Name: 자궁 전자기화에서 양자 간을 사용하여 설치류 행동에 대한 유전적 영향을 심문하는 파이프라인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-21T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: 배우세요 양측 자궁 내 전기천자법을 사용하여 쥐 배아에서 유전자 전달을 수행하는 방법을. 이 기술은 신경정신질환 관련 유전자 연구와 사회행동 분석에 활용됩니다.

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우리는 중요한 피드백과 원고에 편집 리사 크레츠지 감사합니다. 우리는 행동 두뇌의 관류 및 세포 계산을 돕는 데 귀중한 크루즈 - 마르틴 실험실의 모든 연구 조수에게 감사드립니다. 우리는 삼극성 전극의 디자인에 대한 입력 안드레제이 Cwetsch 감사, 그리고 토드 블루테와 보스턴 대학 생물학 이미징 코어는 공초점 현미경의 사용에 대한. 이 작품은 NARSAD 젊은 조사자 그랜트 (AC-M, #27202), 브렌튼 R. 루츠 상 (ALC), I. 알덴 맥치 상 (ALC), NSF NRT UtB : 신경 광장 국가 연구 펠로우십 (ALC, #DGE1633516), 보스턴 대학 학부 연구 기회 프로그램 (WWY)에 의해 지원되었다. 기금은 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 출판 결정 또는 원고 준비에 아무런 역할이 없었습니다.

