2020년 6월 24일
이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중의 뮤린 모델인 일시적 중간 대뇌동맥 폐색 후 폐 환경에서 면역 세포 조성, 사이토카인 프로파일, 및 케모카인 프로파일의 변화를 확인하기 위한 유세포 분석기의 사용을 기술한다.
이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중 후 폐 환경의 변화를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 유세포 분석을 통해 동일한 마우스에서 13개의 폐 면역 세포 유형과 13개의 서로 다른 사이토카인 및 케모카인을 식별할 수 있습니다. 이 방법은 허혈성 뇌졸중 후 폐 환경의 변화를 평가하는 데 사용되었습니다.
그러나 알레르기 반응이나 감염 중 변화를 조사하는 역할도 할 수 있습니다. 전신 심간 관류를 수행하려면 마취된 마우스에서 페달 반사에 대한 반응 부족을 확인하고 마우스를 수술 플랫폼에 고정합니다. 모피에 70% 에탄올을 적셔 체강으로의 털 분포를 줄이고 수직 정중선 피부 절개를 만들어 온전한 복막을 노출시켜 흉강에 도달하는 즉시 절개를 멈춥니다.
미세한 절개 가위를 사용하여 흉강에서 멈추는 복막의 정중선을 절개하고 집게를 사용하여 흉골의 원위 끝을 잡습니다. 가위를 사용하여 심장, 폐 또는 혈관 구조를 손상시키지 않고 횡격막을 절단합니다. 밑에 있는 조직이 보이면 흉곽을 절개하고 갈비뼈 측면을 고정하여 심장과 폐가 완전히 드러
나도록 합니다.관류를 위한 배출구 역할을 하도록 대동맥궁 근처의 우심방을 조심스럽게 작게 절개하고 좌심실의 원위 상면에 25게이지 바늘을 빠르고 부드럽게 삽입합니다. 바늘이 제자리에 고정되면 10ml의 차가운 PBS를 심장으로 부드럽게 씻어냅니다. 조직에서 피가 제거되기 시작해야 합니다.
전체 용량이 전달되면 간이 밝은 갈색을 나타내고 폐가 적분홍색에서 대부분 흰색으로 변할 때까지 차가운 PBS의 두 번째 10ml 분취액을 관류합니다. 집게와 미세한 해부 가위를 사용하여 주변 조직을 모두 조심스럽게 제거한 후 폐엽을 분리하고 얼음 위에 중간 정도의 차가운 폐 세포가 1-2밀리리터 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 다중 비드 어레이를 위해 폐 조직을 준비하려면 3개의 멸균 2.3ml 지르코니아/실리카 비드가 들어 있는 2밀리리터 튜브에 200마이크로리터의 저온 균질화 완충액을 추가하고 관심 폐엽의 무게를 측정합니다.
구슬과 균질화 완충액의 pre-chilled 관에 폐 조직의 50에서 100 밀리그램을 옮기고 4, 적어도 2 분 동안 분 당 000의 교체에 구슬 근거한 균질화기를 사용하여 로브를 균질화하십시오. 조직이 완전히 균질화되면 튜브를 원심분리하여 조직을 침전시키고 슈퍼 natant를 얼음 위의 미리 냉각된 1.5ml 마이크로 튜브로 옮깁니다. 폐 조직 해리를 위해 나머지 폐엽에서 폐 세포 배지를 조심스럽게 디케이팅하고 25 게이지 바늘을 조직에 삽입합니다.
200-250마이크로리터 부피의 해리 완충액을 각 폐엽에 주입하여 각 엽이 2-3회 주입될 때까지 폐를 팽창시킵니다. 실온에서 2분 동안 배양한 후 미세 해부 가위를 사용하여 폐를 작은 조각으로 다지고 조직 용액을 15ml 크로니클 튜브로 옮깁니다. 샘플에 6ml의 추가 해리 버퍼를 추가하고 1분 동안 격렬하게 소용돌이칩니다.
