Name: 클라미디아 트라코마티스에서 발달 돌연변이를 식별하고 격리하는 살아있는 세포 앞으로 유전 적 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 배우세요 형광 프로모터 리포터와 실시간 현미경을 활용한 Chlamydia trachomatis 발달 돌연변이 격리 방법입니다. 이 기술은 발달 주기를 조절하는 유전자를 식별하여 치료 전략 개선에 기여합니다.

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우리는 CIP-1 도끼 미디어를 공급 워싱턴 주립 대학의 앤더스 옴슬랜드 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 NIH 보조금 R01AI130072, R21AI135691 및 R21AI13617에 의해 지원되었다. 추가 지원은 아이다호 대학과 NIH 보조금 P20GM104420을 통해 복잡한 상호 작용을 모델링하기위한 센터에서 시작 기금에 의해 제공되었다.

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<li>Clifton, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chlamydial+type+III+translocated+protein+is+tyrosine-phosphorylated+at+the+site+of+entry+and+associated+with+recruitment+of+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A chlamydial type III translocated protein is tyrosine-phosphorylated at the site of entry and associated with recruitment of actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (27), 10166-10171 (2004).</li>
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<li>Grieshaber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Active+Metabolism+on+Elementary+Body+Transcript+Profile+and+Infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Impact of Active Metabolism on Elementary Body Transcript Profile and Infectivity.</a> Journal of Bacteriology. 200 (14), 00065(2018).</li>
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<li>Mueller, K., Wolf, K., Fields, K., Maurelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Deletion+by+Fluorescence-Reported+Allelic+Exchange+Mutagenesis+in+Chlamydia+trachomatis%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Gene Deletion by Fluorescence-Reported Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis.</a> MBio. 7 (1), 01817(2016).</li>
<li>Rosario, C. J., Tan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+gene+product+EUO+is+a+transcriptional+repressor+that+selectively+regulates+promoters+of+Chlamydia+late+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The early gene product EUO is a transcriptional repressor that selectively regulates promoters of Chlamydia late genes.</a> Mol Microbiol. 84 (6), 1097-1107 (2012).</li>
<li>Brickman, T., Barry, C., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+and+expression+of+hctB+encoding+a+strain-variant+chlamydial+histone-like+protein+with+DNA-binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning and expression of hctB encoding a strain-variant chlamydial histone-like protein with DNA-binding activity.</a> Journal of Bacteriology. 175 (14), 4274-4281 (1993).</li>
<li>Omsland, A., Sager, J., Nair, V., Sturdevant, D., Hackstadt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+metabolic+and+transcriptional+activity+of+Chlamydia+trachomatis+in+an+axenic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific metabolic and transcriptional activity of Chlamydia trachomatis in an axenic medium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 109 (48), 19781-19785 (2012).</li>
<li>Su, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombinant+Chlamydia+trachomatis+major+outer+membrane+protein+binds+to+heparan+sulfate+receptors+on+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A recombinant Chlamydia trachomatis major outer membrane protein binds to heparan sulfate receptors on epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 93 (20), 11143-11148 (1996).</li>
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<li>Tinevez, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TrackMate%3A+An+open+and+extensible+platform+for+single-particle+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.</a> Methods. 115, 80-90 (2017).</li>
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<li>Ferguson, L., Denny, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+mutagenesis+by+acridines+and+other+reversibly+binding+DNA+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Mutagenesis%22%5BJournal%5D)">Frameshift mutagenesis by acridines and other reversibly binding DNA ligands.</a> Mutagenesis. 5 (6), 529-540 (1990).</li>
</ol>

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클라미온 발달 주기를 제어하는 메커니즘을 해부하는 것은 현재 사용 가능한 유전 도구의 한계에 의해 방해되었습니다. 우리의 프로모터 기자 클라미디아를 사용하여 살아있는 세포 자동화 현미경 검사법과 함께, 24 시간 동안 개별 포함에 세포 형 발달의 모니터링을 가능하게 하는 시스템이 만들어졌습니다. 이러한 시스템은 화학돌연변이발생 및 직접 포괄 분리와 함께 변경된 발달프로파일(그림 5)을발현하는 클라미디아를 신속하고 복제하여 선택하는 방법을 확립하였다.
클라미얼 EB는 세포 내 이온 조건 및 에너지 원5,,12를제공할 때 호스트 외부에서 대사적으로 활성화된다. 이 EB 축균 물질 대사는 숙주 세포 밖에서 정제 된 EB를 돌연변이시키는 데 활용되었습니다. 이 프로토콜에서, EB를 대사하는 것은 E...

