Name: 폐 환경에서 면역 세포 및 전염증성 중재자의 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 학습하세요 폐 환경에서 면역 세포 및 사이토카인을 분석하는 유세포 분석 기법을 통해 뇌졸중 후 면역 반응을 연구하는 방법을. 마우스 모델에서 13가지 면역 세포와 13가지 사이토카인을 동시에 식별할 수 있습니다.

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이 작업은 NIH 보조금 P20 GM109098과 Praespero에서 Edwin Wan까지의 혁신 상 프로그램에 의해 지원되었습니다. 유세포 측정 실험은 NIH grants S10 OD016165, U57 GM104942, P30 GM103488 및 P20 GM103434에 의해 지원되는 WVU Flow Cytometry & Single Cell Core Facility에서 수행되었습니다.

수행 된 모든 프로토콜과 절차는 웨스트 버지니아 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 마우스는 웨스트버지니아 대학교의 vivarium에서 특이적-병원체-비함유 조건 하에 수용되었다.
1. 용액의 제조
<ol><li>관류 완충액(인산완충식염수, PBS)을 준비한다. 마우스 당 약 두 개의 얼음처럼 차가운 PBS 분취량을 사용하십시오.</li>
	<li>폐 세포 배지 / FACS 버퍼를 준비하십시오. FACS 완충액은 1% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 PBS를 함유한다. 폐 절제와 이동의 전체 과정을 위해 중간 정도를 차갑게 유지하십시오. 폐 샘플 당 약 8 mL를 준비하십시오. 실험 전에 신선한 배지 / FACS 버퍼를 준비하십시오.</li>
	<li>단일 세포 분리를 위해 해리 완충액을 준비하십시오. 완충액은 행크의 완충 염 용액(HBSS)에 1mg/mL 콜라게나제 D와 200μg/mL DNase I을 함유한다. 실험 전에 원액 (100 mg / mL 콜라게나제 D 및 10 mg / mL DNase I)에서 신선하게 준비하십시오. 폐 샘플 당 약 6 mL가 필요합니다. 사용하기 전에 버퍼가 실온에 도달하는지 확인하십시오.</li>
	<li>폐 조직 균질화를 위한 균질화 완충액을 준비한다. 완충액은 PBS 및 1x 프로테이나제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 함유한다(스톡=100x). 실험 전에 신선하게 준비하십시오. 전체 균질화 과정 동안 버퍼를 차갑게 유지하십시오. 대략 200 μL의 완충제는 폐의 단일 우로브를 균질화하기에 충분하다.</li>
</ol>2. 일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색 (tMCAO)
참고: 중간 대뇌 동맥에 모노필라멘트 삽입을 통한 tMCAO에 대한 절차는 이전에10에 상세히 문서화되었다. 이들 실험에서, 25-30 g의 체중을 갖는 8-12주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였다.
<ol><li>간단히 말해서, 수술 전에 마우스에 2 mg / kg 멜록시캄을 피하 투여하십시오. 마우스를 5% 이소플루란을 사용하여 유도 챔버에서 깊이 마취시킨다. 발가락 핀치 방법을 사용하여 깊은 마취를 확인하십시오. 코 콘을 사용하여 수술 중에 1-2 % 이소 플루란으로 마취를 유지하십시오. 마우스 아래에 따뜻한 담요를 놓아 시술 내내 체온을 36.5 - 38 °C로 유지하십시오. 모든 수술 도구는 수술 하루 전에 오토클레이브 살균해야합니다.</li>
	<li>면도하고 70 % 에탄올을 사용하여 복부 목의 피부를 준비한 다음 클로르헥시딘 스크럽을 준비하십시오. 첫 번째 절개를하기 전에 절개 부위에 2mg / kg bupivacaine을 피하 투여하십시오. 건조를 방지하기 위해 눈을 가리기 위해 눈 연고를 사용하십시오. 중간 선 목 절개를하십시오. 기관 주위의 연조직을 부드럽게 당겨 내립니다.</li>
	<li>왼쪽 일반적인 경동맥과 외부 경동맥을 확인하십시오.</li>
	<li>혈액의 흐름을 막기 위해 일반적인 경동맥에 임시 봉합사 (크기 6/0)를 적용하십시오. 외부 경동맥을 절개하십시오.</li>
	<li>실리콘 고무 코팅 모노필라멘트(크기 6-0)를 외부 경동맥에 삽입한 다음, 모노필라멘트를 중간 대뇌 동맥으로 전진시킨다. 모노 필라멘트를 중간 대뇌 동맥에 60 분 동안 두십시오 (폐색).</li>
	<li>레이저 도플러 유량계를 사용하여 혈류 속도를 모니터링합니다. 중간 대뇌 동맥으로의 유속의 감소가 > 80%는 성공적인 폐색을 나타낸다.</li>
