자궁 전자기화에서 양자 간을 사용하여 설치류 행동에 대한 유전적 영향을 심문하는 파이프라인

이 방법을 사용하면 특정 유전자 발현 변화가 신경 질환과 관련된 병리학에 어떻게 기인할 수 있는지 발견할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 생성 및 검증하는 데 수년이 걸릴 수 있는 유전적 동물 계통을 생성하거나 구매할 필요가 없다는 것입니다. 이 기술을 사용하면 신경 장애와 관련된 유전자를 연구 할 수 있습니다.

특정 유전자가 병리학에 어떻게 기여하는지 결정하는 것은 새로운 치료법을 개발하는 데 중요한 단계입니다. 이 프로토콜의 장점은 실험자가 생존율을 감소시키지 않고 유전자 전달 단계를 완료할 수 있도록 배아를 조작하는 방법을 배우는 것입니다. 배아는 매우 연약하기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요하므로 숙련된 실험자가 절차 중에 배아를 어떻게 조작하는지 관찰하는 것이 도움이 됩니다.

임신한 댐은 수술 최소 30분 전에 수술 부위로 데려오십시오. 멸균된 살균 물티슈를 사용하여 수술 부위 전체를 살균한 다음 70% 에탄올을 소독합니다. 그런 다음 유리 구슬 살균기에서 오토클레이브 도구를 살균합니다.

멸균 PBS를 50ml 원추형 튜브로 옮기고 튜브를 섭씨 38-40도로 가열된 수조에 넣습니다. 온도계로 멸균 식염수 온도를 확인하십시오. 물 가열 순환 펌프를 켜서 섭씨 37도까지 데우십시오.

그런 다음 압력 인젝터와 전기포레이터를 켜고 적절한 기능을 확인하십시오. 탁상용 원심분리기에서 혈장 DNA 용액을 잠시 돌리고 얼음 위에 놓습니다. 당겨진 유리 피펫의 끝이 직경이 약 50마이크로미터가 되도록 피펫 풀러에서 유리 피펫을 당깁니다.

그런 다음 피펫에 20-40 마이크로 리터의 DNA 용액을 채 웁니다. 제모 로션, 요오드, 70% 에탄올, 면봉, 점안액, 봉합사, 거즈 등 수술에 필요한 모든 물품을 준비합니다. 수술 시트를 준비하고 필요한 정보를 입력합니다.

수술 전에 마우스의 무게를 측정하고 무게를 기록하십시오. 마우스를 마취한 후 수술 전 진통제를 투여하고 제모 크림이나 면도기를 사용하여 복부의 털을 제거합니다. 복부에 포비돈 요오드와 70% 에탄올을 3회 면봉으로 닦아 소독합니다.

멸균 거즈와 드레이핑으로 복부 주위에 무균 필드를 만듭니다. 복부 피부의 정중선을 절개하고 근육이 절단되지 않도록 집게로 피부를 들어 올립니다. 그런 다음 근육을 들어 올려 절단하되 중요한 장기가 절단되지 않도록 주의한다.

고리 모양의 집게를 사용하여 댐에서 자궁 뿔을 조심스럽게 뽑아내고 패딩으로 지지되고 댐에서 너무 멀리 잡아당기지 않도록 하여 살균 필드에 부드럽게 놓습니다. 예열된 멸균 PBS로 수술이 진행되는 동안 자궁 뿔을 촉촉하게 유지하십시오. 집게 또는 손가락으로 배아를 배치한 다음 당겨진 유리 피펫을 측면 수직에 조심스럽게 삽입하고 피펫을 한쪽 심실에 삽입한 다음 다른 심실에 삽입하여 각 심실에 2-3마이크로리터를 주입합니다.

심실은 주사 후 초승달 모양이 존재하는 경우 성공적으로 표적화되었습니다. 전두엽 피질에서 세포를 양측으로 transfection하려면 배아의 머리 측면에 있는 두 개의 음극을 외측심실의 바로 옆쪽과 약간 꼬리쪽에 배치하고 발달 중인 바로 앞의 눈 사이에 양극을 배치합니다. 배아가 충분히 촉촉한지 확인하고 4개의 정사각형 펄스를 적용합니다.

모든 배아를 주입하고 전기천공하여 각 배아가 DNA 용액 주입 직후 전기천공되도록 합니다. 모든 배아가 전기천공이 완료되면 자궁 뿔을 복강에 조심스럽게 다시 삽입합니다. 자궁 뿔 배치를 돕기 위해 복강을 멸균 PBS로 코팅합니다.

봉합이 완료된 후 공기 주머니가 남지 않도록 복강을 멸균 PBS로 채웁니다. 흡수성 봉합사로 근육을 봉합하고 실크 비흡수성 봉합사로 피부를 봉합합니다. 댐이 적어도 1시간 동안 가열된 챔버에서 완전히 회복되도록 합니다.

앞으로 48시간 동안 정기적으로 댐을 점검하십시오. 댐이 마취에서 회복되고 의식을 되찾으면, 댐이 움직이고 휘젓기 시작할 것이다. 이 방법은 pCAG-GFP 플라스미드로 약 5, 000 층 2/3 피라미드 뉴런을 transfection하는 데 사용되었습니다.

이 세포의 대부분은 전두엽 피질 영역에 국한되어 있었습니다. 대표적인 예는 성체 대조군에서 형질주입된 뉴런의 상부 꼬리 분포를 보여주며, 이는 전두엽 피질에 있는 많은 피라미드 뉴런 집단을 표적으로 삼고 유전적으로 표지하는 양측 IUE의 능력을 확인합니다. 모계 상호 작용 과제의 첫 번째 부분은 대조군 P18 형질 주입된 마우스가 둥지 침구를 찾는 능력을 테스트합니다.

대조군 쥐는 새로운 침구를 탐색하는 것보다 둥지 침구를 탐색하는 데 더 많은 시간을 보냈는데, 이는 그들이 온전한 감각 운동 능력과 탐구 행동을 가지고 있음을 시사합니다. 과제의 두 번째 부분은 생쥐가 어미와 상호 작용하도록 동기를 부여하는 경향을 이용합니다. 이 작업에서 새끼는 대부분의 시간을 어미 근처에서 보내면서 빈 컵이나 둥지 침구를 탐색하는 데 훨씬 적은 시간을 보냅니다.

성체 대조군 쥐는 새로운 물체를 탐색하는 데 약 35%의 시간을 보냈습니다. 새로운 물건과 친숙한 물건이 주어졌을 때, 성인 쥐는 새로운 물건을 탐구하는 데 더 많은 시간을 보냈습니다. 사교성 과제에서, 대조군 성체 쥐는 새로운 쥐와 빈 컵을 탐색하는 데 비슷한 시간을 보냈습니다.

이 동작은 DeepLabCut 소프트웨어를 사용하여 팔다리, 중심, 머리 및 귀를 포함한 마우스의 다양한 지점에 레이블을 지정하여 자동으로 추적되었습니다. 이 소프트웨어는 또한 마우스가 몸을 기르면 이 거리가 짧아지기 때문에 마우스의 몸통 길이를 검사하여 마우스가 양육하는 시기를 결정하는 데 사용되었습니다. 이 절차에 따라 조직을 검사하고 척추 밀도 또는 다양한 단백질의 발현 수준과 같은 다양한 측정을 분석함으로써 많은 세포 분자 질문에 답할 수 있습니다.