Name: 에슈리치아 대장균에서 모토렐라 구동 운동성 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 배우세요 대장균에서 플래젤라 구동 운동성을 조사하는 다단계 프로토콜을 이용하여 개별 및 집단 운동성을 분석하는 방법을. 연구자들은 병원성 세균의 행동과 운동성 메커니즘을 이해하는 데 도움을 받을 수 있습니다.

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이 작품은 건강 보조금 GM118085의 국가 학회에 의해 지원되었고 부분적으로 로버트 웰치 재단 (R.M.H.에 F-1811을 부여)에 의해 지원되었습니다.

1. 운동성 결핍 균주에서 억제제 돌연변이의 격리
참고: 이 방법을 광범위한 '캐치-올'로 사용하여 운동성 결함의 일반적인 특성을 식별합니다.
<ol><li>소프트 마고 플레이트 준비 참고: 연골 또는 수영 용으로도 불리는 소프트 에이저는 화학 요법31,32를분석하는 데 오랫동안 사용되었던 낮은 비율의 한천(~0.2-0.35%w/v)입니다.<ol>
<li>바토-한천 3g(0.3% w/v)과 LB 20g을 2L 라운드 하단 플라스크에 넣습니다. 플라스크에 ddH2O(이중 증류수) L 1L을 넣고 교반봉과 자기 교반 플레이트를 사용하여 서스펜션을 균일하게 혼합합니다.</li>
		<li>121 °C에서 20 분 동안 오토 클레이브.</li>
		<li>위와 같이 막대/접시를 사용하여 부드러운 교반으로 식힙니다. 온도가 약 50°C에 도달하면 멸균 페트리 접시(100mm x 15mm)에 25mL을 붓고, 16시간 이내에 사용하기 위해 용융 된 한천을 뚜껑으로 1 시간 이상 제자리에 놓아 두도록 하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>억제제 돌연변이의 문화 준비, 접종 및 격리 참고: 부드러운 천으로 고화된 영양이 풍부한 매체의 중심에 접종된 대장균은 현지에서 영양소를 섭취하여 영양소그라데이션을 생성합니다. 그들은 바깥쪽으로 이동함에 따라, 정의된 '반지'가 나타나며(그림1A)는박테리아가 반응하는 특정 화학 요법과 관련이 있습니다. 치셀라 모터의 화학 요법 시스템 또는 구조 성분의 결함은 이 분석에서 성능을 저하시킬 수 있습니다. 종종, 운동성 이점을 가진 돌연변이는 스크리닝 중에 발생하며, 링 주변을 따라 단일 또는 여러 지점에서 나오는 것을 볼 수 있으며, 어디에서 '플레어'아웃(그림1C). 하나는 수영 전면의 가장 바깥쪽 가장자리가 식민지화되지 않은 처녀 부드러운 한천과 쉽게 대조되는 것을 알 수 있습니다.<ol>
<li>레녹스 브로스(LB; 10g/L 트라이프톤, 5g/L 효모 추출물, 5g/L, 재료테이블)의5mL에서 원하는 운동성 결핍 균주의 하룻밤 배양을 수평 흔들림(220 r.p.m)으로 성장시다. 다음 날, 신선한 LB의 하위 배양(1:100 희석)은 기하급수적 단계(OD600/0.6)와 같은 조건에서 성장한다.</li>
		<li>배양물의 6 μL을 파이펫을 사용하여 부드러운 천판(1.1)의 중심으로 접종하여 적재된 멸균 팁을 한천으로 밀어 넣고 내용물들을 부드럽게 추방합니다. 30°C로 이송하고 인큐베이션(도1B)으로옮겨가며, 운동성 '플레어'가 분명해질 때까지, 전형적으로 24-36h(도1C)에서접종지점 또는 운동성 고리의 주변에서 발산된다. 참고: 운동성 애서에서, 비교를 위해 돌연변이 분리와 함께 야생 형 변형을 접종하십시오. 이 야생형 균주는 특징적인 동심형 화학고리(도1A)를나타내고 8-10h 이내에 플레이트를 채웁니다.</li>
		<li>멸균 와이어 루프를 사용하여 '플레어' 영역에서 세포를 들어 올리고 줄무늬를 사용하여 단일 콜로니를 LB 하드 한천 플레이트에 정화합니다(위와 같이 준비된 LB, 15 g/L bacto-agar로 고화).</li>
		<li>멸균 와이어 루프를 사용하여 줄무늬 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 단일 콜로니를 줄이면 다시 정화하여 '순수한' 식민지 분리를 보장합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>억제제 돌연변이의 확인 및 특성화
	<ol>
<li>격리된 억제제 돌연변이가 운동성을 복원한지 확인합니다. 연한 천식판(1.1)과 관심있는 균주에 대한 문화(1.2.1)를 준비하여 야생형및 비교를 위한 시작 '운동성 결핍' 균주를 포함한다.</li>
		<li>플레이트(1.2.2에서와 같이)를 접종하고 8-10h에 대해 30°C에서 배양한다.</li>
