Name: 암 약리학 연구를 위한 PDX 및 PDX 유래 오르가노이드의 생체내/생체외 환자 유래 모델 쌍 생성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 49 s
Description: 학습하세요 PDX에서 오르가노이드를 생성하여 생체내/생체외 쌍 모델을 구축하는 방법을. 효소 소화와 기계적 처리를 통해 암 약리학 연구에 활용할 수 있는 일치된 모델 라이브러리를 만듭니다.

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저자들은 조디 바르보 박사, 페데리카 파리시, 라젠드라 쿠마리 박사에게 원고의 비판적 독서와 편집에 감사드립니다. 저자는 또한 그들의 큰 기술적인 노력에 대 한 체외와 생체 내 팀에 크라운 생물 과학 종양학 감사 하 고 싶습니다.

동물의 치료 및 사용과 관련된 모든 프로토콜 및 개정 또는 절차는 연구를 수행하기 전에 크라운 바이오 사이언스 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토되고 승인되었습니다. 동물의 치료와 사용은 AAALAC (실험실 동물 관리의 평가 및 인증 협회) 실험실 동물의 치료 및 사용에 대한 가이드에 보고 된 국제 가이드에 따라 수행되었다, 국립 연구 위원회 (2011). 모든 동물 실험 절차는 SPF (특정 병원체가없는) 시설에서 멸균 조건하에서 다른 정부 기관의 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드 (예 : 국립 보건 원)에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 이 프로토콜은 시설 기관의 동물 실험 윤리 위원회(예: 기관 IACUC 위원회)의 승인을 받았습니다.
1. 종양 이식 준비
<ol><li>
동물 주택
	<ol>
<li>하우스 발브/c 누드 마우스(n=5)는 개별 환기 케이지에서 20-26°C, 30-70% 습도, 12-h 의 조명 주기, 옥수수 침대 침구가 매주 변경된 12h 빛/12-h 의 조명 주기, 그리고 멸균 된 건조 과립 식품 플러스 멸균 식수 ad libitum을 조사합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
기증자 종양 단편 제제
	<ol>
<li>체중(BW, 계량 균형을 통한) 및 종양 부피(TV, 캘리퍼 측정)에 대한 종양 베어링 공여자 마우스를 면밀히 모니터링합니다.</li>
		<li>TV가 800-1000mm3에도달하면 생물학적 위험에 노출된 후드에서 종양을 낳는 동물을 안락사시합니다.<ol>
<li>마우스를 안락사 챔버에 배치하여 CO2 가스를 챔버에 전달합니다. 동물에게 최소한의 고민으로 급속한 무의식을 생성하는 유속으로 챔버로 가스를 배출합니다. CO2의 최적 유량은 약 2-2.5 Lpm입니다.</li>
			<li>동물이 의식을 되찾지 못한다는 것을 관찰하여 안락사를 보장하십시오.</li>
			<li>명백한 임상 죽음 후에, 동물이 복구할 수 있는 가능성을 최소화하기 위하여 >1 분 동안 가스 흐름을 유지합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>요오도프터 면봉을 사용하여 종양 주위의 피부를 살균하십시오. 인접한 비종양 조직을 제거하고 20mL의 PBS를 함유한 페트리 접시에 놓음으로써 종양을 수집, 안락사 전에 미리 냉각(4°C).</li>
		<li>다른 페트리 접시에 PBS로 종양을 씻어 혈액 성분을 제거하고 추가 피부, 혈관, 석회화 및 / 또는 괴사를 제거합니다.</li>
		<li>이식을 위해 별도의 동물실로 이송하기 전에 PBS20mL의 멸균 50mL 원심분리기 튜브에 그대로 종양 조각을 배치합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 피하 종양 성장
<ol><li>
면역 손상 된 마우스로 종양 조각의 피하 접종
	<ol>