클라미디아 트라코마티스(Ctr)는 생존과 증식1에필수적인 이중협발달주기를 통해 진행되는 의무적인 세포내 병원체이다. 이 주기는 두 가지 발달 형태, 초등체 (EB) 및 망상 체체 (RB)로 구성됩니다. EB는 복제 무능하지만 이펙터 유도 내분비증2를통해 세포 침입을 중재한다. 호스트에 도착하면 EB는 복제 RB로 성숙합니다. RB는 후속 감염 라운드를 시작하기 위해 EB로 다시 변환하기 전에 여러 복제를 수행합니다.
유전 공구의 제한된 배열은 생화학 연구 또는 대리 시스템의 사용에 클라미다이얼 연구의 대부분을 제한했습니다. 그 결과, 유전자 조절및 발달주기의 제어의 해명성은3,,4. 클라미얼 필드에서 더 중요한 도전 의 한은 클라미온 발달 주기의 고해상도 측량 추적 및 그것의 규칙에 관련된 단백질의 식별입니다. 클라미온 발달 주기 동안 유전자 발현은 전통적으로 RNAeq, qPCR 및 고정 세포 현미경 검사법을 포함하는 파괴적인 "종점" 방법에 의해 수행되어 왔다5,,6. 이러한 방법은 귀중한 정보를 제공했지만, 사용되는 기술은 힘들고 낮은 시간적 해상도5,,6을가지고 있다.
지난 10년 동안 Ctr의 유전자 조작은 플라스미드 변환 및 돌연변이 발생에 대한 방법의 도입으로 진행되었습니다77,8,,9. 이 연구를 위해, 플라스미드 기반 시스템은 감염의 과정을 통해 실시간으로 개별 포함에 있는 클라미다이얼 발달을 감시하기 위하여 개발되었습니다. RB 및 EB 세포 형 특정 프로모터 리포터를 모두 표현한 클라미타임 트랜스포메이션이 만들어졌습니다. RB 특이기자는 형광 단백질 클로버의 초기 RB 유전자 유오 상류의 프로모터를 융합시킴으로써 구성되었다. EUO는 후기 EB 관련 유전자10의하위 집합을 억압하는 전사 레귤레이터입니다. EB 핵응축에 관여하는 히스톤과 같은 단백질을 인코딩하는 hctB의발기인은 EB특이기자(11)를만들기 위해 mKate2(RFP)의 상류로 직접 복제되었다. hctB무도m-mKate2/euoeuo무도회-클로버의 백본은 p2TK2SW27이었다. hctB및 euo 프로모터는 Ctr-L2 게놈 DNA로부터 증폭되었다. 각 프로모터 서열은 지정된 클라미다이얼 유전자에 대한 예측된 전사 시작 부위의 상류 ~100개의 염기 쌍과 각각의 ORF의 첫 30뉴클레오티드(10개의 아미노산)로 구성되었다. 형광 FP 변이체는 Ctr codon최적화 유전자 블록으로 상업적으로 얻어지고 각 클라미원 유전자 및 프로모터의 처음 30뉴클레오티드와 함께 프레임에서 복제되었다. incD 종기는 mKate2의 바로 하류로 복제되었습니다. 두 번째 프로모터 리포터는 incD 종기의 하류에 삽입되었습니다. p2TK2SW2의 암피실린 내성유전자(bla)는pBam4로부터 aadA 유전자(Spectinomycin 저항)로 대체되었다. 이로 인해 Ctr-L27로변형된 최종 구조 p2TK2-hctB 무도회-mKate2/euo 무도회-클로버(그림1A)가그 결과.hctBeuo 이러한 RB/EB 리포터 균주는 살아있는 세포 현미경검사(도1B, C)를사용하여 단일 내의 발달 주기의 관찰을 허용했다.
화학 돌연변이 발생과 함께 우리의 발기인 기자 구조를 채택, 프로토콜추적하고 Ctr 세로바르 L2의 돌연변이 인구에서 개발 이상을 나타내는 개별 클론을 분리하기 위해 고안되었다. 이 프로토콜은 개별 클라미다이얼 포함의 직접적인 감시를 허용하고, 시간이 지남에 따라 유전자 발현 프로파일의 추적, 변경된 발달 유전자 발현 패턴을 표현하는 클라미얼 클론을 식별하고, 개별 적인 포함에서 클라미디아의 클로나 절연을 확인합니다.
이 프로토콜은 클라미원 발달에 관여하는 유전자의 확인을 위해 특별히 만들어졌지만, 클라미온 유전 경로의 수를 심문하기 위해 쉽게 적응될 수 있었습니다.

