 표지

이 프로토콜은 유행 세포 계측법에 의한 성체 마우스 중추 신경계에서 대 식세포 모집단의 분석을 제공하며, 이들 세포에 의해 표현되는 다중 마커의 연구에 도움이됩니다.

유동 세포 계측법에 의한 중추 신경계에서 유래 된 대장 세포 및 단구 세포 유래 대 식세포의 분석

수백만 명의 사람들이 망막 퇴행성 질환으로 고통 받아 돌이킬 수없는 실명을 경험합니다. 이 질병의 많은 공통점은 망막 신경절 세포 (RGCs)의 소실이다. 이 상세한 프로토콜은 유동 세포 계측법을 이용한 양성 및 음성 선택에 의한 1 차 쥐 RGC의 분리를 기술합니다.

유동 세포 계측법에 의한 일차 망막 신경절 세포 (RGCs)의 분리

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

마우스 대 식 세포에 의해 식 균 작용의 시간 경과 3D 영상

이 프로토콜의 목표 설명된 마커를 사용 하 여 간 내 림프 내 피 세포 인구를 식별 하는 것입니다. 우리는 콜라 IV 및 DNase 및 조직, 림프 내 피 세포의 명료한 인구를 식별 하기 위해 cytometry와 결합의 부드러운 닦지를 이용 한다.

림프 내 피 세포의 흐름 Cytometric 분석 Murine 간 소화

원래 2016년1년페르난데스-고디노(Fernandez-Godino) 등에서 보고한 이 프로토콜은 트랜스웰 플레이트에서 1주일 이내에 기능적이고 편광된 RPE 단층층을 형성하는 마우스 RPE 세포를 효율적으로 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다. 절차는 약 3 시간이 걸립니다.

1차 마우스 망막 색소 상피 세포의 효율적인 해부 및 배양

망막 혈관 구조의 주위 세포는 형광 토마토 렉틴의 역궤도 주사 후 혈소판 유래 성장 인자 수용체 β로 면역 형광 염색으로 검사했습니다. 표지된 망막은 조직 제거 방법으로 추가로 처리되었으며 컨포칼 현미경으로 망막 혈관 구조를 둘러싼 주위 세포의 3차원 보기를 시각화하기 위해 전체적으로 장착되었습니다.

Immunostaining을 통한 마우스의 망막 혈관 주위 세포의 3D 시각화 

학습하세요 마우스 눈 전체를 소화하여 단일 핵 세포를 분리하고 다중 파라미터 흐름 세포측정으로 대식세포, 소세포교세포, 수지상세포를 정량 분석하는 방법을. 이 기술은 안과 질환에서 면역세포 역할을 연구하는 데 필수적입니다.

단일 핵 세포세포의 다중 파라미터 흐름 세포측정 분석을 위한 마우스 눈 전체의 소화

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