허혈성 신장 손상 마우스 모델의 신장에서 MicroRNA에 대한 정량적 검출 방법
2020년 9월 11일
이 논문은 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 급성 신장 손상 마우스 모델의 신장에서 microRNA 발현을 검출하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 허혈성 신장 손상 마우스 모델과 microRNA 샘플의 신중한 추출을 강조합니다.
AKI에서 마이크로RNA의 발현 변경은 바이오마커 및 치료에 유용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 간단하며 실험실 간에 일정한 결과를 얻습니다. 신장의 IRI는 AKI의 주요 위험 요소 중 하나입니다. IRI에 의해 변경된 microRNA를 정량화하면 진단으로 이어집니다. 신장 샘플에서 정제된 MicroRNA는 다른 시스템에 적용됩니다. 시술 전반에 걸쳐 저체온증, 장 보습 및 마취 깊이를 주의 깊게 모니터링하십시오. 익숙해져야 할 수동 기술이 많기 때문입니다.
[내레이터] 발가락 꼬집기에 반응이 없는 것을 확인한 후, 마취된 마우스를 온열 수술용 패드에 누운 자세로 놓는다. 정중선 복부 절개를 한 후 PBS를 적신 면봉을 사용하여 장을 추가 복강 왼쪽으로 부드럽게 밀어 오른쪽 신장과 요관을 노출시키고 각진 겸자를 사용하여 오른쪽 요관을 들어 올립니다. 4-0 실크 편조 봉합사로 요관을 두 곳에서 결찰하고 신장에 더 가까운 봉합사에 더 긴 끈을 남기고 봉합사 사이를 절단합니다. 남은 봉합사를 조심스럽게 잡고 신장을 따라 결합 조직과 지방을 직설적으로 해부하고 오른쪽 신장에 혈액을 공급하는 신장 동맥이나 정맥이 아닌 혈관을 식별합니다. 혈관을 결찰하고 오른쪽 신장이 충분히 분리되면 신장 정맥과 동맥을 결찰합니다. PBS를 적신 면봉을 사용하여 장을 추가 복강의 오른쪽으로 부드럽게 밀어 왼쪽 신장을 노출시키고 축축한 드레이프로 장을 덮습니다. 시연된 대로 왼쪽 신장을 준비한 후 신장에서 1cm 떨어진 곳에 신장 동맥과 정맥을 고정하여 왼쪽 신장 허혈을 유발합니다. 성공적인 허혈은 신장 조직이 점진적으로 균일하게 어두워짐에 의해 시각적으로 확인할 수 있습니다. 허혈이 확인되면 장이 뒤틀리지 않도록 주의하면서 장 조직을 복강으로 되돌리고 복부 피부를 일시적으로 닫고 드레이프합니다. 25-45분 후 클램프를 제거하고 혈류 재관류와 신장 색상이 개선되는지 확인합니다. 장이 뒤틀리지 않았는지 확인한 후 복강내 PBS를 주입하고 4-0 나일론 봉합사를 사용하여 복부 근육과 피부를 2층으로 봉합합니다. 허혈성 손상 유도 24시간 후 정중선 절개를 다시 열고 27게이지 바늘을 사용하여 하대정맥에서 혈액을 채취합니다. 흉벽을 정중선 절개하고 좌심실에 23게이지 바늘을 삽입합니다. 바늘로의 역류를 확인한 후 간 우엽을 절개하고 PBS 20ml를 주입합니다. 간이 빨간색에서 분홍색으로 변하여 충분한 혈액이 배출되었음을 확인합니다. 집게와 가위를 사용하여 왼쪽 신장을 제거하고 절제된 조직을 PBS 접시에 씻습니다. 그런 다음 겸자를 사용하여 신장을 건조시키지 않고 신장 근막을 제거하고 수직 정중선을 따라 신장을 반으로 자릅니다. 마이크로RNA 정제를 위해 냉동 신장 샘플 30mg을 700마이크로리터의 페닐구아니딘 기반 용해 시약이 들어 있는 유리 균질화기에 얼음 위에 넣고 유봉을 천천히 반복적으로 비틀어 샘플을 완전히 균질화합니다. 조직이 완전히 해리되면 균질화된 용해물을 2밀리리터 수집 튜브의 마이크로 원심분리기 스핀 컬럼의 바이오폴리머 파쇄 시스템으로 옮기고 원심분리를 통해 샘플을 튜브 바닥으로 수집합니다. 용해물을 140마이크로리터의 클로로포름이 들어 있는 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 캡을 단단히 조인 상태에서 15초 동안 튜브를 반전시켜 혼합합니다. 실온에서 2-3분 동안 배양한 후, 원심분리에 의해 샘플을 침전시키고 펠릿을 방해하지 않고 100% 에탄올 부피의 1.5배를 포함하는 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 상청액을 옮깁니다. 700마이크로리터의 샘플을 2밀리리터 수집 튜브의 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼으로 옮기기 전에 와류하여 샘플을 5초 동안 혼합합니다. 짧은 원심분리 후, 플로우 스루를 버리고 세척당 새로운 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼에서 500마이크로리터의 세척 완충액 2로 샘플을 두 번 세척하여 미량의 염분을 제거합니다. 두 번째 세척 후, 실리카 멤브레인 기반 스핀 컬럼을 다시 원심분리하고 플로우 스루를 버린 후 컬럼을 새로운 1.5밀리리터 수집 튜브로 옮깁니다. 25마이크로리터의 RNase가 없는 물을 컬럼에 추가하고 샘플을 실온에서 5분 동안 배양한 후 샘플을 다시 원심분리합니다. 그런 다음 25마이크로리터 마이크로RNA 함유 엘루아이트를 새로운 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 본 연구에서는 급성 신장 손상 마우스의 신장에서 상향 조절된 인간에서 발현되는 7개의 마이크로RNA를 조사했습니다. 입증된 바와 같이 6개의 마이크로RNA의 수준은 정량적 실시간 PCR을 사용하여 모의 마우스에 비해 허혈 재관류 손상 마우스의 신장에서 유의하게 증가한 것으로 나타났습니다. 혈청 혈중 요소, 질소 및 크레아티닌 수치와 급성 세뇨관 괴사도 유의하게 상향 조절되었습니다.