		<li>가장 바깥쪽 링(원의 모서리)의 직경을 기록하고 어느 격리된 분리가 실질적으로 변성을 회복했는지 를 설정하는 것과 비교합니다. 참고: 실험 시간 과정 내내 플레이트를 촬영하는 것이 좋습니다. 최상의 결과를 얻으려면 디지털 카메라가 광원 위에 장착되어 수영 식민지의 직경을 측정하고 콜로니화되지 않은 천과 구별하는 "빛의 양동이"장치(30)를사용하십시오.</li>
		<li>피험자는 필요에 따라 WGS로 격리되어 야생 형 기능을 복원한 돌연변이를 긍정적으로 식별하기에 충분한 '서열 범위'를 허용합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 셀 테더링을 통한 플래그텔라 모터 거동 정량화
참고: 정상적인 텀블 동작(화학 요법)이 손상된 것처럼 보이는 경우 이 메서드를 사용합니다.
<ol><li>
문화 준비 및 플래그젤라 전단
	<ol>
<li>1.2.1 단계에서 설명된 바와 같이 관심있는 변형의 기하급수적 위상 배양을 준비한다.</li>
		<li>10mL의 필터 멸균 운동완충(MB)에서 재중단하기 전에 3분 동안 2,000 x g에서 원심분리에 의한 세포의 펠릿 10mL; 10mM 칼륨 인산염 버퍼 [0.0935 M K2HPO4,0.0065 M KH2PO4,pH 7.0], 0.1 mM EDTA [pH 7.0], 10mM NaCl, 75mM KCl). 참고 : MB는 운동성을지원하지만 세균 성장을 지원하지 않습니다</li>
		<li>MB의 1mL에서 최종 펠릿을 다시 중단하기 전에 2.1.2 단계를 두 번 더 반복하십시오.</li>
		<li>셀 서스펜션을 1mL 주사기로 옮기고 23G 바늘을 끝까지 부착한다. 동일한 주사기/바늘 장치를 조립하고 각 바늘 끝에 단단히 피포링 된 6 인치 폴리에틸렌 튜브 (내경 0.58mm)를 통해 두 가지를 함께 부착하십시오.</li>
		<li>10번의 패스마다 1분 동안 일시 정지하여 셀 서스펜션을 한 주사기에서 다른 50x로 부드럽게 전달하여 플래그젤라(쉽게 깨지기 쉽고 쉽게 파손)를 전단합니다.</li>
		<li>3 분 동안 2,000 x g에서 전경 세포를 원심 분리하고 MB의 500 μL의 최종 부피로 다시 중단합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
슬라이드 준비 및 셀 테더링
	<ol>
<li>3인치 x 1인치 x 1mm 유리 현미경 슬라이드 위에 18mm x 18mm 커버슬립을 적층하여 양면테이프(도면 S1)로분리하여 셀 고정 챔버를 준비합니다.</li>
		<li>챔버의 상단에 적용하여 0.01 % (w / v) 폴리 리신 용액으로 챔버를 플러시하십시오. 바닥 가장자리(현미경 슬라이드로 커버슬립 플러시)를 작업 와이퍼(tissue paper)에 기울여챔버(도 S1)를통해 용액을 끌어들이는 데 도움을 줍니다. 그런 다음 실온에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>2.2.2 단계에 설명된 대로 MB의 40 μL로 챔버를 세 번 세척</li>
		<li>시어드 셀 서스펜션(위 준비)의 40μL을 챔버 상단에 넣고 실온에서 10분 동안 배양하여 세포가 커버슬립에 부착할 수 있도록 합니다.</li>
		<li>2.2.3에서와 같이 MB의 40 μL로 챔버를 부드럽게 플러시하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
셀 회전 기록 및 정량화
	<ol>
<li>테더드 셀로 로드된 현미경 슬라이드를 현미경 단계로 옮는다.</li>
		<li>위상-대비 현미경 검사법과 100x 목표를 사용하여, 제자리에 고정된 셀의 인구를 스캔하고, 단일 축, 즉, 고정된 지점에서 매끄러운 회전을 하는 대신 초점이 안팎으로 이동하는 각도로 제시한다(비디오1).</li>
		<li>상업용 현미경 및 관련 카메라를 사용합니다. 관련 소프트웨어를 열고 관심 있는 셀이 포커스에 있는지 확인하고 비디오 수집을 클릭하여 1분 동안 셀 회전을 기록합니다(초당 10프레임 이상).</li>
		<li>비디오 재생에서 분당 전체 회전 수와 셀이 방향을 변경하는 횟수(스위칭 주파수)를 정량화합니다. 참고: 회전 속도 및 스위칭 주파수는 눈으로 측정하기에너무 빠를 수 있으므로 느리고 미세한 재생을 제공하는 비디오 소프트웨어를 사용하거나 회전패턴을정량화하기 위해 자동화된 소프트웨어 시스템을 채택하는 것이 좋습니다. 대안은 메틸 셀룰로오스 (또는 유사한 에이전트)를 사용하여 MB의 점도를 증가시켜 빠른 박테리아의 회전을 늦추고 해결하거나 프레임 레이트가 낮은 카메라가 사용중일 때 보상하는 것입니다.</li>