<table><tbody><tr><td>24웰 폴리스티렌 플레이트</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>분리물의 재감염을 위한 세포 배양 성장</td></tr><tr><td>6웰 유리 바닥 플레이트</td><td>Cellvis</td><td>P06-1.5H-N</td><td>이미징을 위한 세포 배양 성장</td></tr><tr><td>96웰 유리 바닥 플레이트</td><td>Nunc</td><td>165305</td><td>이미징을 위한 세포 배양 성장</td></tr><tr><td>볼드 라인 CO2 유닛</td><td>OKO Labs</td><td>CO2 UNIT BL</td><td>스테이지 인큐베이터 CO2 제어</td></tr><tr><td>Bold line T Unit</td><td>OKO Labs</td><td>H301-T-UNIT-BL-PLUS</td><td>스테이지 인큐베이터 온도 제어</td></tr><tr><td>붕규산 유리 모세관</td><td>Sutter Instrument</td><td>B1005010</td><td>모세관</td></tr><tr><td>BrightLine 대역통과 방출 필터(514/30nm)</td><td>Semrock</td><td>FF01-514/30-25</td><td>형광 필터 큐브</td></tr><tr><td>BrightLine 대역통과 방출 필터(641/75nm)</td><td>Semrock</td><td>FF02-641/ 75-25</td><td>형광 필터 큐브</td></tr>, <tr><td>CellTram Vario</td>, <td>Eppendorf</td><td>5196000030</td><td>Microinjector</td></tr>, <tr><td>Chlamydia trachmatis, serovar, L2</td>, <td>ATCC</td><td>, VR-577</td>, <td>Chlamydia trachomatis</td></tr><tr><td>, CIP-1 media</td>, <td>In house</td>, <td>NA</td>, <td>Axenic media. IPB는 1% FBS, 25 &mu로 보충되었습니다. M 아미노산, 0.5 mM G6P, 1.0 mM ATP, 0.5 mM DTT 및 50 &mu; M GTP, UTP 및 CTP. (Omsland, A. 2012) 사내에서 제작.</td></tr><tr><td>Cos-7 세포 (ATCC)</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td>아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (숙주 세포)</td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>MP Biomedicals</td><td>194527</td><td>숙주 세포 성장 억제제</td></tr><tr><td>에틸 메탄 설포 네이트, 99 %</td> <td>Acros 유기물</td><td>AC205260100</td> 돌<td>연변이</td></tr><tr><td>유발 태아 플렉스</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-602</td><td>기본 성장 매체 보충</td></tr><tr><td>자료 피지/ImageJ</td><td>https://imagej.net/Fiji</td><td>NA</td><td>Open Sourse 이미지 분석 소프트웨어. https://imagej.net/Fiji</td></tr><tr><td>Galaxy 170 S CO2 incubator</td><td>Eppendorf</td><td>CO1700100X</td><td>Cell culture incubation</td></tr><tr><td>gblocks (형광 FP 변형체: Clover 및 mKate2)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>NA</td> gblock P2TK2SW2 Gentamycin 10mg/ml Gibco<td>로 클로닝하기 위한 Ctr 최적화 FP 변이의 ORF</td></tr><tr><td></td><td></td><td>15710-064</td><td>성장 배지용 항생제</td></tr><tr><td>HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)</td><td>Corning</td><td>21-020-CM</td><td>숙주 세포 린스</td></tr><tr><td>헤파린 나트륨</td><td>Amersham Life Science</td><td>16920</td>은 <td>숙주 세포와 EB</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30237.01</td><td>성장 배지용 pH 완충액</td></tr><tr><td>InjectMan</td><td>Eppendorf</td><td>5179 000.018</td><td>Micromanipulator</td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td>https://jupyter.org/</td><td>NA</td><td>포함 추적 시각화.https://jupyter.org/</td></tr> <tr><td>Lambda 10-3</td><td>셔터 기기</td><td>LB10-3</td><td>필터 휠 컨트롤러</td></tr><tr><td>Oko Touch</td><td>OKO Labs</td><td>Oko Touch</td><td>Interface 볼드 라인 T 및 CO2 장치 제어를 위한</td></tr> 이전 <tr><td>XY 단계</td><td>이전</td><td>H107</td><td>전동 XY 현미경 스테이지</td></tr><tr><td>PrismR 원심분리기</td><td>Labnet</td><td>C2500-R</td><td>온도 제어 마이크로 원심분리기</td></tr><tr><td>프로블로 혼성화 오븐</td><td>Labnet</td><td>H1200A</td><td>락킹 인큐베이터 클라미디아</td></tr><tr><td>감염 Proscan II</td><td>이전</td><td>H30V4</td><td>XYZ 현미경 스테이지 컨트롤러</td></tr><tr><td>정수기 클래스 2 생물 안전 캐비닛</td><td>Labconco</td><td>362804</td><td>세포 배양 작업</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (페놀 레드 없음)</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td>이미징용 기본 성장 배지</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (페놀 레드)</td><td>GE Life Sciences</td><td>SH30027.01</td><td>기본 성장 매체</td></tr><tr><td>스코프LED 여기 LED (470nm,595nm)</td><td>스코프LED</td><td>F140</td><td>여기 광</td></tr><tr><td>음파 분석기 모델 500</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-338-550</td><td>초음파 처리기, 재현 탁제 클라미디아 펠렛</td></tr><tr><td>스테이지 인큐베이터</td><td>OKO Labs</td><td>H301-K-FRAME</td><td>클러스터 웰 플레이트 배양 챔버</td></tr><tr><td>자당-인산염-글루타메이트 완충액 1X (SPG)</td><td>사내</td><td>NA</td><td>클라미디아 저장 완충액. (10mM 인산나트륨[8mM K 2HPO 4, 2mM KH 2PO 4], 220mM 자당, 0.50mM L-글루탐산, pH 7.4)</td></tr><tr><td>T-75 플라스크</td><td>Thermo Scientific</td><td>156499</td><td>세포 배양 성장</td></tr><tr><td>TE 300 도립 현미경</td><td>Nikon</td><td>16724</td><td>현미경</td></tr><tr><td>THOR LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDD1B</td><td>백색광</td></tr><tr><td>트립신</td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td>플레이트에 파종하기 위해 플라스크에서 숙주 세포 제거</td></tr><tr><td>Zyla sCMOS</td><td>Andor</td><td>ZYLA-5.5-USB3</td><td>이미징 카메라</td></tr><tr><td>&마이크로; Manager 2.0gamma</td><td>https://github.com/micro-manager/micro-manager</td><td>NA</td><td>Open 소스 자동 현미경 제어 소프트웨어 패키지</td></tr></tbody></table>