IRI 진단 및 AKI의 특정 치료를 위한 바이오마커는 아직 불분명합니다. microRNA 연구가 발전하여 AKI의 진단과 치료에 기여하기를 바랍니다.
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개요
이 기사는 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 급성 신장 손상 마우스 모델의 신장에서 마이크로RNA 발현을 검출하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 연구는 허혈성 신장 손상 후 마이크로RNA 샘플의 신중한 추출을 강조합니다.
주요 연구 요소
과학 영역
- 신경과학
- 생물학
- 마이크로RNA 연구
배경
- 변경된 마이크로RNA 발현은 급성 신장 손상(AKI)의 바이오마커로 기능할 수 있습니다.
- 허혈-재관류 손상(IRI)은 AKI의 주요 위험 요소입니다.
- 마이크로RNA는 추가 분석을 위해 신장 샘플에서 정제할 수 있습니다.
- 절차 중 생리적 매개변수를 모니터링하는 것이 중요합니다.
연구 목적
- 신장 조직에서 마이크로RNA 검출을 위한 신뢰할 수 있는 프로토콜을 수립하는 것.
- AKI 모델에서 특정 마이크로RNA의 발현 수준을 조사하는 것.
- AKI 진단 및 치료에서 마이크로RNA 역할에 대한 이해에 기여하는 것.
사용된 방법
- 수술 기술을 통한 마우스 신장에서 허혈 유도.
- 신장 조직에서 마이크로RNA 수집 및 정제.
- 마이크로RNA 발현 수준을 분석하기 위한 정량적 실시간 PCR.
- 수술 절차 중 생리적 조건 모니터링.
주요 결과
- 7개의 마이크로RNA가 AKI 마우스 신장에서 상향 조절되는 것으로 밝혀졌습니다.
- 6개의 마이크로RNA가 대조군 마우스와 비교하여 유의미한 증가를 보였습니다.
- 혈청 요소 질소 및 크레아티닌 수준도 유의미하게 상승했습니다.
- 연구는 마이크로RNA가 AKI의 바이오마커로서의 잠재력을 강조합니다.
결론
- 프로토콜은 실험실 간에 일관된 결과를 제공합니다.
- 마이크로RNA 연구는 AKI 진단 및 치료 전략을 개선할 수 있습니다.
- AKI에서 마이크로RNA의 역할을 명확히 하기 위해 추가 연구가 필요합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Quantitative detection of microRNAs in ischemic kidney injury models supports biomarker discovery and target validation in acute kidney injury research. This protocol enables reproducible miRNA quantification, facilitating mechanistic de-risking and predictive confidence in preclinical studies. The method provides a standardized approach for evaluating miRNA expression changes linked to renal ischemia-reperfusion injury.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying miRNA expression changes in AKI models.
- Operational Value: Supports biological de-risking through consistent miRNA purification and detection across laboratories.
- Predictive Value: Provides quantitative readouts that aid in assessing target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Delivers a qRT-PCR-based method with wide dynamic range for accurate miRNA quantification.
- Reproducibility: Ensures consistent results between laboratories when protocol is followed precisely.
- Scalability: Compatible with downstream applications such as functional validation and biomarker screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Directly applicable to studying miRNA expression profiles in AKI kidneys.
- Translational Continuity: Bridges discovery-phase miRNA detection with preclinical validation of AKI mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven decisions on miRNA targets based on expression thresholds and statistical significance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum by providing quantitative miRNA data that informs target selection and pathway analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and functional validation of miRNAs implicated in ischemic injury.
- Analytics: Generates quantitative Ct values and fold-change measurements for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects miRNA expression patterns to phenotypic outcomes such as acute tubular necrosis and serum biomarker elevation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable qRT-PCR workflow for miRNA profiling across multiple kidney injury models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing specific, quantifiable miRNA expression data.
- Operational Value: Standardizes RNA purification and detection steps to minimize inter-laboratory variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking miRNA changes to pathophysiological relevance in AKI.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of miRNA targets based on expression magnitude and statistical significance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in rodent surgery, RNA handling, and qRT-PCR optimization.
- Depends on access to homogenization, centrifugation, and real-time PCR instrumentation.
- Necessitates standardized protocols for ischemia duration, reperfusion confirmation, and tissue processing.
- Involves adaptation considerations when applying to different mouse strains or injury models.
- Limited by the need for careful anesthesia and physiological monitoring to ensure model consistency.