		<li>반복 단계 2.3.2 생물학적 복제와 관심의 인구의 표현을 컴파일합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 국경을 넘은 분석에서 떼 준비
참고: 돌연변이 또는 상태의 영향을 그룹 운동성에 평가하는 이 방법을 사용합니다. 군단-한천은 보통 연한 한천보다 비율이 높은 한천을 말합니다. 부드러운 한천(0.3%)에서 세포는 한천 내부에서 개별적으로 수영합니다. 무리 한천 (0.5% 이상)에서 세포는 표면에 그룹으로 이동합니다. 군단 플레이트는 여기에 상세한 대로 사용해야 하지만, 수영 플레이트는 유통 기한이 길어지며 며칠 동안 사용할 수 있습니다. 우리의 개인적인 취향은 1-2 일에 사용하는 것입니다.
<ol><li>
무리 의 천의 준비
	<ol>
<li>에이켄 한천 5g(0.5% w/v)과 LB 20g을 2L 라운드 하단 플라스크에 넣습니다. 플라스크에 ddH2O 1L을 넣고 교반봉과 자기 교반 플레이트를 사용하여 서스펜션을 균일하게 혼합합니다.</li>
		<li>121 °C에서 20 분 동안 오토 클레이브.</li>
		<li>위와 같이 막대/플레이트를 사용하여 기포를 피하기 위해 부드러운 교반으로 식힙니다. 약 50°C의 경우, 0.5%의 최종 농도를 위해 필터 멸균 포도당을 첨가한다.</li>
		<li>멸균 페트리 접시 (100mm x 15mm)에 25 mL을 붓고 적어도 14 시간 이상 20 시간 이하의 실온에서 설정할 수 있습니다. 나중에 사용할 수 있는 저장 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
떼 판의 접종 및 배양
	<ol>
<li>중기 기하 급수 문화의 6 μL (1.2에서와 같이 준비)은 한천 위에 발견하여 접종합니다.</li>
		<li>뚜껑을 5-10분 간 방치하고 접종이 천 표면으로 건조되면 교체하십시오.</li>
		<li>8 시간 동안 30 °C에서 배양하십시오. 이것은 천의 건조에 기여하고 무리를 손상으로, 뚜껑을 제거하여 무리 진행을 검사하는 유혹을 피하십시오. 참고: 인큐베이션 시간은 변형 표현형에 따라 달라질 수 있습니다. 몇몇 고립된 돌연변이는 떼어내고 있는 능력을 방해할 수 있고 한천의 감소된 백분율 또는 잠복의 더 긴 기간을 요구할 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
국경 횡단 분석 판의 준비 참고:이 분석은 플라스틱 분할(테두리)이하나(그림 2A)가아닌 두 개의 챔버를 생성하는 수정된 페트리 접시를 사용합니다. 각 챔버는 서로 독립적으로 준비할 수 있으며, 두 챔버를 '연결'하기 전에 서로 다른 조건을 제공합니다. 실험 설계에 따라, 제1 챔버(왼쪽 지정)는 박테리아가 국경을 넘어 강측으로 이동하여 포트 라고 +/- 필요한 보충제 또는 챌린지(예: 항생제)를 포함하는 오른쪽 챔버로 이동할 수 있는 수영 한천(0.3%w/v) 또는 군단 한천(0.5%w/v)으로 제조될 수 있습니다. 어느 한 천에 의이동은 일반적으로 접종의 원래 지점에서 세균 식민지 (가장자리에서 가장자리)의 가장 넓은 직경을 기록하여 측정 / 비교된다.<ol>
<li>필요한 경우 1.1에 설명된 대로 수영 한고를 준비하십시오.</li>
		<li>3.1에 설명된 대로 무리 한천을 준비한다.</li>
		<li>-30mL의 떼 한천(필요한 경우 원하는 보충제)을 이중 구획 페트리 접시(100mm x 15mm)의 오른쪽 챔버에 부어 챔버 사이의 플라스틱 분배기로 수평이 되지만 왼쪽으로 넘쳐나지는않습니다(그림 2B).</li>
		<li>한천이 경화된 후, 왼쪽 챔버를 ~30mL의 수영 또는 무리 한천으로 채우고, 플라스틱분할(도 2C)과의접촉 지점까지 다시 채우십시오. 설정하기 전에 멸균 파이펫 팁을 사용하여 원고를 테두리 위로 부드럽게 드래그하여 분할의 전체 길이에 걸쳐 있는 ~1mm 높이의 천교다리(도2D)와양면을 연결합니다.</li>
		<li>접시가 실온(3.1)에서 건조되도록 합니다. 참고: 다리를 만드는 다른 방법은 왼쪽 챔버 한가르가 건조한 다음 플라스틱 칸막이를 따라 용융 된 군단 천자의 100 μL을 천천히 피펫하여 두 챔버 (3.4)를 교개할 수 있도록 합니다. 수영 (1.2.2) 또는 군단 (3.2) 천에 대해 위에 상세한 바와 같이 왼쪽 챔버의 플레이트를 접종하고, 12-16 h에 대한 30 °C에서 배양하기 전에, 또는 무리가 관심있는 균주 사이의 비교를 허용하기 위해 오른쪽 챔버를 통해 충분한 진전을 이루었다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