	<li>60분의 폐색 후, 모노필라멘트를 제거하여 재관류가 일어나도록 한다. 절개를 닫습니다.</li>
	<li>가짜 조작된 마우스에서, 모노필라멘트의 삽입 없이 단계 2.1-2.6을 수행한다. 이 생쥐에서 혈류 속도는 전체 절차 중에 일정하게 유지되어야합니다.</li>
	<li>매일 마우스를 모니터하고 표준 채점 기준11을 사용하여 신경 학적 결핍을 측정하십시오. 0 – 신경 학적 결손 없음; 1 – 꼬리에 의해 들어 올릴 때 반대쪽 앞발을 철회; 2- 꼬리에 의해 들어 올릴 때 대측으로 원; 3- 걷는 동안 대측으로 떨어지는 것; 4 – 자발적으로 걷지 않거나 혼수 상태; 5 - 죽었어.</li>
	<li>수술 후 3 일 동안 24 시간마다 정상 식염수와 진통제 (meloxicam, 2 mg / kg)를 피하 주사하십시오.</li>
	<li>하류 분석을 위해 tMCAO 후 24 및 72 h 후에 폐를 분리한다.</li>
</ol>3. 폐 조직 수확
<ol><li>100 mg / kg의 케타민과 10 mg / kg의 자일라진 주사를 복강 내 (i.p.) 주사하여 마우스를 깊이 마취하십시오. 발가락 핀치 방법을 사용하여 깊은 마취를 확인하십시오.</li>
	<li>전신 심질 관류(12)를 수행하기 위해, 마우스를 수술 플랫폼에 고정하고 70% 에탄올로 모피를 적셔 체강 내로의 모피 분포를 감소시킨다. 미세한 해부 가위를 사용하여 꼬리 복부를 가로 절개 한 다음 복막의 중간 선 절개를 만들어 횡격막을 관통하기 전에 흉강에서 멈 춥니 다.<ol><li>근육을 통해 자르지 말고 복강으로 숨어 복부를 절개하지 마십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>횡격막에 구멍을 뚫기 전에 흉강에 도달하자마자 절개를 중단하십시오. 관류 품질 또는 세포 회복을 저해 할 수있는 심장과 폐를 손상시키지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>미세한 해부 가위를 사용하여 횡격막을 관통하기 전에 흉강에서 멈추는 복막의 중간 선 절개를 만듭니다.</li>
	<li>포셉을 사용하여 흉골의 원위 끝으로 마우스를 잡고 횡격막을 절단하면서 위쪽으로 들어 올려 심장, 폐 또는 혈관 조직을 손상시키지 않도록하십시오. 장기가 보이면 흉곽을 통해 절개를하고 흉곽 케이스를 분리하고 핀으로 고정하여 심장과 폐가 완전히 노출되도록하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 대동맥 아치 근처의 오른쪽 심방에서 작은 절개를하십시오. 이것은 관류를위한 유출 역할을 할 것입니다.</li>
	<li>그 직후, 차가운 PBS 10 mL로 채워진 주사기에 부착된 25 G x 5/8 바늘을 좌심실의 원위 우량한 표면 내로 부드럽게 삽입한다. 심실 중격을 통해 우심실에 삽입하지 않도록주의하십시오. 바늘은 좌심실에 간신히 삽입해야합니다. 참고 : 심실 중격이 뚫리면 마우스의 코에서 액체가 흘러 나옵니다. 이것은 관류 품질을 감소시키고 세포 손실을 초래할 것이다.</li>
	<li>원하는 경우, 관류 동안 좌심실 내의 제자리에 바늘을 단단히 고정시키기 위해 클램프를 사용할 수 있다.</li>
	<li>차가운 PBS 10 mL를 꾸준히 부드럽게 밀어 넣는다. 마우스 조직은 유체가 오른쪽 심방에서 빠져 나올 때 혈액을 관류하고 제거해야합니다.<ol><li>충분한 혈액 클리어런스가 발생할 때까지 PBS 10 mL의 두 번째 분취량을 밀어 넣습니다. 간은 밝은 갈색으로 보이고 폐는 붉은 분홍색에서 대부분 흰색으로 변합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>포셉과 미세 해부 가위를 사용하여 심장, 기관, 식도, 흉선, 결합 조직, 림프절 및 대형 기관지를 포함한 모든 주변 조직을 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>개별 폐 엽을 분리하고 엽을 차가운 폐 세포 배지의 1-2 mL 분취량을 함유하는 얼음 위에 페트리 접시에 넣는다.</li>
</ol>4. 비드 호모게나이저를 이용한 멀티플렉스 비드 어레이용 폐 조직의 균질화
<ol><li>멸균 2.3mm 지르코니아/실리카 비드 3개가 들어 있는 2mL 원뿔형 스크류 캡 튜브를 미리 식히십시오. 200 μL의 차가운 균질화 완충액을 튜브에 첨가한다.</li>
	<li>엽을 계량하고, 로브를 비드 및 균질화 완충액을 함유하는 미리 냉각된 원뿔형 튜브로 옮긴다. 참고: 200 μL의 완충액에서 균질화된 대략 50-100 mg의 조직은 샘플에서 사이토카인 및 케모카인 발현을 검출하기에 충분할 것이다.<ol><li>비드계 호모게나이저(표 표 참조)를 사용하여 로브를 4,000 rpm에서 2분 동안 균질화한다.</li>
