자성 나노 물질의 생체 기능화

이 프로토콜의 주요 특징은 광범위한 산화철-철 나노 물질에 적용할 수 있다는 것입니다. 더구나, 그것은 철 금 nanowires와 같은 다 세그먼트 nanomaterial에 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 모든 표준 생물학 실험실에서 안전하게 수행할 수 있습니다.

이 생체 기능화 기술의 주요 장점은 나노와이어와 항체 사이의 강력한 공유 결합을 기반으로 특이적으로 표적화된 나노 물질을 생산할 수 있다는 것입니다. 알루미늄 디스크를 외날 날과 작은 망치로 작은 조각으로 자르는 것으로 시작합니다. 자른 조각을 2밀리리터 튜브에 넣고 1몰 1몰 수산화나트륨 1밀리리터로 채우고 모든 알루미늄 조각이 덮여 있는지 확인합니다.

튜브를 화학 흄 후드에 넣어 실온에 30분 동안 그대로 두십시오. 배양 후 핀셋으로 알루미늄 조각을 제거하고 방출된 나노와이어를 수산화나트륨에 30분 더 보관합니다. 튜브를 마그네틱 드라이 랙에 넣고 2분 정도 기다린 후 용액을 새 수산화나트륨으로 교체합니다.

2 밀리리터 튜브를 나노 와이어로 30 초 동안 초음파 처리하고 화학 흄 후드 안에 1 시간 동안 그대로 두십시오. 이 단계를 네 번 이상 반복합니다. 완료되면 2 밀리리터 튜브를 마그네틱 랙에 넣고 수산화 나트륨을 버리고 1 밀리리터의 절대 에탄올로 교체합니다.

나노와이어를 30초 동안 초음파 처리하고 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 에탄올을 교체합니다. 에탄올 세척을 최소 4회 반복합니다. 나노 와이어를 세척 한 후 1 밀리리터 피펫을 사용하여 5 밀리리터 유리관에 옮깁니다.

100마이크로리터의 APTES를 나노와이어 용액에 넣고 유리관을 20초 동안 와류로 가열합니다. 튜브를 초음파 수조에 넣고 1 시간 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 수조에서 튜브를 꺼내 400 마이크로 리터의 탈 이온수와 20 마이크로 리터의 1 몰 수산화 나트륨을 추가합니다.

1시간 초음파 처리를 반복합니다. 초음파 수조에서 유리관을 꺼낸 후 자석 옆에 놓아 나노 와이어를 수집합니다. 상등액을 1ml의 새로운 앱솔루트 에탄올로 교체하고 튜브를 10초 동안 초음파 처리합니다.

에탄올 세척과 초음파 처리를 두 번 반복합니다. EDC 0.4mg, Sulfo-NHS 1.1mg, MES 1ml를 2ml 튜브에 녹입니다. 다른 2 밀리리터 튜브에 960 마이크로 리터의 0.1 몰 PBS를 추가하고 30 마이크로 리터의 항 CD44 항체를 추가합니다.

다음으로, 이전에 준비된 EDC/Sulfo-NHS 혼합물 10마이크로리터를 이 튜브에 추가합니다. 항체 튜브를 셰이커에 넣고 실온에서 15분 동안 10배 G로 흔듭니다. 한편, APTES 코팅된 나노와이어가 있는 튜브 옆에 자석을 2분 동안 놓고 에탄올을 버리고 PBS로 교체합니다.

나노와이어를 10초 동안 초음파 처리합니다. PBS로 마지막 세척 후 나노 와이어를 수집하고 활성화 된 항체 용액을 나노 와이어의 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 10초 동안 초음파 처리합니다.

밤새 섭씨 4도에서 회전기의 튜브를 교체하십시오. 다음날, 자석으로 나노 와이어를 모으고 상등액을 버립니다. 2%BSA 1ml를 첨가하고 섭씨 4도에서 1시간 동안 튜브를 배양하여 반응을 차단합니다.

전자 에너지 손실 분광법 또는 EELS 맵을 사용하여 나노와이어 표면의 실리콘 원자를 시각화하고 APTES 코팅의 존재를 확인할 수 있습니다. 코팅되지 않은 나노 와이어에서 철 원자는 진한 파란색으로 나타나고 철과 산소가 혼합 된 원자는 밝은 파란색입니다. 코팅되지 않은 나노 와이어의 해당 EELS 매핑은 표면보다 중앙에서 철 대 산소의 강도가 더 높다는 것을 보여 주며, 이는 철 - 철 산화물 구조를 나타냅니다.

매핑은 산화철 층이 산화철(III)보다 산화철(II, III)산화물로 더 많이 구성되어 있음을 보여주었습니다. 부착된 항체의 항원성은 면역침전(immunoprecipitation) 및 웨스턴 블롯(western blot) 분석을 사용하여 확인하였다. BCA 분석은 나노 와이어의 항체 수를 정량화하는 데 사용되었습니다.

표면 기능화를 설명하기 위해 제타 전위의 측정이 사용되었습니다. APTES의 말단 아민 그룹은 코팅되지 않은 나노 와이어에 비해 음전하를 줄였습니다. 항체 기능화는 전하를 더욱 줄였습니다.

항체 기능화된 나노와이어의 특이적 세포 표적화는 컨포칼 현미경을 사용하여 확인되었습니다. 그림 A와 B는 각각 표본 C와 D의 명시야 현미경 이미지를 나타냅니다. 빨간색은 세포막의 묘사에 해당하고, 파란색은 핵을 나타내며, 녹색 클러스터는 부착된 표적 CD44 나노와이어의 존재를 나타냅니다.

또한, 세포 생존율 분석을 사용하여 비코팅, APTES 코팅 및 항체 코팅 나노와이어가 생체 적합성을 확인했습니다. APTES 공정 코팅에서는 APTES 분자와 나노와이어 사이의 결합을 향상시키기 위해 수산화나트륨 용액 앞에 탈이온수를 첨가하는 것이 매우 중요합니다. 또한 생체 기능화 과정에서 항체와 나노와이어 사이의 공유 결합을 향상시키기 위해 PBS 완충액으로 나노와이어를 몇 번 세척해야 합니다.