억제제 돌연변이의 격리 및 특성화는화학기관시스템(35,36,37)의주요 성분을 식별하는 데 성공적으로 기여했으며, 모터기계자체(38,39,40)를확인하였다. 프로토콜 1을 사용하는 동안, 운동성의 손실을 보상 할 수있는 가능한 돌연변이의 큰 스펙트럼의 격리를 보장하기 위해 여러 독립적 인 복제를 포함하는 것이 중요합니다. 스팟이 아닌 선로로 배양을 줄임으로써 박테리아의 수를 늘리면,억제제(41)를생성할 확률을 향상시킬 수 있다. 동일한 돌연변이의 격리 (DNA 염기서열에 의해 결정된 대로) 여러 번 그 진위여부에 대한 자신감을 증가시킵니다. WGS는 항상 ...

박테리아는 그들의 생태 틈새 시장1에서운동과 분산을 위해 많은 부속물을 사용합니다. Flagella 구동 운동성은 이들 중 가장 빠르며, 환경 신호에 대응하여 유리한 로케일의 식민지화를 촉진하고, 일부 종의 병원성 능력에 크게 기여하고있다2,3. 표기 박테리아는 벌크 액체에서 개별적으로 수영할 수 있으며, 반고체 표면4를통해 집단으로 떼지어질 수 있다. 세포외 기색은 멤브레인에 내장된 회전 모터에 의해 구동되며, 이온 그라데이션의 힘을 이용하여 회전1,2,4,5,6,7,8을유발하는 토크를 생성한다. 모터가 일정한 토크9에서실행되는 대장균에서모터 출력은 시계 반대 방향(CCW)과 시계 방향(CW) 방향으로 회전 속도 및 회전기의 전환 측면에서 분류될 수 있습니다. CCW 회전은 셀을 앞으로 추진하는 일관된 플래그엘라 번들의 형성을 촉진(run), 회전 방향(CW)의 일시적인 스위치는 번들이 부분적으로 또는 완전히10을분해하고, 셀은 수영 방향(tumble)을 재조정하도록 합니다. 대장균은 일반적으로 1초 동안 실행되고 10분의 1초 동안 공중제비합니다. 로터 또는 '텀블 바이어스'의 스위칭 주파수는 화학물질 신호 시스템에 의해 제어되며, 여기서 막 이상 화학 수용체는 외부 화학 신호를 감지하고 인포릴레이를 통해 기광모터로 전송하여 유인제에 대한 응답으로 실행을 확장하거나, 독성화학물질(11,12)에대응하여 이를 억제한다. 수영 운동성은 0.3% 부드러운 화창으로 분석됩니다.
무리하는 동안 박테리아는 조밀한 집단으로 반고체 표면을 탐색하며, 박테리아 팩은 연속 소용돌이 동작2,13,14,15로흐를 수 있습니다. 대장균 떼는 화학감각 생리학(낮은 텀블 바이어스), 더 높은 속도, 대량 액체16,17에서수영하는 세포에 대한 항균제에 대한 높은 내성을 나타낸다. Swarmers는 계면 활성제 생산, 과대 깃발 및 세포 연신2를포함하여 운동을 돕는 과다한 전략의 배치에 따라 다릅니다. S워밍업은 생태학적 및임상 설정18,19,20모두에서 박테리아에게 경쟁 우위를 제공합니다. swarmbacteria의 두 가지 범주가 있다: 온대 swarms, 0.5-0.8% 한천으로 고화 된 미디어에만 떼수, 그리고 강력한 swarms, 높은 한천 농도 를 통해 탐색할 수 있는21.
다양한 소의가 수영 운동성과 그 규제를 심문하기 위해 존재합니다. 돌연변이 또는 환경 조건에 의해 손상될 때, 운동성 자체는 기능의 이득 억제기 돌연변이를 확인하기 위한 강한 선택을 제공합니다. 이러한 억제제는 두 번째 돌연변이가 기능을 복원하는 원래 돌연변이 또는 의사 복귀제의 정품 역구일 수 있다. 이러한 돌연변이는 전체 게놈 시퀀싱(WGS)에 의해 식별될 수 있다. 편견없는 억제제 선택에 대한 대안은 편향된 표적 돌연변이 발생 전략(예를 들어, PCR 돌연변이 발생)입니다. 이러한 방법론은 종종 운동성 장치의 기능 또는 환경 조절에 빛을 비추는다. 모터 기능을 연구하는 것이 목표라면, 부드러운 한천에서 측정된 야생형 운동성의 복원이 반드시 야생형 모터 출력의 복원을 나타내는 것은 아닐 수 있습니다. 세포 테더링 분석, 세포가 단일 깃발에 의해 유리 표면에 부착되고 세포 체체의 회전이 이후에 모니터링되는, 모터 거동을 평가하기위한 선택의 초기 분석이 될 수 있습니다. 이제 모터 특성을 모니터링할 수 있는 보다 정교한 방법론이 가능하지만 모션 분석을 위해 필요한 고속 카메라 설정 및 적용으로인해 22,23,24,25의광범위한 사용이 제한됩니다. 셀 테더링 분석법은 기색증을 분리하여 유리 슬라이드에 짧은 필라멘트의 부착을 허용한 다음 셀 바디의 회전을 비디오 녹화해야 합니다. 기록된 모터 속도는 셀 체가 깃음에 미치는 높은 부하 때문에 이 분석에서 낮지만, 그럼에도 불구하고 이 분석은 화학 반응26,27,28,29에대한 귀중한 통찰력에 기여했으며, 아래에서 설명한 바와 같이 유효한 조사 도구로 남아 있다.