클라미디아 트라코마티스에서 발달 돌연변이를 식별하고 격리하는 살아있는 세포 앞으로 유전 적 접근

Live-Cell Forward Genetic Approach to Identify and Isolate Developmental Mutants in Chlamydia trachomatis

세포 내 세균성 병원체 클라미디아 트라코마티스는 두 가지 형태학적으로 이산적 발달 형태로 구성된 발달 주기를 겪는다. 비 복제 초등체 (EB)는 호스트의 감염을 시작합니다. 일단 내부에, EB는 망상 몸으로 분화 (RB). 그런 다음 RB는 전염성 EB 양식으로 다시 분화하기 전에 여러 차례의 복제를 수행합니다. 이 주기는 세포 모형 사이를 전환하는 실패가 호스트 침입 또는 복제를 방지하기 때문에 클라미홈 생존을 위해 필수적입니다.
클라미디아의 의무적인 세포 내 특성으로 인한 유전 적 기술의 한계는 세포 형 발달에 관여하는 분자 메커니즘의 식별을 방해했습니다. 우리는 살아있는 세포 현미경 검사법과 함께, 실시간으로 세포 형 전환의 시각화를 허용하는 새로운 이중 프로모터 기자 플라스미드 시스템을 설계했습니다. 세포형 발달의 조절에 관여하는 유전자를 확인하기 위해, 살아있는 세포 프로모터-리포터 시스템은 이중 리포터 균주의 화학돌연변이발생, 클라미디아의 화상 진찰 및 추적을 변경된 발달 운동과 결합하여 돌연변이체의 클로나 탈린을 결합하여 전진 유전적 접근법의 발달을 위해 활용되었다. 이 전진 유전 워크플로우는 광범위한 유전 적 경로로 지시 된 심문을 위해 수정 할 수있는 유연한 도구입니다.