<li>PDX 종양을 메스로 2mm 조각으로 자르고 각각 피하(SC) 이식용 트로카에 넣습니다.</li>
		<li>5%의 이소플루란(1%에서 코 콘으로 유지됨)으로 수령인 동물을 마취시킵니다. 동물들은 고통에 반응하지 않을 때까지, 자신의 오른쪽 반사를 잃고 결국 움직이지 않고, 휴식을 취합니다. 마취된 마우스를 오른쪽 측면 위치의 실험 보드에 고정하고 특히 종양 접종 부위를 둘러싼 요오도프소어 면봉으로 살균합니다.</li>
		<li>왼쪽 측면 피부는 엉덩이에 두개골만, 메스와 0.5cm 절개를하고 앞다리쪽으로 피부 아래 터널을 만들, 2-3cm, 무딘 집게를 사용하여.</li>
		<li>무균 배지에서 접종 부위당 종양 단편 1개의 큐브를 분리하고 피하 터널 내부에 깊숙이 배치한다. 상처 클립으로 상처를 닫기 전에 조각의 위치를 시각적으로 확인합니다.</li>
		<li>종양 이식 된 마우스 (5)를 모니터링하여 흉골 변수를 유지하기 위해 의식이 될 때까지 마취에서 완전히 회복 한 후에만 케이지로 돌아갑니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
종양 베어링 마우스 건강 모니터링
	<ol>
<li>매일 물과 음식 소비를 확인하고 매주 체중을 기록하십시오.</li>
		<li>일상적인 모니터링 중에 마우스를 확인하십시오. 이동성, 호흡, 그루밍 및 일반적인 외관, 음식과 물 소비, BW 이득 / 손실, 진동 등에 미치는 영향을 기록하십시오.</li>
		<li>캘리퍼를 사용하여 매주 두 번 TV를 측정하고 mm당 3으로 표현 : TV = 0.5 a × b2,여기서 a와 b는 각각 종양의 길이와 폭입니다.</li>
		<li>다음 징후가 나타날 때 동물을 희생하여 샘플을 수집하십시오: BW 손실 >20%; 장애인 이동성 (먹거나 마실 수 없습니다); 중요한 선동 또는 확대 복부 때문에 정상적으로 움직일 수 없습니다; 호흡에 대한 노력; 죽음.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 네크로키 및 종양 수확
<ol><li>종양 부피가 200-800mm3에도달하면 승인된 프로토콜당 마우스를 안락사시합니다(1.2.2단계 참조).</li>
	<li>인접한 비종양 조직을 제거하여 종양 조직을 수집하고, 그 다음에 는 AD+++를 가진 50mL 플라스틱 튜브에 조직을 증분하기 전에 (얼음에) 놓는다.</li>
</ol>4. PDX 유래 오르가노이드 배양 준비
참고: 다음의 모든 단계는 조직 배양 표준 지침에 따라 생물 안전 캐비닛 내에서 수행되었습니다. 사용하기 전에 37°C 인큐베이터에 96, 24, 6웰 플레이트의 미리 데운 스톡을 보관하십시오.
<ol><li>시약 준비<ol>
<li>지하 멤브레인 추출물(BME) 용액(성장인자 감소, 페놀 레드 프리)을 준비한다. BME 10mL을 4°C 냉장고에 하룻밤 동안 보관하십시오. 해동되면 BME 병을 소용돌이어 분산을 보장합니다.</li>
		<li>기본 미디어/세척 버퍼 AD++++를 준비합니다. 5mM L-글루타민, 1M HEPES 및 펜/스트렙을 5mL 파이펫으로 파이펫팅하여 고급 DMEM/F12 미디어에 5mL를 추가합니다.</li>
		<li>사토 외에 의해 설명 된 바와 같이 결장 오르가노이드 배지를 준비합니다. 18N-Ac (1 mM), A83-01 (500 nM), B27 (1x), EGF (50 ng / mL), 노긴 (100 ng / mL), 니코티나미드 (10 mMM), SD202와 기본 미디어를 보충통해18 1190 (10 nM), R-스폰딘 (500 ng /mL), L-글루타민 (2 mM), HEPES (10 μM), 페니실린 연쇄 상반신 (1x) 및 Y-27623 (10 μM)19.</li>
		<li>AD++++소화 배지 준비: 콜라게나아제 형 II(20 mg/mL)의 500 μL과 로키 Y-27632(10mMM)의 10 μL을 가진 1x 오가노이드 배양 배지 10mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>종양 해리20<ol>