모성도를 따뜻하게 하는 것은 연구자에게 다른 도전과제를 제기합니다. 기능의 이득 억제기의 선택은 풍부한 계면 활성제와 쉽게13을생산하는 swarms에서만 작동합니다. 대장균과 같은 계면활성제 비생산자는환경의한천, 미디어 구성 및 습도의 선택에 대하여 까다로운2,13,14,21. 번들 조건이 설정되면, 국경 횡단 분석17은 새로운 / 가혹한 조건을 탐색 하는 군단의 능력을 심문 하는 유용한 방법론. 아래에 제시된 프로토콜은 대장균과관련이 있지만 다른 종의 응용 프로그램에 쉽게 적응할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bacto Dehydrated Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Disodium Salt, Dihydrate</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td></td></tr><tr><td>Eiken 한천</td><td>Eiken Chemical Co. Japan</td><td>E-MJ00</td><td>E. coli swarming</td></tr><tr><td>Glucose D (+)</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>410955000</tr><tr><td>LB (Lennox) 육수</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-500</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 용액 (0.1%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 (KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-605-496</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성 (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 이염기성 (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>Materials and Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellSense microscope imaging software (V. 1.6)</td><td>Olympus</td><td></td><td>또는 이와 동등한 현미경 사용 소프트웨어</td></tr><tr><td>Electron Microscopy Sciences Scotch 666 Doube Sided Tape</td><td>Fisher</td><td>50-285-28</td><td></td></tr><tr><td>젖빛 현미경 슬라이드 3x1x1mm</td><td>Fisher</td><td>12-550-343</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX53 현미경</td><td>Olympus</td><td>BX53</td><td>모든 직립 또는 반전 위상 현미경을 사용할 수 있습니다</td></tr><tr><td>페트리 접시 (직경 100mm)Fisher</td> <td>Scientific</td><td>FB0875712</td><td>소프트 한천 분석</td></tr><tr><td>용 폴리에틸렌 분무기 모세관 튜브 (0.58mm x 99mm 3.0m)</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>9908265</tr><tr><td>라운드 페트리 접시 2</td>칸 <td>VWR</td><td>89200-944</td><td>국경 통과 분석용</td></tr><tr><td>안전 피하 주사 바늘 (23G)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-826A</td><td></td></tr><tr><td>멸균 주사기 - 1 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-450</td><td></td></tr><tr><td>작업/조직 물티</td>슈 <td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td>또는 이에 상응하는 일회용 티슈 물티슈</td></tr><tr><td>VWR 마이크로 커버 - 유리 18x18mm</td><td>VWR</td><td>48366205</td><td></td></tr><tr><td>XM10 카메라</td><td>올림푸스</td><td>XM10</td><td>또는 동급 현미경 카메라</td></tr></tbody></table>