<ol><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+association+and+meta-analysis+of+a+schizophrenia+GWAS+variant+rs10489202+in+East+Asian+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Genetic association and meta-analysis of a schizophrenia GWAS variant rs10489202 in East Asian populations.</a> Translational Psychiatry. 8 (1), 144(2018).</li>
<li>Schizophrenia Working Group of the Psychiatric Genomics Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+insights+from+108+schizophrenia-associated+genetic+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biological insights from 108 schizophrenia-associated genetic loci.</a> Nature. 511 (7510), 421-427 (2014).</li>
<li>Howard, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+meta-analysis+of+depression+identifies+102+independent+variants+and+highlights+the+importance+of+the+prefrontal+brain+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Genome-wide meta-analysis of depression identifies 102 independent variants and highlights the importance of the prefrontal brain regions.</a> Nature Neuroscience. 22 (3), 343-352 (2019).</li>
<li>Grove, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+common+genetic+risk+variants+for+autism+spectrum+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder.</a> Nature Genetics. 51 (3), 431-444 (2019).</li>
<li>Comer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+schizophrenia-associated+gene+C4+leads+to+hypoconnectivity+of+prefrontal+cortex+and+reduced+social+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Increased expression of schizophrenia-associated gene C4 leads to hypoconnectivity of prefrontal cortex and reduced social interaction.</a> PLoS Biology. 18 (1), 3000604(2020).</li>
<li>Chini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+and+Rescuing+Developmental+Miswiring+in+a+Mouse+Model+of+Cognitive+Impairment%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Resolving and Rescuing Developmental Miswiring in a Mouse Model of Cognitive Impairment.</a> Neuron. 105 (1), 60-74 (2020).</li>
<li>Clifton, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+expression+of+genes+associated+with+schizophrenia+and+bipolar+disorder+across+development%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Dynamic expression of genes associated with schizophrenia and bipolar disorder across development.</a> Translational Psychiatry. 9 (1), 74(2019).</li>
<li>Oberlander, V. C., Xu, X., Chini, M., Hanganu-Opatz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+dysfunction+of+prefrontal-hippocampal+networks+in+mouse+models+of+mental+illness%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Developmental dysfunction of prefrontal-hippocampal networks in mouse models of mental illness.</a> European Journal of Neurosciences. 50 (6), 3072-3084 (2019).</li>
<li>Batista-Brito, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Dysfunction+of+VIP+Interneurons+Impairs+Cortical+Circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Developmental Dysfunction of VIP Interneurons Impairs Cortical Circuits.</a> Neuron. 95 (4), 884-895 (2017).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Dissection+of+Neural+Circuits%3A+A+Decade+of+Progress%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic Dissection of Neural Circuits: A Decade of Progress.</a> Neuron. 98 (2), 256-281 (2018).</li>
<li>DeNardo, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+strategies+to+access+activated+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Genetic strategies to access activated neurons.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 121-129 (2017).</li>
<li>Huang, Z. J., Zeng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+neural+circuits+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to neural circuits in the mouse.</a> Annual Reviews in Neurosciences. 36, 183-215 (2013).</li>
<li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Molecular Therapy. 18 (1), 80-86 (2010).</li>
<li>Callaway, E. M., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+Circuit+Tracing+with+Glycoprotein-Deleted+Rabies+Viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic Circuit Tracing with Glycoprotein-Deleted Rabies Viruses.</a> Journal of Neurosciences. 35 (24), 8979-8985 (2015).</li>
<li>Cruz-Martín, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dedicated+circuit+links+direction-selective+retinal+ganglion+cells+to+the+primary+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A dedicated circuit links direction-selective retinal ganglion cells to the primary visual cortex.</a> Nature. 507 (7492), 358-361 (2014).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+stabilization+of+dendritic+spines+in+fragile+X+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice.</a> Journal of Neurosciences. 30 (23), 7793-7803 (2010).</li>