<li>50mL 플라스틱 튜브에서 종양을 10cm 페트리 접시로 옮기. 통치자와 함께 거시적인 사진을 찍고 그 조건(즉, 크기, 지방 조직, 혈관화, 괴사 등)에 대한 설명을 기록합니다.</li>
		<li>여분의 AD ++++를 포부로 제거하고 종양 조직을 가위로 잘라내고 1-2조각을 2mL 마이크로튜브로 옮겨 드라이 아이스에서 얼립니다. 유전체 프로파일링을 위해 -80 °C에 보관하십시오. AD+++를 사용하여 50mL 플라스틱 튜브로 옮기기 전에 나머지 조각을 가위로 잘라냅니다.</li>
		<li>다진 조직을 AD+++의 35mL로 2-3회 세척하고, 소화 매체 10mL(단계 4.1.4 참조)를 추가하고 37°C에서 1시간 동안 4x g의 궤도 셰이커에 배치합니다.</li>
		<li>5mL 멸균 플라스틱 파이펫을 사용하여 위아래로 파이프를 사용하여 소화된 조직을 균질화하고, AD+++의 20mL를 추가하고 100 μm 셀 스트레이너에 의해 여과합니다.</li>
		<li>AD+++(5분 동안 450xg에서 회전)로 통과를 두 번 씻은 다음 BME에서 재서스펜션(서스펜션용 펠릿에 BME의 4배 부피를 추가) 얼음19를유지하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>오르가노이드 문화의 준비<ol>
<li>BME 셀 서스펜션을 여러 방울의 6웰 플레이트에 추가하여 웰당 총 200 μL에 넣습니다.</li>
		<li>플레이트를 37°C 인큐베이터로 옮는다. 30분 후, 젤이 방울이 굳어집니다.</li>
		<li>각 웰에 2mL의 오르가노이드 미디어를 추가하여, 인큐베이터(37°C 및 5%CO2)로전송하기 전에 현미경 사진에 의해 기록된 대표적인 방울을 넣습니다.</li>
		<li>3-4일마다 중간 변화가 있는 오르가노이드 배양을 유지하고, 7일마다 1:2 비율로 또는 성장과 밀도에 따라 통과한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 조직 병리학 및 차세대 염기서열 분석 (NGS) 분석
<ol><li>조직 병리학<ol>
<li>P1000 파이펫을 사용하여 기존 배지와 잘 에서 오가노이드를 수집하고, 원심분리(5분 동안 450xg에서 회전), PBS로 세척하고 1시간 동안 포머린10%로 고정합니다.</li>
		<li>고정 된 오르가노이드를 50 mL 원색 튜브의 바닥에 100 % 젤라틴에 놓고 일상적인 조직 처리 및 포함이 뒤따릅니다.</li>
		<li>4mm 파라핀 섹션에서 표준 프로토콜을 사용하여 헤마톡시린-에오신(H&E) 염색을 수행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNAeq 및 전체 엑소메 시퀀싱<ol>
<li>P1000 파이펫을 사용하여 기존 배양 배지와 잘에서 오르가노이드를 수집하고, 4°C에서 5분 동안 최대 속도(12,000 x g)의미세원심분리기를 사용하여 원심분리기를 사용하여 원심분리기를 수집합니다.</li>
		<li>눈에 보이는 BME가 존재하지 않았는지 확인하기 위해 중간 상체를 제거하여 펠릿을 수집하고 마이크로튜브(dry ice)에서 스냅 동결한 다음 -80°C 냉동고로 옮춥니다.</li>
		<li>제조 업체에서 표준 절차를 사용 하 여 RNA 또는 DNA를 추출 하 고 RNAseq 및 전체 exome 시퀀싱 (WES)에 대 한 NGS 분석을 수행.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. IC50 분석20
<ol><li>IC50 분석용 384웰 플레이트의 오르간성 파종<ol>
<li>BME의 소화 오르가노이드는 각 우물(소화 BME)에서 20μL의 100x 디스파제 용액을 추가하여 각 우물(6웰 플레이트)에 2mL의 오르간성 배지를 포함하고, 37°C에서 10분 의 배양이 뒤따릅니다.</li>