우리의 프로모터 기자 클라미다이얼 균주의 직접 EMS 돌연변이 발생은 감염도에 있는 ~75% 감소귀착되었습니다. 설명된 살아있는 세포 이미징 프로토콜을 사용하여 ~ 600개의 포함이 24시간 동안 이미지화되고 추적되었다. 각 포함에서 두 기자의 형광식 역학은 사용자 정의 파이썬 노트북 스크립트를 사용하여 시각화되었습니다. 격리를 위해 후보 돌연변이 클라미디아를 식별하기 위해 두 가지 시각화 접근 법이 구현되었습니다. 제1 방법론(step 3.3.8)은 대화형 산란 플롯(그림2)에서분리된 개별 클라미톨리텍으로부터 의 한발최대발현을 시각화한다. hctB 모의 처리된 분산 구름 밖에 떨어졌을 때 포함물이 격리된 것으로 확인되었습니다. 후보 클론은 시각적으로 제어 클라우드 의 외부에 떨어졌다 선택되었다. 각 클론에 대한 확인은 이후에 수행되었다. 클론 A3-6-67 및 B3-8-58은 유오 프로모터로부터 반 최대발현까지...

이 프로토콜은 클라미디아 트라코마티스의발달 돌연변이를 식별하고 격리하기 위해 방향유전 적 접근법에서 형광 프로모터 기자, 살아있는 세포 현미경 검사법 및 개별 포괄 추출을 활용합니다.

The intracellular bacterial pathogen Chlamydia trachomatis undergoes a developmental cycle consisting of two morphologically discrete developmental forms. ...