<li>Zhang, J. H., Adikaram, P., Pandey, M., Genis, A., Simonds, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+genome+editing+through+CRISPR-Cas9+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineered%22%5BJournal%5D)">Optimization of genome editing through CRISPR-Cas9 engineering.</a> Bioengineered. 7 (3), 166-174 (2016).</li>
<li>Strecker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+DNA+insertion+with+CRISPR-associated+transposases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associated transposases.</a> Science. 365 (6448), 48-53 (2019).</li>
<li>Cruz-Martín, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+induces+the+elongation+of+early+dendritic+protrusions+via+mGluRs+in+wild+type+mice%2C+but+not+in+fragile+X+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Glutamate induces the elongation of early dendritic protrusions via mGluRs in wild type mice, but not in fragile X mice.</a> PLoS One. 7 (2), 32446(2012).</li>
<li>LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+and+improved+tools+for+in+utero+electroporation+studies+of+developing+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex.</a> Cerebral Cortex. 19, Suppl 1 120-125 (2009).</li>
<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> Frontiers in Molecular Neurosciences. 4, 37(2011).</li>
<li>Szczurkowska, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+in+vivo+genetic+manipulation+of+the+mouse+or+rat+brain+by+in+utero+electroporation+with+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Targeted in vivo genetic manipulation of the mouse or rat brain by in utero electroporation with a triple-electrode probe.</a> Nature Protocols. 11 (3), 399-412 (2016).</li>
<li>dal Maschio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+and+site-directed+in+utero+electroporation+by+a+triple-electrode+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-performance and site-directed in utero electroporation by a triple-electrode probe.</a> Nature Communications. 3, 960(2012).</li>
<li>Zhan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficient+neuron-microglia+signaling+results+in+impaired+functional+brain+connectivity+and+social+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Deficient neuron-microglia signaling results in impaired functional brain connectivity and social behavior.</a> Nature Neurosciences. 17 (3), 400-406 (2014).</li>
<li>Mathis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DeepLabCut%3A+markerless+pose+estimation+of+user-defined+body+parts+with+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning.</a> Nature Neurosciences. 21 (9), 1281-1289 (2018).</li>
<li>Bullmann, T., Arendt, T., Frey, U., Hanashima, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transportable%2C+inexpensive+electroporator+for+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">A transportable, inexpensive electroporator for in utero electroporation.</a> Development Growth and Differentiation. 57 (5), 369-377 (2015).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+analysis+identifies+30+new+susceptibility+loci+for+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association analysis identifies 30 new susceptibility loci for schizophrenia.</a> Nature Genetics. 49 (11), 1576-1583 (2017).</li>
<li>Ripke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+association+analysis+identifies+13+new+risk+loci+for+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide association analysis identifies 13 new risk loci for schizophrenia.</a> Nature Genetics. 45 (10), 1150-1159 (2013).</li>
<li>De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-selective+electroporation+of+cortical+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiment%22%5BJournal%5D)">Subtype-selective electroporation of cortical interneurons.</a> Journal of Visualized Experiment. (90), e51518(2014).</li>
<li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 151-158 (2005).</li>
<li>Soma, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+mouse+amygdala+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Development of the mouse amygdala as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> Journal of Comparative Neurology. 513 (1), 113-128 (2009).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