		<li>조직이 완전히 균질화되었는지 확인하십시오. 필요한 경우 시간을 늘리십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>균질화 후, 튜브를 3분 동안 15,870 x g 에서 미리 냉각된 (4°C) 마이크로원심분리기에서 원심분리한다.</li>
	<li>상청액을 미리 냉각된 1.5 mL 마이크로튜브로 옮긴다.</li>
	<li>샘플을 즉시 사용하기 위해 얼음 위에 직접 놓거나 나중에 사용하기 위해 샘플을 -80°C에 보관하십시오. 여러 번의 동결-해동 주기를 피하십시오.</li>
</ol>5. 폐 조직 해리 및 단일 세포 분리
<ol><li>해리 완충액의 희석을 피하기 위해 나머지 폐 엽의 폐 세포 배지를 붓는다. 그런 다음, 해리 완충액 1mL를 함유하는 25G 및 5/8 바늘이 있는 1 mL 주사기를 폐 조직에 조심스럽게 삽입한다.</li>
	<li>해리 버퍼의 작은 분획 (약 1/4~ 1/5th)을 각 폐 엽에 주입하고 부드럽게 팽창시킵니다. 참고 : 대부분의 버퍼는 엽이 절제됨에 따라 팽창 한 직후에 급히 빠져 나옵니다.</li>
	<li>해리 버퍼 1-2x의 주입을 반복하십시오.</li>
	<li>폐 엽을 실온에서 2분 동안 해리 완충액으로 인큐베이션한다.</li>
	<li>미세한 해부 가위를 사용하여 폐 엽을 작은 조각으로 잘게 다듬습니다.</li>
	<li>다진 폐 조각을 해리 완충액과 함께 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴다.  추가 해리 완충액을 총 6 mL로 보충하십시오. 1 분 동안 격렬하게 소용돌이.</li>
	<li>샘플을 37°C에서 45분 동안 인큐베이션한다. 소용돌이는 7-8 분마다 격렬하게 소용돌이친다.</li>
	<li>45분 인큐베이션 후, 최적의 결과를 위해 샘플을 1분 동안 격렬하게 와류시킨다.</li>
	<li>샘플을 100 μm 세포 스트레이너를 통과시켜 잔존, 바람직하지 않은 결합 및 간질성 조직을 제거함으로써 샘플을 더욱 해리시킨다.</li>
	<li>샘플을 380 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.</li>
	<li>차가운 폐 세포 배지 5 mL를 샘플에 첨가한다. 부드러운 볼텍싱에 의해 세포 펠릿을 재현탁시킨다.</li>
	<li>샘플을 380 x g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버린다.</li>
	<li>차가운 폐 세포 배지 1 mL를 첨가하십시오. 부드러운 볼텍싱에 의해 세포 펠릿을 재현탁시킨다.</li>
	<li>100 μm 세포 스트레이너를 통과시키고, 세포를 계수한다.</li>
</ol>6. 폐 면역 세포 틈새 시장에 대한 유세포 분석
<ol><li>시드 1-2 x 106 세포 / 항체를 96 웰 둥근 바닥 플레이트 (총 3 세트)에 설정합니다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포 펠릿을 고정가능한 생/사 얼룩을 함유하는 50 μL의 차가운 PBS에 재현탁시킨다. 제조업체의 지침에 따라 얼룩을 준비하십시오.</li>
	<li>세포를 빛으로부터 보호된 20분 동안 4°C에서 인큐베이션한다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포 펠렛을 5 μg/mL의 항-마우스 CD16/32 항체를 함유하는 25μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 4°C에서 10-15분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>표 1에 열거된 항체 조합을 함유하는 25 μL의 차가운 FACS 완충액을 세포에 첨가한다. 부드러운 피펫팅으로 혼합하십시오. 참고: 항체 염색을 위한 FACS 완충액의 총 부피는 50 μL이다. 따라서, 항체의 마스터 믹스를 25 μL로 제조할 때, 항체의 농도는 최종 농도의 두 배가 되어야 한다.</li>
	<li>세포를 빛으로부터 보호된 20분 동안 4°C에서 인큐베이션한다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 150 μL의 추가 FAC 완충액을 함유하는 폴리스티렌 둥근바닥 5 mL FACS 튜브로 옮긴다. 유세포 분석기를 사용하여 샘플을 즉시 분석하십시오. 참고: 다음 단계를 사용한 셀 고정을 통해 나중에 샘플을 분석할 수 있습니다.</li>
	<li>단계 6.7.에 이어서, 샘플을 PBS 중의 1% 파라포름알데히드의 100 μL로 재현탁시켰다.</li>