이 프로토콜은 변경된 발달 단면도를 가진 Chlamydia의 생성 그리고 격리를 위한 유일한 공구를, 궁극적으로 발달 주기를 통제하는 유전자의 확인을 허용합니다. 이 방법의 주요 장점은 클라미디아 세포 유형 개발을 실시간으로 추적하는 능력과 클라미디아를 분리하는 능력입니다. 클라미디아 트라코마티스 리포터를 돌연변이시키기 위해, 제7초등학교에 약 3배 10번을 함유한 클라미얼 스톡을 보았다.관심과 펠릿의 기자 플라즈마로 변환, 생각은 센트로 푸징에 의해 재고된다. 10초 동안 10%의 전력으로 초음파 처리를 사용하여 100마이크로리터의 초등체를 재보습하고 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관 사이에서 1.5밀리리터 마이크로 원심분리관 사이에서 1.5밀리리터 마이크로 원심분리튜브 사이에 1.5밀리리터 마이크로 원심분리튜브를 균등하게 분할한다. 새로 준비된 EMS 대사 용액 50마이크로리터를 클라미디아 알리쿼트에 넣고, 50마이크로리터의 암시대사 버퍼를 클라미온 알리쿼트에 첨가하여 주 돌연변이 발생을 위해서만 클라미온 알리쿼트에 넣고 실온에서 20분 동안 두 샘플을 배양합니다.EMS는 처리 중에 알려진 발암 물질 마모 장갑으로, 모든 EMS 오염 된 장비 및 매체를 폐기 하기 전에 24 시간 동안 하나의 어금니 나트륨 수산화물에 담급니다. 도매 문화를 설정하려면, 절단 된 클라미디아 trachometer의 이미징 및 격리를 위해. 6 개의 잘 유리 바닥 플레이트, 6 번 10 에서 다섯 번째 비용 7 세포, 잘 당 완전한 배지의 두 밀리리터와 씨앗 24 잘 폴리스티렌 플레이트 와 10 에 다섯 번째는 잘 당 완전한 매체의 하나의 밀리리터에 일곱 세포를 발생.숙주 세포 배양을 돌연변이된 클라미디아 트라코마티스 감염거부로 감염시키기 위해, 유리 바닥판 5개 웰을 약 6배에서 5분의 1로, 돌연변이된 초등학교 체의 감염시켰다. 잘 당 얼음 차가운 HBSS의 1.5 밀리리터에서. 나머지 우물을 감염시키고, 5분의 모의 돌연변이 초등학교 10개에 1.5밀리리터의 얼음냉이 HBSS를 잘 감염시키고, 37°C에서 15분 동안 잠복한 후, 감염된 세포를 37°C의 섭씨로 씻어 내고, 감염된 세포를 헤파린의 밀리그램 당 1밀리그램으로 보충한 후, 즉시 HBS에 의해 뒤따랐다.헤파린으로 세포를 다시 씻고, 모든 헤파린을 제거하기 위해 HBSS만으로 두 개의 헹구기를 즉시 씻어 내십시오. 마지막 세척 후, 각 우물에 섭씨 37도 이미징 매체의 4 밀리리터를 추가합니다. 그리고 37섭씨 산화물로 우물 간 공간을 채운 다음 10시간 동안 세포 배양 배양 인큐베이터에 판을 놓습니다.인큐베이션의 끝에서 현미경 단계 인큐베이터는 이산화탄소 5 % 및 섭씨 37도로 설정합니다. 그리고 여섯 개의 잘 유리 바닥 판을 무대 인큐베이터에 넣습니다. 이미징 소프트웨어에서, 고함량 스크리닝 플러그인을 사용하여 6개의 웰 플레이트 템플릿을 선택하고, 자동 초점 옵션을 잘 사용하여 자동 초점 옵션을 사용하여 자동 이미징에 초점을 맞추고 GFB 채널의 4%강도와 RFP 채널의 밀도18%로 노출을 설정합니다.따라서 30분 간격으로 24시간 동안 이미징 주기에서 개발 주기의 역학을 캡처하고 InFocus 슬라이스의 양쪽에서 끝나는 초점 범위가 있는 여러 Z 스택을 포함하도록 이미지 캡처를 설정한 다음 이미징을 위한 상대 Z, 수집 창에서 여러 조각을 선택하고 이미지 스택 파일 옵션을 사용합니다. TIFF 스택 파일로 저장할 이미지를 설정합니다. 개발 프로파일변경과 함께 포함 트랙을 식별하려면 EMS 화면의 가져오기 셀인 마크다운 파이썬 노트북을 사용하여 트랙 통계의 스팟에서 포함된 트랙 데이터를 가져오려면 CSV 파일을 팬더의 데이터 프레임으로 가져옵니다.계산 셀을 사용하여 각 트랙의 초기 및 후반 기자 모두에 대한 최대 식을 갖는 시간을 계산하고 하프 최대 플롯 셀에서 보케 플로팅 패키지를 사용하여 hctB 무도회에 대해 절반 최대 식으로 시간을 시각화합니다. 보케 인터랙티브 트랙 ID 탐색기를 사용하여 모의 처리 된 분산 구름 외부에 있는 돌연변이 모집단의 포함을 식별합니다. 