본명, 파이프라인은 전두엽 피질 뉴런의 큰 집단에 대한 관심의 새로운 유전자의 조작을 마우스의 행동 분석과 결합하는 것으로 기술된다. 더욱이, 이 파이프라인은 초기 산후 발달 과 성인기에 둘 다 동일 마우스에 있는 행동의 종방향 연구 결과를 허용합니다. 이 기술은 시간과 비용의 관점에서 비용이 많이 들 수 있는 유전 동물 모델에 의지할 필요성을 우회합니다. 이 프로토콜의 강도는 최근 GWAS가 새로운 유전 협회28,29를발견한 신경 발달 및 신경 정신 장애를 연구하는 데 사용될 수 있다는 것입니다. 이 방법은 흥분성 뉴런의 세포 형 특정 전환을 제공하지만, 한 가지 제한은 인터뉴런 또는 신경교 세포와 같은 다른 뇌 세포 유형을 대상으로 하는 것이 덜 가능하다는 것입니다. 그러나, 여러 연구는 다른 뇌 세포 유형을 대상으로 수정 된 접근 방식을 제안30,<sup c...

게놈 전체 협회 연구(GWAS)는 뇌 병리1,2,3,4와관련된 새로운 후보 유전자의발견을주도했다. 이러한 연구는 정신 분열증 (SCZ)과 같은 치명적인 신경 정신 장애를 이해하는 데 특히 도움이되었으며, 새로운 유전자의 조사는 새로운 연구 및 치료 개입 라인의 시작 점으로 사용되었습니다5,6. SCZ에 대한 위험을 품고 있는 유전자는 산전 및 조기 산후 발달 중 전두엽 피질(PFC)에서 편향된 발현을 나타내며, 이는 여러 신경정신장애의 병리학에 연루된영역(7)이다. 또한, 정신 장애의 마우스 모델은 PFC 네트워크6,8,9에서비정상적인활성을나타낸다. 이 결과는 SZC 관련 유전자가 이 지역의 발달 배선에 있는 역할을 할 지도 모른다는 것을 건의합니다. 동물 모델을 이용한 추가 조사는 PFC에 있는 연결의 설치에 이 후보 유전자의 기여를 이해하고 이 유전자가 신경 정신병 장애의 병인에 있는 원인 역할이 있는지 결정하기 위하여 요구됩니다. 산전 및 조기 산후 발달 중 특정 뉴런 회로에 대한 유전자 발현 변화를 연구할 수 있는 마우스의 유전자 조작 기술은 유전자 발현 변화를 PFC 기능 장애에 연결하는 분자 메커니즘을 이해하는 유망한 방법이다.
유전 마우스 라인은 뇌 발달과 기능에 특정 유전자의 영향을 연구하는 방법을 제공합니다. 그러나, 형질 전환 쥐에 의존하는 것은 신경 회로 개발에 특정 유전자의 효력을 검토하기 위하여 항상 상업적으로 이용 가능한 라인이 없기 때문에 제한될 수 있습니다. 또한 사용자 지정 마우스 라인을 개발하는 데 매우 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요될 수 있습니다. 형질전환 마우스와 바이러스 접근법을 결합한 교차 유전자 조작 전략의 사용은 뇌10,11,12의 이해에 혁명을일으켰습니다. 많은 진보에도 불구하고, 바이러스 전략은 바이러스발현(13)과 바이러스 발현(14)과 관련된 세포 독성을제한할 수 있는 포장 용량의 한계를 포함하여 바이러스 벡터 유형에 따라 일정한 한계를 가지고 있다. 더욱이, 대부분의 실험 조건에서, 아데노 관련 바이러스를 이용한 강력한 유전자 발현(AAV)은 약 2~4주15일이필요하며, 조기 산후 발달 시 유전자를 조작할 수 없는 일상적인 바이러스 전략을 만드는 것이다.
자궁 전기기화(IUE)에서 신속하고 저렴한 유전자 전달을 허용하는 대체 접근법은형광 라벨링 및 약리유전학 적 또는 광유전학적 접근법과 결합될 때, 뉴런 회로의 기능을 해부하는 강력한 플랫폼을 제공한다. 또한, CRISPR-Cas9 게놈 편집 유전자의 발달과 함께 특정 유전자의 세포형 특이적 노크다운 또는 노크아웃을 통해 또는프로모터(18,19)의변조를 통해 과발성 또는 정확하게 변경될 수 있다. IUE를 이용한 유전자 조작 접근법은 유전자가 좁은 발달창(20)동안 시험될 필요가 있을 때 특히 유리하다. IUE는 다목적 기술이며 특정 프로모터 하에서 발현 벡터에 유전자를 삽입하여 쉽게 수행될 수 있다. 유전자 발현의 추가 제어는 상이한 강점의 프로모터를 이용하여 발현을 구동하거나 유전자발현(21,22)을일시적으로 조절할 수 있는 유도성 프로모터를 사용하여 달성될 수 있다. 추가적으로, IUE는 특정 피질 층, 세포 모형 및 두뇌 지구 내의 세포의 표적을 허용합니다, 다른 접근을 사용하여 항상 가능하지 는 않습니다5,17. 보다 효율적인 전극 분포를 생성하는 3개의 전극의 사용에 기초한 IUE 구성의 최근 발전은 이 방법의 기능적 레퍼토리를 확대하고 과학자들이 새로운 세포 유형을 표적으로 하고23,24를표적으로 할 수 있는 세포의 효율, 정확성 및 수를 증가시킬 수 있게 하였다. 이 기술은 최근 PFC 기능 및 초기 인식5에서SCZ에 연결된 유전자인 보완 성분 4A(C4A)의 원인 역할을 결정하는 데 사용되었다. 
여기에 제시된 유전자 전송 접근은 PFC를 포함하여 전두엽 피질에 있는 흥분성 뉴런의 큰 인구를 표적으로 하는 유전자 전송 접근을 결합하는 실험 적인 파이프라인입니다, 세포 및 회로 수준 변경의 연구 결과를 가능하게 하는 행동 패러다임, 그러나 또한 초기 산후 발달 및 성인기에 걸쳐 행동을 감시할 수 있습니다. 먼저 설명된 방법은 정면 피질 영역에서 층(L) 2/3 피라미드 뉴런의 큰 집단을 양자간 횡단하는 방법이다. 다음으로, 청소년과 성인 마우스의 사회적 행동을 분석하는 작업이 설명되어 있습니다. 세포 수는 세포 형질의 범위와 위치를 정량화하기 위해 행동 작업이 완료되면 얻을 수 있습니다. 더욱이, 전형된 세포의 수는 행동 데이터와 상관관계가 있을 수 있고, 더 많은 수의 전과세포가 행동에 더 큰 혼란을 초래하는지 확인할 수 있다.