	<li>샘플을 빛으로부터 보호된 15분 동안 4°C에서 인큐베이션한다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 세포를 830 x g에서 3분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리십시오.</li>
	<li>세포를 100 μL의 차가운 FACS 완충액으로 재현탁시킨다. 세포를 4°C에서 저장하고, 빛으로부터 보호한다. 72 h 이내에 샘플을 분석하십시오.</li>
</ol>7. 사이토카인 및 케모카인 검출을 위한 멀티플렉스 비드 어레이
참고: 상업적으로 입수가능한 전염증성 케모카인 및 염증 멀티플렉스 패널( 표 참조)은 제조자 프로토콜에 따라 tMCAO 유도에 따라 폐에서 케모카인 및 사이토카인의 발현을 확인하기 위해 사용되었으며, 이는도 13에 상세히 기술되어 있다.
<ol><li>간단히 말해서, 분석물을 얼음 상에서 해동시키면 조직 균질화 후 -80°C에서 보관하였다. 샘플을 사용하기 전에 4°C에서 2분 동안 590 x g 에서 원심분리하여 임의의 잔류 조직을 제거하였다.</li>
	<li>10ng/mL의 알려진 농도에 있는 표준 칵테일(C7)을 7개의 표준(C1-6)으로 연속적으로 희석하여 표준 곡선을 생성하고, 마지막 표준은 분석 버퍼 단독(C0)입니다.</li>
	<li>모든 시약을 실온으로 가온한 후, 각 표준 25μL와 분석 완충액 25μL를 V 하부 96웰 플레이트에 첨가한다.</li>
	<li>각 샘플 웰에 25 μL의 폐 균질물 (분석물) 및 25 μL의 분석 완충액을 V 하부 96 웰 플레이트에 첨가한다.</li>
	<li>예비코팅된 비드를 격렬하게 볼텍스한 다음, 25μL의 예비코팅된 비드를 각각의 표준 및 샘플 웰에 첨가한다.</li>
	<li>플레이트를 밀봉하고 호일로 덮어 빛으로부터 보호하십시오. 플레이트를 실온에서 2시간 동안 110 rpm으로 흔들었다.</li>
	<li>230 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 1x에서 세척 완충액 200μL를 첨가한다(원액은 20x, 물로 1x로 희석). 1분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>230 x g 에서 5분 동안 원심분리한다. 표준 및 샘플을 25 μL 검출 항체로 재현탁시킨다.</li>
	<li>빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 밀봉하고 덮으십시오. 플레이트를 실온에서 1 h 동안 110 rpm으로 진탕한다.</li>
	<li>25 μL의 스트렙타비딘-피코에리트린(SA-PE)을 각 표준 및 샘플 웰에 첨가한다.</li>
	<li>빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 밀봉하고 덮으십시오. 실온에서 30분 동안 110rpm으로 흔들어 주십시오.</li>
	<li>플레이트를 230 x g 에서 5분 동안 회전시킨다. 표준 및 샘플을 1x 세척 완충액에 재현탁한다.</li>
	<li>웰 라벨링된 폴리스티렌 둥근바닥 5 mL FACS 튜브로 150 μL의 1x 세척 완충액을 추가로 함유한다.</li>
	<li>유세포 분석기를 사용하여 표준 및 샘플에 대한 PE 신호 형광 강도를 결정한다.</li>
	<li>미리 결정된 농도에 대해 PE의 평균 형광 강도(MFI)를 사용하여 각 케모카인 및 사이토카인에 대한 표준 곡선을 구성한다.</li>
	<li>각 샘플로부터의 표준 곡선 및 MFI를 사용하여 각 케모카인 및 사이토카인의 농도를 결정한다. 멀티플렉스 패널은 각 분석물의 농도를 결정하는 데 사용할 수 있는 데이터 분석 소프트웨어를 제공합니다. apical/superior lobe의 무게는 조직의 밀리그램 당 사이토카인 또는 케모카인의 농도를 결정하는 데 사용됩니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 기술된 프로토콜은 폐 면역 세포 유형의 확인 및 동일한 마우스에서 케모카인 또는 사이토카인의 발현을 허용한다. 조직병리학 연구가 바람직한 경우, 단일 세포 분리 단계로 진행하기 전에 개별 엽을 제거하고 그 목적을 위해 고정시킬 수 있다. 이 방법의 한 가지 한계는 면역 세포 조성의 변화와 케모카인 및/또는 사이토카인의 발현이 폐의 상이한 엽 사이에 불평등하게 분포될 것으로 예상되는 경우 일부 질병 설정에서 이 접근법이 적합하지 않을 수 있다는 것이다. 예를 들어, Mycobacterium tuberculosis 와 같은 일부 박테리아는 폐(21)의 특정 엽을 감염시키는 경향을 나타낸다. 이 경우 로브 간의 비교가 필요할 수 있습니다.
폐로부터의 단일 세포 분리 프로토콜의 농도, 배양 시간 및 온도는 폐로부터의 면역 세포의 회복에 중대한 영향을 미친다. 콜라게나제 D의 품질은 최적의 결과를 얻는 데 중요하며 콜라게나...