프로모터 발현 운동제의 변화를 동적으로 시각화하기 위해 애니메이션 된 혈액 세포 그래프에서 HctB 무도회에 대한 EOU 무도회의 발현 강도.그런 다음 포함 로케이터 셀에서 애니메이션 그래프에서 스냅샷을 시각화합니다. 발달 뉴턴을 격리하기 위해, 관심의 포함으로부터, 확인된 포함으로 시야를 잘 배치하고, 위상 차동 간섭 대조 백색광채널 광원을 통해 바늘을 전달하여 바늘을 시각화하고, 595 나노미터, 여기 채널을 사용하여 추출을 위한 초등체를 시각화한다. 미세 조정 및 마이크로 조작기를 사용하여 모세관 바늘을 포함시키고, 바늘로 포함을 파열시키고, 마이크로 인젝터를 사용하여 초등학교를 모세혈관 바늘 팁으로 끌어들인다.추출된 초등학교 체체를 모세관 바늘에서 단 하나의 우물로 추방하고, 24개의 잘 폴리스티렌 플레이트에서 제조된, 다음 추출을 위해 새로운 모세관 바늘을 사용한다. 각 분리의 충분한 확장 후, 1 밀리리터 마이크로 파이프 팁으로 감염된 단층부를 방해하고 중간 세포 파편을 전송하고 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브로 클라미디아를 방출. 원심분리에 의해 수확된 클라미디아를 펠릿과 75마이크로리터의 얼음 냉기, 자당 인산염 글루타민트 버퍼로 환원한 다음, 3개의 새로운 1.5 밀리리터 스크류 캡 마이크로 원심분리튜브 사이에 포함 현탁액을 균등하게 분할하고, 영하 80에 튜브를 저장하여 섭씨까지 보관한다.돌연변이원 ISED의 이미징을 위한 숙주 세포 배양을 설정하기 위해 종자 96개의 잘 유리 바닥 플레이트를 1.6배 10배, 제4의 비용으로 7개의 세포에, 100마이크로리터당 완전한 배지의 마이크로리터가 있다. 숙주 세포 단층이 합류에 도달하면 수확된 돌연변이 클론과 야생형 클라미디아 스톡을 얼음위에 해동시키고 격리당 하나의 컬럼을 사용하여 각 돌연변이 분리의 2배 연속 희석을 수행합니다. 감염, 야생형 클라미디아를 가진 나머지 컬럼은 약 0.5의 감염의 복합성에서, 인큐베이션의 끝에 10시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 판을 놓고, 하나 미만의 감염의 복합성에 해당하는 돌연변이 분리물당 3개의 우물을 선택하고, 이미징 위치 목록을 생성한다.잘 볼 수있는 두 개의 필드로 구성되어 있습니다. 이 산란도에서, 개별 클라미다이얼 분리물로부터 EOU 및 hctB 프로모터의 절반 최대 발현을 관찰할 수 있는 시간은 EOU 프로모터로부터 최대발현을 갖는 짧은 시간을 생성함에 따라 격리를 위해 선출된다. 변경된 운동학을 가진 포함은 2개의 프로모터의 동적 유전자 발현의 시각화, 및 애니메이션 그래프의 스냅샷을 사용하여 관심 있는 포함물의 위치를 식별하기 위해 사용될 수 있다.이러한 대표적인 시각화에서, 총 24개의 포함물이 격리를 위해 확인되었으며, 그 중 10개는 3개의 다른 표현성 범주에서 재검사를 통해 차동 운동제를 나타내었으며, 8개의 분리는 감염 후 약 24시간에서 EOU 프로모터 발현이 감소하였다. A3667 클론에 의해 입증된 바와 같이, B3858 격리는 또한 감염 후 약 24시간에서 감소된 EOU 프로모터 발현을 나타냈다. 그러나 B3662가 분리된 반면, hctB 프로모터 발기인 표현의 전반적인 증가는 EOU 프로모터로부터 의 증가된 수준의 꽃을 표현한 다음 두 프로모터모두에서 급격한 발현 손실이 나타났습니다.돌연변이 B3662에 대한 살아있는 세포 현미경의 분석은, 호스트 세포 용해가 이 돌연변이에 감염된 세포에서, 야생 모형 감염한 세포에서 보다는 훨씬 일찍 일어났다는 것을 보여줍니다. 세포 유형 개발 결핍 클라미디아 복구, 이러한 세포가 숙주를 재감염 할 수 없습니다으로, 가능하지 않을 수 있습니다. 게놈 넓은 협회 연구는 대체 프로모터 기자의 통합과 함께, 통계적 상관 관계를 통해 발달 유전자를 식별하기 위해 격리 후 사용할 수 있습니다.이 방법은 수많은 유전 적 경로의 탐구, 유전 회로 메커니즘 및 기타 세포 내 병원체의 해부로 확장 될 수 있습니다.