<table><tbody><tr><td>13mm 실크 블랙 브레이드 봉합</td>사 <td>Havel's</td><td>SB77D</td><td>봉합사 스킨</td></tr><tr><td>애드슨 집게</td><td>F.S.T.</td><td>11006-12</td><td>IUE</td></tr><tr><td>C270 웹캠</td><td>Logitech</td><td>N/A</td><td>기록 동작</td></tr><tr><td>Electroporator</td><td>맞춤형</td><td>N/A</td><td>그림 1 및 2 참조 및 Bullmann et al, 2015</td></tr><tr><td>EZ-500 스핀 컬럼 플라스미드 DNA Maxi-preps Kit, 20preps</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>BS466</td><td>Pladmid 준비</td></tr><tr><td>빠른 녹색 FCF</td><td>시그마</td><td>F7252-5G</td><td>염료 DNA 용액</td></tr><tr><td>미세 가위 - 날카로운</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td>IUE</td></tr><tr><td>Fisherbrand 거즈 스폰지</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>1376152</td><td>IUE</td></tr><tr><td>Gaymar 난방 / 냉각</td><td>Braintree</td><td>TP-700</td><td>가열 패드</td></tr><tr><td>유리 피펫 풀러</td><td>셔터 기기,</td> <td>P-97</td><td>IUE</td></tr><tr><td>유리 피펫</td><td>셔터 기기,</td> <td>BF150-117-10</td><td>IUE</td></tr><tr><td>제모 로션</td><td>Nair</td><td>N / A</td><td>제모</td></tr><tr><td>Hartman 지혈</td><td>F.S.T.</td><td>13002-10</td><td>IUE</td></tr><tr><td>오픈 필드 미로 - 수제 아크릴 경기장</td><td>맞춤형</td><td>내장 N / A</td><td>50 &times; 50 &times; 50 &times; 30 cm 길이 - 너비 - 높이</td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td> GFP Picospritzer <td>III의 발현을위한 포유류 발현 벡터</td></tr><tr><td></td><td>Parker Hannifin</td><td>N / A</td><td>압력 인젝터</td></tr><tr><td>견인기 - 2 갈래 무딘</td><td>F.S.T.</td><td>17023-13</td><td>IUE</td></tr><tr><td>링 집게</td><td>F.S.T.</td><td>11103-09</td><td>IUE</td></tr><tr><td>살균기, 드라이 비드</td><td>시그마</td><td>Z378569</td><td>sterelize 수술 도구</td></tr><tr><td>봉합사, 3/0 PGA, FS-2, 수의사 전용 바이올렛</td><td>Havel's</td><td>HJ398</td><td>봉합사 근육</td></tr><tr><td>수조</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-12105-84</td><td>온난화 멸균 식염수</td></tr></tbody></table>

자궁 전자기화에서 양자 간을 사용하여 설치류 행동에 대한 유전적 영향을 심문하는 파이프라인

A Pipeline using Bilateral In Utero Electroporation to Interrogate Genetic Influences on Rodent Behavior

게놈 전체 협회 연구가 많은 신경 질환의 이기종 유전 기초에 빛을 발산으로, 뇌 개발 및 기능에 특정 유전자의 기여를 연구 할 필요가 증가. 생생 마우스 라인이 매우 비용이 많이 들고 많은 새로운 질병 관련 유전자가 아직 상업적으로 이용 가능한 유전 라인을 가지고 있지 않기 때문에 특정 유전 조작의 역할을 연구하기 위하여 마우스 모형에 의지하는 것은 항상 가능하지 않습니다. 또한 마우스 선을 만드는 데 수년간의 개발 및 유효성 검사가 걸릴 수 있습니다. 자궁에서 전기 기공은 특정 유전 적 조작을 달성하기 위해 DNA 플라스미드를 개발해야만 하는 생체 내에서 세포 형 특정 방식으로 유전자 발현을 조작하는 비교적 빠르고 쉬운 방법을 제공한다. 자궁 전기화의 양자는 전두엽 피질 피라미드 뉴런의 큰 인구를 표적으로 하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 유전자 전달 방법과 행동 접근법을 결합하면 전두엽 피질 네트워크의 기능과 청소년 및 성인 마우스의 사회적 행동에 대한 유전 조작의 효과를 연구 할 수 있습니다.

맞춤형 전기포레이터와 3개의 갈래 전극의 성공적인 개발 및 구현. IUEs의 경우, 이전에 설명된설계(27)를 기반으로 저렴한 맞춤형 내장 전기포레이터를 제작하였다(도1A 및 도 2). 3개의 갈래 전극이23,24개의 플라스틱 집게를 사용하여 갈래의 끝에 부착된 2개의 음극을 사용했고, 양극은 칫솔 손잡이(도1B)의끝에 부착되었다. 전기포레이터와 3개의 갈래 전극은 적절한 기능을 보장하기 위해 테스트되었습니다. IUE는 자궁 뿔을 노출하고 플라스미드 DNA를 주입하고 각 배아(도1C)를전기화하여 수행하였다. 3개의 갈래 전극은 배아의 머...