다음으로, 조직 조각을 섭씨 37도에서 7-8분마다 소용돌이치며 45분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 1분 동안 샘플을 격렬하게 와류시키고 샘플을 100미크론 세포 스트레이너에 통과시켜 원치 않는 잔류 결합 및 간질 조직을 제거합니다. 원심분리로 조직을 수집하고 5ml의 차가운 폐 배지로 펠릿에 재현탁합니다.
샘플을 다시 원심분리하고 펠릿을 부드러운 와류로 1ml의 차가운 폐 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 계산하기 전에 100미크론 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다. 분리된 폐 조직 내의 면역 세포 집단을 평가하기 위해 96웰의 둥근 바닥 플레이트가 있는 적절한 수의 웰에 설정된 10에서 6번째 파워 셀 항체를 1-2배 파종하고 원심분리에 의해 세포를 플레이트 바닥에 배치합니다.
25마이크로리터의 적절한 항체 칵테일을 차가운 FACS 완충액에 넣고 각 웰에 넣고 부드러운 파이프 페팅과 혼합합니다. 20분 후, 웰당 100마이크로리터의 차가운 FACS 완충액에 세포를 재현탁시키고 샘플을 튜브당 150마이크로리터의 추가 FACS 완충액을 포함하는 개별 5밀리리터 폴리스티렌 원형 바닥 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 표준 유세포 분석 프로토콜에 따라 유세포 분석기에서 샘플을 즉시 분석합니다.
이 대표적인 분석에서는 5-7개의 항체 조합으로 구성된 3세트를 사용하여 폐에서 13개의 서로 다른 면역 세포 집단을 확인했습니다. 살아있는 사체 염색을 사용하여 죽은 세포를 배제하고 표에 나열된 항체 및 마커를 사용하여 다양한 면역 세포 유형을 구별했습니다. 세트 1에서 폐포 및 간질성 대식세포, CD103 양성 및 CD11B 양성 수지상 세포 및 호산구가 확인되었습니다.
세트 2에서는 전염증성 단핵구와 호중구가 확인되었고, 세트 3에서는 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포, B 세포, 형질세포, NK 세포 및 NKT 세포가 확인되었습니다. 얻어진 CD45 양성 세포의 총 생존 세포 수 및 얻어진 CD45 양성 세포의 총 수는 입증된 바와 같이 분리된 세포 집단과 상업적으로 이용 가능한 조직 해리기를 사용하여 분리한 세포 집단 간에 유사했습니다. 또한, CD45 양성 세포의 세포 사멸 비율은 두 프로토콜 모두에서 10% 미만이었으며, 이는 입증된 프로토콜이 자동화된 조직 해리기의 도움 없이 높은 수율, 높은 품질의 세포 회수를 촉진한다는 것을 시사합니다.
또한, 유세포 분석과 결합된 상업적으로 이용 가능한 다중 분석을 사용하면 조직 1mg당 각 샘플의 케모카인 농도를 측정할 수 있습니다. 단일 세포 분리 중에 사용되는 콜라겐분해효소 D 농도, 배양 시간 및 온도는 면역 세포 회복에 중요한 영향을 미칩니다.
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이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중 후 폐 환경의 변화를 조사하기 위한 유세포 분석법의 사용을 설명합니다. 이는 마우스 모델에서 다양한 면역 세포 유형과 사이토카인을 식별할 수 있게 해줍니다.
Comprehensive immune profiling of the pulmonary environment following ischemic stroke enables mechanistic de-risking and target validation for immunomodulatory strategies. Quantitative flow cytometric analysis of immune cell subsets and cytokine mediators supports predictive confidence in early discovery and translational research. This approach informs portfolio decisions by clarifying immune alterations relevant to post-stroke complications and other pulmonary disease models.
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling quantitative immune profiling from early hypothesis testing through translational validation.