폐는 외부 환경에 노출되는 장벽 기관이므로 병원균 및 알레르겐1과 같은 면역 학적 도전을 끊임없이 받고 있습니다. 폐 거주 면역 세포의 활성화와 주변부에서 면역 세포의 침윤은 폐 환경에서 병원균을 제거해야합니다. 또한, 폐에 거주하는 면역 세포는 공생 박테리아에 대한 내성을 유지하며, 이는 이들 세포가 병원균 제거 및 항상성 유지에 중요한 역할을한다는 것을 암시합니다1. 폐포 및 간질성 대식세포는 패턴 인식 수용체를 통해 병원체를 감지하고 식균작용에 의해 이러한 병원체를 제거하는 폐 상주 감시자 면역 세포 중하나입니다 2. 폐-상주 수지상 세포는 항원 제시3을 통해 선천적 및 적응성 면역 반응을 연결한다. 또한, 활성화된 국소 선천적 면역 세포는 염증 반응을 증폭시키고 단핵구, 호중구 및 림프구와 같은 면역 세포의 폐로의 침윤을 자극하는 사이토카인 및 케모카인을 생성한다1. 허혈성 뇌졸중은 전신 면역을 변형시키고 폐 감염에 대한 감수성을 증가시키는 것으로 나타났습니다. 그러나 허혈성 뇌졸중 후 폐 구획을 평가 한 연구는 거의 없지만 일부 연구는 염증 상태 4,5,6,7,8,9 동안이를 조사했습니다. 본원에 기재된 방법의 목표는 폐 병리, 면역 세포 조성물, 폐에서의 사이토카인 및 케모카인 발현의 수준을 동시에 결정하여 폐 구획에 대한 변경을 평가하고 허혈성 발작 후 폐 면역 반응에 대한 잠재적 변화를 평가하는 것이다.
여기에 기재된 것은 13가지 유형의 면역 세포를 확인하기 위해 마우스의 폐로부터 단일 세포 현탁액을 수득하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 자동화된 조직 해리제가 필요 없이 콜라게나제 D를 사용한 조직 소화를 기반으로 합니다. 추가적으로, 우리는 유세포 분석기 기반 멀티플렉스 비드 어레이를 사용하여 13개의 상이한 사이토카인 또는 케모카인의 발현 수준을 결정하는데 사용될 수 있는 조직 균질물을 제조하기 위한 프로토콜을 개발하였다. 이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중이 폐 면역에 미치는 영향을 조사하는 데 성공적으로 사용되었으며 다른 질병 모델에서도 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>B220-APC, 클론 RA3-6B2</td><td>Biolegend</td><td>103212</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>Beadbug 3 위치 비드 균질화기</td><td>벤치마크 사이언티픽</td><td>D1030</td><td>조직 균질화기</td></tr><tr><td>CCR2-BV421, 클론 SA203G11</td><td>Biolegend</td><td>150605</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>CD103-BV421, 클론 2E7</td><td>Biolegend</td><td>121422</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>CD11b-PE/Cy7, 클론 M1/70</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>1:400 희석</td></tr><tr><td>CD11c-PE/Cy7, 클론 N418</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>CD11c-Percp/Cy5.5, 클론 N418</td><td>Biolegend</td><td>117328</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>CD4-BV421, 클론 GK1.5</td><td>Biolegend</td><td>100443</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>CD45-FITC, 클론 30-F11</td><td>Biolegend</td><td>103108</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>CD64-APC, 클론 X54-5/7.1</td><td>Biolegend</td><td>139306</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>CD8-PE, 클론 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100708</td><td>1:800 희석</td></tr><tr><td>콜라겐분해효소 D</td><td>시그마 알드리치</td><td>11088882001</td><td>해리 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>원추형 스크류 캡 튜브</td><td>ThermoFisher</td><td>02-681-344</td><td>조직 균질화용 튜브</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10104159001</td><td>해리 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>Fc 블록 CD16/32 항체</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>1:100 희석</td></tr><tr><td>genlteMACS 해리기</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>기계적 해리기를 사용하거나 사용하지 않은 폐 소화의 비교</td></tr><tr><td>gentleMACS C 튜브</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>genlteMACS 해리기를 사용한 조직 디스코이에이션용 튜브</td></tr><tr><td>중단 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제 Cocktial</td><td>ThermoFisher</td><td>78442</td><td>균질화 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>레이저 도플러 모니터</td><td>Moor</td><td>MOORVMS-LDF</td><td>tMCAO</td></tr><tr><td>LEGENDplex 전염증성 케모카인 패널</td><td>Biolegend</td><td>740451</td><td>Multiplex bead array</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD fixable near-IR stain</td><td>ThermoFisher</td><td>L34976</td><td>유세포 분석 중 사멸 세포 배제에 사용</td></tr><tr><td>Ly6C-PE, 클론 HK1.4</td><td>Biolegend</td><td>128008</td><td>1:800 희석</td></tr><tr><td>Ly6G-BV510, 클론 1A8</td><td>Biolegend</td><td>127633</td><td>1:200 희석</td></tr><tr><td>MCAO 봉합사 L56 재사용 가능 6-0 매체</td><td>Doccol</td><td>602356PK10Re</td><td>tMCAO</td></tr><tr><td>MHC II-BV510, 클론 M5/114.15.2</td><td>Biolegend</td><td>107636</td><td>1:800 희석</td></tr><tr><td>NK1.1-Percp / Cy5.5, 클론 PK136</td><td>Biolegend</td><td>108728</td><td>1 : 200 희석</td></tr><tr><td>Siglec F-PE, 클론 E50-2440</td><td>BD Biosciences</td><td>552126</td><td>1 : 200 희석</td></tr><tr><td>실크 봉합사, 크기 6/0</td><td>Fine Science Tools</td><td>18020-60</td><td>tMCAO</td></tr><tr><td>SomnoSuite 마취 시스템</td><td>Kent Scientific</td><td>SS-01</td><td>tMCAO</td></tr><tr><td>TCRb-BV510 용 마우스 마취, 클론 H57-897</td><td>Biolegend</td><td></td><td>109234 1:200 희석</td></tr><tr><td>지르코니아/실리카 비드, 2.3mm</td> 조직 <td>균질화를 위한</td> <td>Biospec</td><td>11079125z</td> 비드</tr></tbody></table>