신경 정신 장애의 병인에 있는 최근에 발견된 질병 관련 유전자의 역할은 모호하게 남아 있습니다. 자궁 전기 기화 기법에서 수정된 양자간은 뉴런의 큰 인구에서 유전자 전송을 허용하고 사회적 행동에 대한 유전자 발현 변화의 원인 효과의 검사를 허용한다.

As genome-wide association studies shed light on the heterogeneous genetic underpinnings of many neurological diseases, the need to study the contribution ...

이 방법을 사용하면 특정 유전자 발현 변화가 신경 질환과 관련된 병리학에 어떻게 기인할 수 있는지 발견할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 생성 및 검증하는 데 수년이 걸릴 수 있는 유전적 동물 계통을 생성하거나 구매할 필요가 없다는 것입니다. 이 기술을 사용하면 신경 장애와 관련된 유전자를 연구 할 수 있습니다.특정 유전자가 병리학에 어떻게 기여하는지 결정하는 것은 새로운 치료법을 개발하는 데 중요한 단계입니다. 이 프로토콜의 장점은 실험자가 생존율을 감소시키지 않고 유전자 전달 단계를 완료할 수 있도록 배아를 조작하는 방법을 배우는 것입니다. 배아는 매우 연약하기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요하므로 숙련된 실험자가 절차 중에 배아를 어떻게 조작하는지 관찰하는 것이 도움이 됩니다.임신한 댐은 수술 최소 30분 전에 수술 부위로 데려오십시오. 멸균된 살균 물티슈를 사용하여 수술 부위 전체를 살균한 다음 70% 에탄올을 소독합니다. 그런 다음 유리 구슬 살균기에서 오토클레이브 도구를 살균합니다.멸균 PBS를 50ml 원추형 튜브로 옮기고 튜브를 섭씨 38-40도로 가열된 수조에 넣습니다. 온도계로 멸균 식염수 온도를 확인하십시오. 물 가열 순환 펌프를 켜서 섭씨 37도까지 데우십시오.그런 다음 압력 인젝터와 전기포레이터를 켜고 적절한 기능을 확인하십시오. 탁상용 원심분리기에서 혈장 DNA 용액을 잠시 돌리고 얼음 위에 놓습니다. 당겨진 유리 피펫의 끝이 직경이 약 50마이크로미터가 되도록 피펫 풀러에서 유리 피펫을 당깁니다.그런 다음 피펫에 20-40 마이크로 리터의 DNA 용액을 채 웁니다. 제모 로션, 요오드, 70% 에탄올, 면봉, 점안액, 봉합사, 거즈 등 수술에 필요한 모든 물품을 준비합니다. 수술 시트를 준비하고 필요한 정보를 입력합니다.수술 전에 마우스의 무게를 측정하고 무게를 기록하십시오. 마우스를 마취한 후 수술 전 진통제를 투여하고 제모 크림이나 면도기를 사용하여 복부의 털을 제거합니다. 복부에 포비돈 요오드와 70% 에탄올을 3회 면봉으로 닦아 소독합니다.멸균 거즈와 드레이핑으로 복부 주위에 무균 필드를 만듭니다. 복부 피부의 정중선을 절개하고 근육이 절단되지 않도록 집게로 피부를 들어 올립니다. 그런 다음 근육을 들어 올려 절단하되 중요한 장기가 절단되지 않도록 주의한다.고리 모양의 집게를 사용하여 댐에서 자궁 뿔을 조심스럽게 뽑아내고 패딩으로 지지되고 댐에서 너무 멀리 잡아당기지 않도록 하여 살균 필드에 부드럽게 놓습니다. 예열된 멸균 PBS로 수술이 진행되는 동안 자궁 뿔을 촉촉하게 유지하십시오. 