에슈리치아 대장균에서 모토렐라 구동 운동성 조사

Investigating Flagella-Driven Motility in Escherichia coli by Applying Three Established Techniques in a Series

운동성은 많은 세균 종의 생존과 성공에 매우 중요합니다. 많은 방법론이 확산경로를 이해하고, 기조부품의 기능과 어셈블리를 해명하고, 움직임패턴을 조사하고 이해하기 위해 모틸성을 악용하기 위해 존재한다. 여기서 우리는 이러한 방법론의 세 가지 의 조합을 보여줍니다. 연한 한천의 운동성은 가장 오래된 것으로, 운동성 장애균의 기능 형 억제제 돌연변이를 격리하기 위한 강력한 선택을 제공하며, 여기서 운동성 조절은 두 번째 돌연변이를 통해 회복됩니다. 기체 모터의 회전 특성을 입증하기 위해 처음 채택된 셀 테더링 기술은 신호 이펙터가 모터 속도에 미치는 영향과 회전 방향을 전환하는 능력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. "국경 횡단"분석은 수영 박테리아가 무리로 집합적으로 이동으로 전환 할 준비가 될 수있는 최신입니다. 이 프로토콜은 함께 운동성 기계의 구성 요소를 식별하고 수영과 무리의 다양한 면에서 자신의 역할을 특성화하는 체계적이고 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 그(것)들은 그밖 세균성 종에 있는 운동성을 공부하기 위하여 쉽게 적응될 수 있습니다.

그 운동성 신호 분자 c-di-GMP의 높은 수준에 의해 손상되는 대장균 긴장에서 의사 복귀제의 격리는, 우리의 실험실에서 최근 작업에서 상세히 되었다34. 이 균주(JP1442)는 ΔyhjH 및 ΔycgR의두 가지 돌연변이를 수용하였다. YhjH는 대장균에서c-di-GMP를 저하시키는 가장 활동적인 인포디세타이소입니다. YhjH의 부재는 상승 된 c-di-GMP 수준과 운동성의 억제로 이어집니다. YcgR은 c-di-GMP 이펙터입니다. c-di-GMP가 있는 복합체에서 YcgR은 플래그젤라 로터에 결합하여 먼저 CCW 모터 회전을 유도하고 모터 속도를 감소시킵니다. 세포 테더링 및 구단 애약은 모터 행동이 이중 돌연변이체에서 정상으로 돌아왔지만 부드러운 한천의 운동성은34가아니라는 것을 보여주었습니다. 따라서 이중 돌연변이체(도 1C)에서 의사 재생성 플레어를 격리하기 위해 프...

많은 박테리아는 자신의 환경을 탐색하고 개별적으로 및 집단으로 모두 유리한 환경을 식민지화하기 위해 플래그텔라 구동 운동성을 사용합니다. 여기에 수영과 모성에 기여하는 구성 요소 / 경로를 식별하기 위해 선택 도구로 운동성을 활용하는 세 가지 확립 된 방법의 사용이 입증된다.

Motility is crucial to the survival and success of many bacterial species. Many methodologies exist to exploit motility to understand signaling pathways, ...