폐 환경에서 면역 세포 및 전염증성 중재자의 특성화

Characterization of Immune Cells and Proinflammatory Mediators in the Pulmonary Environment

면역 세포 확장, 활성화 및 여러 사이토카인 및 케모카인의 발현에 의해 조절되는 폐로의 밀매는 심각한 뇌 손상에 의해 변경될 수 있다. 이것은 폐렴이 허혈성 뇌졸중으로 고통받는 환자의 주요 사망 원인이라는 사실에 의해 입증됩니다. 이 프로토콜의 목표는 폐포 대식세포, 간질성 대식세포, CD103+ 또는 CD11b+ 수지상 세포(DCs), 혈장 세포질 DCs, 호산구, 단핵구/단핵구 유래 세포, 호중구, 림프구 유래 T 및 B 세포, NK 세포 및 NKT 세포를 포함한 마우스의 폐에서 13가지 유형의 면역 세포를 확인하기 위해 다색 유세포 분석의 사용을 설명하는 것이며, 일시적인 중간 대뇌 동맥 폐색에 의한 허혈성 뇌졸중 유도에 이른다. 더욱이, 우리는 비드 균질화 방법을 사용하여 폐 균질액의 제조를 기술하고, 유세포 분석과 결합된 멀티플렉스 비드 어레이에 의해 동시에 13개의 상이한 사이토카인 또는 케모카인의 발현 수준을 결정한다. 이 프로토콜은 또한 감염성 폐 질환 또는 알레르기성 질환과 같은 다른 질병 설정에서 폐 면역 반응을 조사하는데 사용될 수 있다.

우리는 최근에 마우스에서 허혈성 뇌졸중 유도가 폐11의 면역 세포 조성을 변화시킨다고보고했다. 구체적으로, 일과성 뇌 허혈은 폐포 대식세포, 호중구 및 CD11b+ DC의 백분율을 증가시켰고, 폐 구획에서 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포, NK 세포 및 호산구의 백분율을 감소시켰다. 또한, 세포 변화는 폐에서 여러 케모카인의 상당히 감소된 수준에 상응했다. 여기에 기재된 것은 폐 구획에서 상이한 면역 세포 집단의 단리 및 동정을 위한 방법이다. 여기에 나타난 대표적인 결과는 tMCAO 유도 및 가짜 수술을 받은 마우스로부터의 것이었다.
우리는 5-7 개의 항체를 포함하는 각 세트와 3 세트의 항체 조합을 사용하여 폐 (L1-L13)에서 13 개의 다른 면역 세포 집단을 확인했습니다 (그림 1). 죽은 세포는 각 세트에서 LIVE/DEAD 염색을 사용하여 배제하였다. 상...

이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중의 뮤린 모델인 일시적 중간 대뇌동맥 폐색 후 폐 환경에서 면역 세포 조성, 사이토카인 프로파일, 및 케모카인 프로파일의 변화를 확인하기 위한 유세포 분석기의 사용을 기술한다.

Immune cell expansion, activation, and trafficking to the lungs, which are controlled by the expression of multiple cytokines and chemokines, may be ...