집게 또는 손가락으로 배아를 배치한 다음 당겨진 유리 피펫을 측면 수직에 조심스럽게 삽입하고 피펫을 한쪽 심실에 삽입한 다음 다른 심실에 삽입하여 각 심실에 2-3마이크로리터를 주입합니다.심실은 주사 후 초승달 모양이 존재하는 경우 성공적으로 표적화되었습니다. 전두엽 피질에서 세포를 양측으로 transfection하려면 배아의 머리 측면에 있는 두 개의 음극을 외측심실의 바로 옆쪽과 약간 꼬리쪽에 배치하고 발달 중인 바로 앞의 눈 사이에 양극을 배치합니다. 배아가 충분히 촉촉한지 확인하고 4개의 정사각형 펄스를 적용합니다.모든 배아를 주입하고 전기천공하여 각 배아가 DNA 용액 주입 직후 전기천공되도록 합니다. 모든 배아가 전기천공이 완료되면 자궁 뿔을 복강에 조심스럽게 다시 삽입합니다. 자궁 뿔 배치를 돕기 위해 복강을 멸균 PBS로 코팅합니다.봉합이 완료된 후 공기 주머니가 남지 않도록 복강을 멸균 PBS로 채웁니다. 흡수성 봉합사로 근육을 봉합하고 실크 비흡수성 봉합사로 피부를 봉합합니다. 댐이 적어도 1시간 동안 가열된 챔버에서 완전히 회복되도록 합니다.앞으로 48시간 동안 정기적으로 댐을 점검하십시오. 댐이 마취에서 회복되고 의식을 되찾으면, 댐이 움직이고 휘젓기 시작할 것이다. 이 방법은 pCAG-GFP 플라스미드로 약 5, 000 층 2/3 피라미드 뉴런을 transfection하는 데 사용되었습니다.이 세포의 대부분은 전두엽 피질 영역에 국한되어 있었습니다. 대표적인 예는 성체 대조군에서 형질주입된 뉴런의 상부 꼬리 분포를 보여주며, 이는 전두엽 피질에 있는 많은 피라미드 뉴런 집단을 표적으로 삼고 유전적으로 표지하는 양측 IUE의 능력을 확인합니다. 모계 상호 작용 과제의 첫 번째 부분은 대조군 P18 형질 주입된 마우스가 둥지 침구를 찾는 능력을 테스트합니다.대조군 쥐는 새로운 침구를 탐색하는 것보다 둥지 침구를 탐색하는 데 더 많은 시간을 보냈는데, 이는 그들이 온전한 감각 운동 능력과 탐구 행동을 가지고 있음을 시사합니다. 과제의 두 번째 부분은 생쥐가 어미와 상호 작용하도록 동기를 부여하는 경향을 이용합니다. 이 작업에서 새끼는 대부분의 시간을 어미 근처에서 보내면서 빈 컵이나 둥지 침구를 탐색하는 데 훨씬 적은 시간을 보냅니다.성체 대조군 쥐는 새로운 물체를 탐색하는 데 약 35%의 시간을 보냈습니다. 새로운 물건과 친숙한 물건이 주어졌을 때, 성인 쥐는 새로운 물건을 탐구하는 데 더 많은 시간을 보냈습니다. 사교성 과제에서, 대조군 성체 쥐는 새로운 쥐와 빈 컵을 탐색하는 데 비슷한 시간을 보냈습니다.이 동작은 DeepLabCut 소프트웨어를 사용하여 팔다리, 중심, 머리 및 귀를 포함한 마우스의 다양한 지점에 레이블을 지정하여 자동으로 추적되었습니다. 이 소프트웨어는 또한 마우스가 몸을 기르면 이 거리가 짧아지기 때문에 마우스의 몸통 길이를 검사하여 마우스가 양육하는 시기를 결정하는 데 사용되었습니다. 이 절차에 따라 조직을 검사하고 척추 밀도 또는 다양한 단백질의 발현 수준과 같은 다양한 측정을 분석함으로써 많은 세포 분자 질문에 답할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

E16 랫 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

E15 마우스 태아의 Utero의 심실 주입 및 Electroporation에

여기에서 망막 신경절 murine 세포 (RGCs)의 유전자 발현을 조작 두 가지 기법을...