이 비디오에서 시연된 프로토콜은 전 세계 모든 실험실에서 재현할 수 있습니다. 이 둘은 결합되어 박테리아 편모 운동성을 특성화하는 체계적이고 강력한 접근 방식을 나타냅니다. 운동성은 박테리아 전파 및 생존의 중요한 측면이며, 이 세 가지 방법은 개인 및 집단 운동성을 분석하는 데 유용하고 강력한 도구입니다.여기에 설명된 기술은 자연에서 병원성으로 분류된 박테리아를 포함하여 다양한 박테리아를 연구하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다. 이 절차를 처음 시도할 때 스웜 플레이트를 잘못 준비하면 집단 움직임을 모방하지만 실제로 반영하지 않는 일관되지 않은 동작이나 패턴이 관찰될 수 있음을 명심하십시오. 수평 진탕으로 섭씨 30도의 Lennox 육수 5ml에서 원하는 운동성 결핍 균주의 하룻밤 배양을 성장시킨 다음 지수 단계와 동일한 조건에서 신선한 LB에서 하룻밤 동안 배양합니다.6마이크로리터의 배양액을 부드러운 한천 플레이트의 중앙에 접종하고 장전된 피펫 팁을 한천으로 밀어 내용물을 부드럽게 배출합니다. 접종 지점 또는 운동성 고리의 주변에서 발산되는 운동성 플레어가 분명해질 때까지 섭씨 30도에서 플레이트를 배양합니다. 멸균 와이어 루프를 사용하여 플레어 영역에서 세포를 들어 올리고 단일 콜로니를 정제하기 위해 LB 하드 한천 플레이트에 줄무늬를 만듭니다.분리된 억제 돌연변이가 운동성을 회복했는지 확인하려면 관심 균주에 대해 부드러운 한천 플레이트에서 배양합니다. 비교를 위해 wild-type과 starting motility deficient strain을 포함합니다. 섭씨 30도에서 8-10시간 동안 배양판을 배양한 후 가장 바깥쪽 고리의 직경을 기록하여 분리물 중 어느 것이 운동성을 실질적으로 회복했는지 확인합니다.관심 균주의 지수 상 배양을 준비합니다. 그런 다음 2000배 G에서 3분 동안 원심분리하여 10ml의 세포를 펠렛화하고 10mL의 필터 멸균 운동성 완충액(MB)에 재현탁합니다. MB에서 세포를 두 번 더 세척하고 최종 원심분리 후 1mL의 MB에 다시 현탁시킵니다. 세포 현탁액을 1ml 주사기로 옮기고 끝에 23 게이지 바늘을 부착합니다.동일한 주사기와 바늘 장치를 조립하고 각 바늘 끝에 단단히 덮인 6인치 폴리에틸렌 튜브를 통해 두 개를 함께 부착합니다. 세포 현탁액을 한 주사기에서 다른 주사기로 부드럽게 앞뒤로 50회 통과시켜 편모를 깎아내고, 10회 통과할 때마다 1분씩 멈춥니다. 그런 다음 전단된 세포를 2000배 G로 3분 동안 원심분리하고 500마이크로리터의 MB.To 에 다시 현탁시켜 세포 고정 챔버를 준비하고, 양면 테이프로 분리된 유리 현미경 슬라이드 위에 18 x 18mm 커버 슬립을 쌓습니다.챔버 상단에 0.01% 폴리리신 용액을 추가하여 세척합니다. 하단 가장자리를 작업용 와이프에 기울여 챔버를 통해 용액을 끌어낸 다음 10분 동안 실온에 둡니다. 40마이크로리터의 MB로 챔버를 세 번 세척하고 챔버 상단에 40마이크로리터의 전단 세포 현탁액을 추가합니다.세포가 커버 슬립에 부착되도록 10분 동안 기다린 다음 40마이크로리터의 MB로 챔버를 부드럽게 세척하여 연결되지 않은 세포를 제거합니다. 슬라이드를 현미경 스테이지로 옮기고 위상차 현미경과 100X 대물렌즈를 사용하여 제자리에 고정되어 단일 축에서 회전하는 세포를 스캔합니다. 현미경 소프트웨어를 열고 세포에 초점이 맞춰져 있는지 확인한 다음 1분 동안 세포 회전을 기록하기 위한 비디오 획득을 시작합니다.비디오 재생에서 분당 완전한 회전 횟수와 셀의 방향 변경 횟수를 정량화합니다. 6마이크로리터의 중간 기하급수적 배양균을 한천 위에서 발견하여 접종합니다. 뚜껑을 5-10분 동안 열어 두었다가 접종물이 한천 표면으로 건조되면 다시 닫습니다.그런 다음 섭씨 30도에서 8시간 동안 플레이트를 배양합니다. 약 30ml의 떼 한천을 이중 구획 페트리 접시의 오른쪽 챔버에 붓고 챔버 사이의 플라스틱 칸막이와 수평이 되되 왼쪽으로 넘치지 않도록 합니다. 한천이 굳은 후 왼쪽 챔버를 약 30 밀리리터의 수영 또는 떼 한천으로 채 웁니다.굳기 전에 멸균 피펫 팁을 사용하여 한천을 테두리 너머로 부드럽게 밀어 넣고 양쪽을 전체 분수령에 걸쳐 있는 1mm 높이의 한천 다리로 연결합니다. 접시를 실온에서 건조시키십시오. 한천을 부을 때 깊이에 주의하십시오.너무 높으면 넘칩니다. 너무 낮으면 두 챔버를 연결할 수 없습니다. 이 프로토콜은 운동성이 손상된 이중 돌연변이 E.coli 균주에서 pseudo revertant flares를 분리하는 데 사용되었습니다.이러한 회귀 물질 중 하나는 야생형에 가까운 운동성을 나타냈습니다. 이중 돌연변이 부모와 동종 야생형 균주를 대조군으로 사용했습니다. 비디오 캡처를 분석하여 분당 회전수와 모터가 시계 방향으로 회전하는 시간의 비율 또는 텀블 바이어스를 계산했습니다.yhjH 돌연변이는 예상대로 야생형 대장균에 비해 분당 몇 번의 회전과 더 낮은 텀블 바이어스를 보여주었습니다. 이중 돌연변이와 억제기 모두 야생형과 유사한 운동 행동을 보였다. 국경 횡단 분석법은 야생형과 억제기의 능력을 비교하여 떼를 지은 다음 국경을 넘어 이동하여 카나마이신이 보충된 한천에 떼를 짓는 데 사용되었습니다.두 균주 모두 동일한 접종 지점에서 비슷한 무리 비율을 보였지만, 항생제 챔버로의 무리 교차는 억제기보다 야생형에서 일관되게 더 컸습니다. 두 균주의 차이는 더 높은 카나마이신 농도에서 더 두드러졌습니다. 스웜 분석은 설정이 까다로울 수 있습니다.관심 박테리아에 맞게 드로잉 조건을 최적화하는 데 시간을 할애해야 할 수도 있으며, 배지를 준비하는 동안 실험실 조건도 고려해야 할 수 있습니다. 이 프로토콜의 기술은 편모 박테리아의 배열에 적용되었으며, 검증되지 않은 수많은 종에 적용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 chemoeffectors의 안정적인 농도 기울기에 박테리아 chemotaxis 조사를위한 microfluidic 장치의 개발을 설명합니다.