live-cell-forward-genetic-approach-to-identify-isolate-developmental

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

우리는 화학 돌연변이 및 전체 게놈 시퀀싱에 따라 클라미디아의 유전자 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 또한, 감염된 세포 내에서 DNA 교환을위한 시스템은 유전자 매핑에 사용할 수있는 설명합니다. 이 방법은 변환 시스템 및 분자 유전 학적 도구가 부족한 미생물 시스템에 광범위하게 적용 할 수있다.

앞으로 유전 접근<em&gt; 클라미디아의 trachomatis</em

클라미디아를 함유한 세포 액포(내포물)를 조명하기 위한 살아있는 세포 형광 단백질 기반 방법이 설명되어 있습니다. 이 전략을 사용하면 샘플에서 클라미디아 감염성을 빠르고 자동으로 측정할 수 있으며 개재물 성장 역학을 정량적으로 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여<em&gt; 클라미디아</em&gt; 액포 성장 역학 살아있는 세포에서

스트레스 저항은 장수의 특징 중 하나이며 유 전적으로 규율하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 장수 연구에 마우스 모델을 개발하기 위해있는 배아 줄기 세포에 스트레스 저항을 부여 돌연변이 선별 편견 높은 처리량 방법을 개발했다.

앞으로 유전 접근은 마우스의 스트레스 저항성 유전자를 밝히기 위해서 - ES 세포에서 높은 처리량 화면

온도에 민감한(ts) 치명적인 돌연변이는 필수 기능을 식별하고 분석하는 데 유용한 도구입니다. 여기에서는 높은 처리량으로 ts의 치명적인 돌연변이를 생성하고 분류하는 방법을 설명합니다.

온도에 민감한 치명적인 돌연변이의 높은 처리량 로봇 보조 절연에<em&gt; 클라 미도 모나스의 reinhardtii에서</em

여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

세균성 병원체는 중요한 생물학 프로세스를 표적으로 하는 호스트로 단백질을 은닉합니다. 세균성 이펙터 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로를 확인하는 것은 분자 병인을 해결하는 열쇠입니다. 여기서, 독성 세균 이펙터 단백질에 의해 표적화된 숙주 경로를 해명하기 위해 변형된 효모 억제기 및 독성 스크린을 사용하는 방법이 기재되어 있다.

효모 독성 및 억제기 스크린을 사용하여 세균 효과 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로의 확인

여기서 기재된 것은 플로시드 카세트 알레릭 교환 돌연변이, FLAEM을 사용하여 클라미디아 트라코마티스에서 표적화된, 마커리스 유전자 결실을 위한 방법이다.

클라미디아 트라코마티스의 플록세드 카세트 알레릭 교환 돌연변이에 의한 마커리스 유전자 결실

앞으로 유전학이 어떻게 분자 수준을 해명하기위한 강력한...

분리하기위한 유전자 스크린 Toxoplasma gondii 호스트 세포 재현의 돌연변이

바이러스에 의한 유전자 침묵은 식물의 nonhost 저항성에 관련된 유전자를 식별하기위한 유용한 도구입니다. 우리는 nonhost 병원균에 감염 유전자 침묵 식물을 식별 GFPuv을 표현 세균성 병원체의 사용을 보여줍니다. 이 방법은 빠르고, 간단하고 대규모 검사와 유사한 프로토콜이 다양한 식물 미생물 상호 작용을 연구에 적용 할 수있는 용이하게합니다.

유전자의 식별을위한 VIGS - 중재 앞으로 유전학 검사는 Nonhost 저항에 참여

Forward genetics는 세포 내 병원체에서 세포 자율 면역에 대한 저항에 중요한 유전자를 식별하는 강력한 접근 방식입니다. 현재 접근 방식은 선천성 면역 세포, 특히 대식세포를 사용하여 면역 회피에 중요한 새로운 Toxoplasma gondii 유전자를 식별합니다.

앞으로 유전학 식별하는 대 식세포를 사용하여 화면<em&gt; 톡소 포자충</em&gt; 유전자 중요 저항이하는 IFN-γ 의존 세포 자치 내성

배우세요 형광 프로모터 리포터와 실시간 현미경을 활용한 Chlamydia trachomatis 발달 돌연변이 격리 방법입니다. 이 기술은 발달 주기를 조절하는 유전자를 식별하여 치료 전략 개선에 기여합니다.

클라미디아 트라코마티스에서 발달 돌연변이를 식별하고 격리하는 살아있는 세포 앞으로 유전 적 접근

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