이 프로토콜은 허혈성 뇌졸중 후 폐 환경의 변화를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 유세포 분석을 통해 동일한 마우스에서 13개의 폐 면역 세포 유형과 13개의 서로 다른 사이토카인 및 케모카인을 식별할 수 있습니다. 이 방법은 허혈성 뇌졸중 후 폐 환경의 변화를 평가하는 데 사용되었습니다.그러나 알레르기 반응이나 감염 중 변화를 조사하는 역할도 할 수 있습니다. 전신 심간 관류를 수행하려면 마취된 마우스에서 페달 반사에 대한 반응 부족을 확인하고 마우스를 수술 플랫폼에 고정합니다. 모피에 70% 에탄올을 적셔 체강으로의 털 분포를 줄이고 수직 정중선 피부 절개를 만들어 온전한 복막을 노출시켜 흉강에 도달하는 즉시 절개를 멈춥니다.미세한 절개 가위를 사용하여 흉강에서 멈추는 복막의 정중선을 절개하고 집게를 사용하여 흉골의 원위 끝을 잡습니다. 가위를 사용하여 심장, 폐 또는 혈관 구조를 손상시키지 않고 횡격막을 절단합니다. 밑에 있는 조직이 보이면 흉곽을 절개하고 갈비뼈 측면을 고정하여 심장과 폐가 완전히 드러나도록 합니다.관류를 위한 배출구 역할을 하도록 대동맥궁 근처의 우심방을 조심스럽게 작게 절개하고 좌심실의 원위 상면에 25게이지 바늘을 빠르고 부드럽게 삽입합니다. 바늘이 제자리에 고정되면 10ml의 차가운 PBS를 심장으로 부드럽게 씻어냅니다. 조직에서 피가 제거되기 시작해야 합니다.전체 용량이 전달되면 간이 밝은 갈색을 나타내고 폐가 적분홍색에서 대부분 흰색으로 변할 때까지 차가운 PBS의 두 번째 10ml 분취액을 관류합니다. 집게와 미세한 해부 가위를 사용하여 주변 조직을 모두 조심스럽게 제거한 후 폐엽을 분리하고 얼음 위에 중간 정도의 차가운 폐 세포가 1-2밀리리터 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 다중 비드 어레이를 위해 폐 조직을 준비하려면 3개의 멸균 2.3ml 지르코니아/실리카 비드가 들어 있는 2밀리리터 튜브에 200마이크로리터의 저온 균질화 완충액을 추가하고 관심 폐엽의 무게를 측정합니다.구슬과 균질화 완충액의 pre-chilled 관에 폐 조직의 50에서 100 밀리그램을 옮기고 4, 적어도 2 분 동안 분 당 000의 교체에 구슬 근거한 균질화기를 사용하여 로브를 균질화하십시오. 조직이 완전히 균질화되면 튜브를 원심분리하여 조직을 침전시키고 슈퍼 natant를 얼음 위의 미리 냉각된 1.5ml 마이크로 튜브로 옮깁니다. 폐 조직 해리를 위해 나머지 폐엽에서 폐 세포 배지를 조심스럽게 디케이팅하고 25 게이지 바늘을 조직에 삽입합니다.200-250마이크로리터 부피의 해리 완충액을 각 폐엽에 주입하여 각 엽이 2-3회 주입될 때까지 폐를 팽창시킵니다. 실온에서 2분 동안 배양한 후 미세 해부 가위를 사용하여 폐를 작은 조각으로 다지고 조직 용액을 15ml 크로니클 튜브로 옮깁니다. 샘플에 6ml의 추가 해리 버퍼를 추가하고 1분 동안 격렬하게 소용돌이칩니다.다음으로, 조직 조각을 섭씨 37도에서 7-8분마다 소용돌이치며 45분 동안 배양합니다. 배양이 끝나면 1분 동안 샘플을 격렬하게 와류시키고 샘플을 100미크론 세포 스트레이너에 통과시켜 원치 않는 잔류 결합 및 간질 조직을 제거합니다. 원심분리로 조직을 수집하고 5ml의 차가운 폐 배지로 펠릿에 재현탁합니다.샘플을 다시 원심분리하고 펠릿을 부드러운 와류로 1ml의 차가운 폐 배지에 재현탁합니다. 그런 다음 계산하기 전에 100미크론 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다. 분리된 폐 조직 내의 면역 세포 집단을 평가하기 위해 96웰의 둥근 바닥 플레이트가 있는 적절한 수의 웰에 설정된 10에서 6번째 파워 셀 항체를 1-2배 파종하고 원심분리에 의해 세포를 플레이트 바닥에 배치합니다.25마이크로리터의 적절한 항체 칵테일을 차가운 FACS 완충액에 넣고 각 웰에 넣고 부드러운 파이프 페팅과 혼합합니다. 20분 후, 웰당 100마이크로리터의 차가운 FACS 완충액에 세포를 재현탁시키고 샘플을 튜브당 150마이크로리터의 추가 FACS 완충액을 포함하는 개별 5밀리리터 폴리스티렌 원형 바닥 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 표준 유세포 분석 프로토콜에 따라 유세포 분석기에서 샘플을 즉시 분석합니다.이 대표적인 분석에서는 5-7개의 항체 조합으로 구성된 3세트를 사용하여 폐에서 13개의 서로 다른 면역 세포 집단을 확인했습니다. 살아있는 사체 염색을 사용하여 죽은 세포를 배제하고 표에 나열된 항체 및 마커를 사용하여 다양한 면역 세포 유형을 구별했습니다. 세트 1에서 폐포 및 간질성 대식세포, CD103 양성 및 CD11B 양성 수지상 세포 및 호산구가 확인되었습니다.세트 2에서는 전염증성 단핵구와 호중구가 확인되었고, 세트 3에서는 CD4 양성 및 CD8 양성 T 세포, B 세포, 형질세포, NK 세포 및 NKT 세포가 확인되었습니다. 얻어진 CD45 양성 세포의 총 생존 세포 수 및 얻어진 CD45 양성 세포의 총 수는 입증된 바와 같이 분리된 세포 집단과 상업적으로 이용 가능한 조직 해리기를 사용하여 분리한 세포 집단 간에 유사했습니다. 또한, CD45 양성 세포의 세포 사멸 비율은 두 프로토콜 모두에서 10% 미만이었으며, 이는 입증된 프로토콜이 자동화된 조직 해리기의 도움 없이 높은 수율, 높은 품질의 세포 회수를 촉진한다는 것을 시사합니다.또한, 유세포 분석과 결합된 상업적으로 이용 가능한 다중 분석을 사용하면 조직 1mg당 각 샘플의 케모카인 농도를 측정할 수 있습니다. 단일 세포 분리 중에 사용되는 콜라겐분해효소 D 농도, 배양 시간 및 온도는 면역 세포 회복에 중요한 영향을 미칩니다.