안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

출처: Morales-Soto, N. et. al., 박테리아 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 연질 한천의 표면 운동성을 관찰하기 위해 녹색 형광 단백질을 발현하는 박테리아를 사용하는 군집 분석을 보여줍니다. 타임랩스 이미징은 조정된 팽창과 덩굴손 형성을 포착하여 박테리아 표면 운동성을 강조합니다.

박테리아 표면 운동성을 시각화하기 위한 군집 분석

출처: Pioli, R., et al., 순차적 모세관 보조 조립을 통한 미생물 및 미립자의 패턴화. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 무탄소 현탁액 및 제어된 흐름을 사용하여 미세유체 트랩에서 단일 형광 태그가 지정된 대장균(E. coli) 세포를 캡처한 다음 영양분을 첨가하여 미세 콜로니의 성장 및 형광 이미징을 유발하는 방법을 보여줍니다.

단일 세포 박테리아 성장의 미세유체 패터닝 및 형광 기반 추적

출처: Scheidweiler, D. 외. 유체 장치와 현미경 및 유동 세포분석을 결합하여 공간적 규모를 넘어 다공성 배지 내 미생물 수송을 연구합니다. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 무작위로 배열된 기둥들로 구성된 다공성 매트릭스를 통해 박테리아의 운동성을 정량화하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 형광 표지된 박테리아를 장치에 투입하고, 다공성 매트릭스를 통과해 관찰 채널로 이동하는 동안 현미경으로 영상화한 후 분석하여 돌파 곡선(BTC)을 생성합니다.

마이크로플루이딕 장치를 이용한 박테리아 운동성 평가

군집 운동성은 물리적, 환경적 요인의 영향을 받습니다. 우리는 군집 분석 준비 및 데이터 수집과 일반적으로 관련된 문제를 우회하기 위한 2단계 프로토콜과 지침을 설명합니다. 현재의 분석 기술로는 제공되지 않는 떼 행동에 대한 자세한 정보를 얻기 위해 거시적 이미징 기술이 사용됩니다.

세균 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화

최근의 연구 결과에 따르면 박테리아 편모 모터는 다양한 환경 신호를 감지하고 이에 반응하여 리모델링을 합니다. 여기에서 논의된 비드 분석은 환경 스트레스 요인에 대한 세포 적응에서 리모델링의 역할을 설명하는 데 도움이 될 것으로 예상됩니다.

편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성

세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

이 연구는 합성 유전자 회로의 스토카시 거동을 분석하고 정량화하기 위해 대장균의 단일 세포의 라이브 이미징을 허용하는 현미경 방법을 제시합니다.

시간 경과 현미경 검사를 사용하여 대장균에서 생물학적 소음의 지속적인 측정

여기에서, 우리는 글리코실트랜스퍼라제를 함유하는 특정 글리코실트랜스퍼라제 또는 영역에서 에어로모나 스의 널 돌연변이체의 구축, 글리칸의 생합성에서 그들의 암호화된 효소의 관여 및 기능을 확립하기 위해 수행된 운동성 분석, 및 편모 정제, 뿐만 아니라 박테리아 병인에서 이러한 글리칸의 역할을 기술한다.

박테리아 운동성에서 박테리아 글리코실트랜스퍼라제의 역할을 밝히기 위한 Null 돌연변이체의 생성

여기에서는 색상 반응을 기반으로 박테리아 운동성을 감지하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 주요 장점은 평가하기 쉽고 정확하며 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다.

색상 반응을 기반으로 한 박테리아 운동성 시각화

이 프로토콜은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 다양한 유형의 운동성과 관련된 유전적 요인을 식별하기 위한 빠르고 효율적인 방법을 제시합니다.

녹농균(Pseudomonas aeruginosa)에서 운동성 표현형을 관찰하기 위한 고처리량 방법

배우세요 대장균에서 플래젤라 구동 운동성을 조사하는 다단계 프로토콜을 이용하여 개별 및 집단 운동성을 분석하는 방법을. 연구자들은 병원성 세균의 행동과 운동성 메커니즘을 이해하는 데 도움을 받을 수 있습니다.

에슈리치아 대장균에서 모토렐라 구동 운동성 조사

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