마우스 망막 신경절 세포의 유전자 발현에 대한 utero 및 전직 생체내의 Electroporation에

utero의 electroporation에서 생체내에의 연결 전구 세포를 transfecting위한 가치있는 방법입니다. 전극과 electroporation의 발달 timepoint의 위치에 따라, 피질 세포의 특정 하위 집합을 타겟팅할 수 있습니다. 타겟 세포는 다음 생체내 또는 유전 변경의 효과에 대한 체외에서 분석할 수 있습니다.

utero에서 Electroporation은 두피 뉴런의 하위 집합의 유전자 기능을 학습에 대한 기본의 연결을 문화 뒤에

utero의 electroporation에서 개발 중추 신경계 (CNS)에서 공간과 temporally 제어 방식으로 신속한 유전자 전달 수 있습니다. 여기서 우리는 telencephalon, diencephalon 및 망막을 포함한 여러 배아 CNS의 도메인으로 표현 구조를 제공하는 데 사용할 수있는 utero의 electroporation 프로토콜에 매우 적응을 설명합니다.

사용하여 여러 개의 CNS 준주로 효율적인 유전자 전달 Utero에서 Electroporation

유전자는 성인 동물의 행동이나 신경 병리학의 최신 연구에 신경 연결의 빠르고 목표 수정을 가능하게하기 위해, E16의 자궁 일렉트로 (IUE)의를 통해 피질 또는 쥐의 해마의 개발 과정에서 조작 할 수 있습니다. IUE 성공의 제어를위한 생체 영상의 출생은 공동 형질 루시 페라 제를 활성화 생물 발광에 의해 수행된다.

몸에 붙이기 형질 전환 쥐의 발생에 의해<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로 및<em&gt; 생체 내</em&gt; 생물 발광 상영

시상 하부의 기능 및 의료 중요성에도...

마우스의 유전자 조작을 통해 시상 하부 개발<em&gt; 자궁 내</em&gt; 일렉트로

이 프로토콜은 자궁 내 전기천공법을 통해 C57BL/6 중추신경계의 다른 영역을 구체적으로 transfection하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜에는 피질, 해마, 시상, 시상하부, 외측 중격 핵 및 선조체로 발달하는 영역의 형질주입에 대한 자세한 지침이 포함되어 있습니다.

코어 텍스, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, 횡 중격 Nucleus-과 줄무늬 별<em&gt; 자궁 내</em&gt; C57BL / 6 마​​우스에서 Electroporation에

뇌 결 heterotopia (PNH) 성인에서 대뇌 피 질의 개발 (MCD)의 기형의 가장 일반적인 형태는 그러나 그것의 유전으로 가장 산발적 인 경우 알 수 없는 남아 있다. 우리는 최근 MCDs에 대 한 비 발한 후보자 유전자를 식별 하 고 직접 그들의 원인이 역할 비보를 확인 하는 전략을 개발 했습니다.

배열 CGH, 전체 exome 시퀀싱과 설치류에 Utero에서 Electroporation 뇌 기형에 대 한 원인 유전자를 식별 하는 새로운 전략

자궁 전기기화의 이중은 공간적으로 그리고 일시적으로 분리되는 세포 집단을 표적으로 할 수 있습니다. 이 기술은 정상 조건에서 형광 단백질을 사용하여 그 세포 인구 사이 상호 작용을 구상하는 데 유용하지만 기능적 실험 후 관심의 유전자를 어지니로 조정합니다.

자궁에서 두 배의 자궁 전기화는 시간적으로 그리고 공간적으로 분리된 세포 인구를 표적으로 합니다

배우세요 양측 자궁 내 전기천자법을 사용하여 쥐 배아에서 유전자 전달을 수행하는 방법을. 이 기술은 신경정신질환 관련 유전자 연구와 사회행동 분석에 활용됩니다.

자궁 전자기화에서 양자 간을 사용하여 설치류 행동에 대한 유전적 영향을 심문하는 파이프라인

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