characterization-immune-cells-proinflammatory-mediators-pulmonary

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

마우스 폐 돌기 세포의 고도 정화 준비가 설명되어 있습니다. 구체적인 중점이 종래의 돌기 세포 집합의 고립에 제공됩니다.

마우스 폐에 돌기 세포의 분리

우리는 ovalbumin 유도된 알레르기기도 염증의 설정에서 ovalbumin에 대한 응답으로 폐 돌기 세포의 성숙 및 마이 그 레이션을 모니터링하는 전략을 설명합니다. 이 전략은 감염의 설정에서 폐 돌기 세포의 이주를 평가하기 위해 수정할 수 있습니다.

알레르기기도 염증 동안 폐 돌기 세포 성숙과 마이 그 레이션 분석

우리는 급성 폐 손상을 모델링하기 위해, 분무에 의해 에어로졸 리포 폴리 사카 라이드에 도전하여 호중구 폐 염증을 유도하는 방법을 설명합니다. 또한, 폐 격리, 기관 삽관 및 기관지 세척액에 대한 기본적인 수술 기법도 설명되어 있습니다.

에어로졸 리포 폴리 사카 라이드를 사용하여 생성 폐 호중구하는 방법

여기에 설명 된 방법은 비 침습적 bioluminescence 이미징 (BLI)을 통해 생쥐의 폐에서 IL-8 프로모터 의존 염증 활성화의 시각화 수 있습니다. 동일한 동물을 루시퍼 레이즈 리포터 구조물의 전달 시점으로부터 최대 2 개월 동안 BLI에 여러 번 투여 할 수있다.

IL-8 transiently Transgenized 마우스 모델<em&gt; In Vivo</em&gt; 염증 반응의 장기 모니터링

이 프로토콜에서는 위 항공에서 그대로 점 막 안 대기의 샘플링에 대 한 비 침 투 적인 기법을 설명합니다. 그것은 모든 연령대의 주제에 vivo에서 단백질 중재자, cytokines, 발산, 등의 레벨의 정량화를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다.

상부 기도 면역 중재자 수준 Vivo에서 의 정량화에 대 한 점 막 안 대기의 비 침범 성 샘플링

이 통신 격리와 인간에서 치경 대 식 세포의 문화에 대 한 방법론 및 실험적인 목적을 위한 murine 모델에 설명합니다.

고립과 Murine 인간과 치경 대 식 세포의 생체 외에서 문화

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

결합 된 오존과 세균성 내독신 노출 마우스는 호중구의 것을 포함하여 광범위한 세포 죽음을 보여줍니다. 우리는 세포 골격 라멜레포디아의 중단, 기관지 폐포 라베이지의 복잡한 V ATP synthase 서브유닛 β 및 혈관 스타틴의 세포 발현 증가, 폐 면역 반응 억제 및 지연 된 호중구 모집과 같은 세포 적응을 관찰했습니다.

결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화

이 연구에서, 우리는 뮤린 호흡기의 면역 집단을 분리하기위한 효과적이고 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 9 색 기반 유세포 측정 패널을 사용하여 건강한 마우스의 폐에 존재하는 모든 선천적 및 적응 면역 세포를 확인하는 방법을 제공합니다.

뮤린 폐의 선천적 및 적응성 면역 세포의 확인을 위한 유세포 분석

여기에 제시된 것은 장기 바이오뱅킹을 위한 원발성 기관지 상피 세포의 분리 및 확장과 공기-액체 계면에서 배양에 의한 분화된 상피 세포의 생성을 위한 재현 가능하고 저렴하며 강력한 방법입니다.

바이오뱅킹을 위해 절제된 폐 조직에서 기관지 상피 세포를 분리하고 잘 분화된 공기-액체 계면 배양을 확립합니다.

이 프로토콜은 인플루엔자 감염 후 안정적인 상태에서 마우스 폐에서 살아있는 면역 및 비면역 집단을 격리하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한 상피 및 골수성 세포 부분 집합을 식별하기 위한 게이팅 전략을 제공합니다.

Isolation of Live Myeloid and Epithelial Cell Populations from the Mouse Lung(쥐 폐에서 살아있는 골수성 및 상피 세포 집단의 분리)

학습하세요 폐 환경에서 면역 세포 및 사이토카인을 분석하는 유세포 분석 기법을 통해 뇌졸중 후 면역 반응을 연구하는 방법을. 마우스 모델에서 13가지 면역 세포와 13가지 사이토카인을 동시에 식별할 수 있습니다.

폐 환경에서 면역 세포 및 전염증성 중재자의 특성화

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