		<li>파이펫은 모든 우물에서 오가노이드를 소화하여 70 μm 필터를 50mL 플라스틱 튜브로 사용하여 오르가노이드를 수집했습니다.</li>
		<li>오르가노이드 농도의 결정에 대한 현미경 검사에서 오르가노이드를 계산합니다. BME를 첨가하기 전에 배양 매체를 사용하여 오르가노이드를 일시 중단하여 얼음에 5%(v/v)의 최종 농도에 도달합니다.</li>
		<li>해당 오르가노이드 배양 배지에서 200 CR2110 PDXOs의 파종 밀도를 가진 플레이트 맵에 따라 액체 디스펜서가 있는 각 384웰 플레이트에 오르가노이드 서스펜션50μL을 추가합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시스플라틴 및 이리노테칸 치료<ol>
<li>시스플라틴(100 μM 농도)과 "irinotecan"(10μM 의 농도가 가장 높은)을 사용합니다. SN-38 (irinotecan의 대사 산물, 일반적으로 생체 내 연구에 사용되는 irinotecan 반대) 9 복용량에 대 한 약물 희석 계획에 따라 각 잘, 디지털 dispener에 의해 직렬 희석에.</li>
		<li>디지털 디스펜서 소프트웨어 도구를 사용하여 플레이트맵을 만듭니다. 0%의 생존력을 보인 5μM starurosporine의 100% 생존력 과 사후 제어 차량을 포함합니다.</li>
		<li>약물 처리된 384웰 플레이트를 37°C 인큐베이터에 다시 넣습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>약물 치료 후 오르가노이드 세포 생존 가능성 의 결정<ol>
<li>약물 치료의 끝에 5 일, 제조 업체의 권장된 절차에 따라 발광 세포 생존성 시약을 사용 하 여 organoid 세포 생존 가능성을 결정. 액체 디스펜더와 함께 각 우물에 발광 시약을 추가하고 플레이트 셰이커에 5 분 동안 혼합한 다음 어두운 실온에서 30 분 배양합니다.</li>
		<li>발광 멀티 웰 플레이트 판독기에 발광 신호를 기록합니다.</li>
		<li>플레이트 판독기의 원시 판독값을 사용하여 각 웰의 정규화된 비우력을 계산하고 비선형 곡선 피팅에 의해 용량 반응 곡선 및 IC50 값을 생성합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

모든 저자는 크라운 바이오 사이언스, Inc.의 현재 풀 타임 직원입니다.

이 보고서에서 PDX/PDXO-CR2110의 예비 데이터는 유전체학, 조직병리학 및 약리학과 관련하여 PDX와 PDXO 사이의 생물학적 동등성을 뒷받침하며, 이는 두 모델이 환자의 원래 CSC에서 유래된 질병 형태를 나타내기 때문이다. 두 모델 모두 환자 유래 질환 모델이며, 잠재적으로 환자의 임상 반응을예측한다(10,11,12,21). 시험관 내 및 생체 내 모델의 일치 쌍은 생체 내 검사 및 유효성 검사에 대한 서로를 보완 할 수 있습니다, 약물 발견의 성공률을 개선하고 잠재적으로 임상 개발의 감소 속도를 감소. 이제 PDXO가 HTS가 생체 내 비용이 높고 일정시간이 길어지므로 PDX가 실패하는 사용 가능한 대형 환자 파생 오르간 성 라이브러리를 활용할 수 있게 되었습니다. 말할 필요도 없이, 일...

암은 다양한 유전 및 면역 학적 장애의 모음입니다. 효과적인 치료법의 성공적인 개발은 임상 결과를 효과적으로 예측하는 실험 모델에 크게 의존합니다. 잘 특징화된 환자 유래 제노이식(PDX)의 대형 라이브러리는 환자 종양 특성, 이질성 및 환자 약물 반응1을회수하는 능력으로 인해 화학 요법 및/또는 표적 요법을 테스트하기 위해 생체 내 번역 시스템으로 오랫동안 간주되어임상2,3. PDX는 일반적으로 유전적 안정성을 특징으로 하는 암 줄기 세포 질환으로 간주되며, 세포주 유래 제노이식2와는 대조적이다. 지난 수십 년 동안 PDX의 대규모 컬렉션은 전 세계적으로 만들어졌으며 오늘날 암 약물 개발의 주력선수가 되었습니다. 널리 사용되고 큰 번역 가치와 있지만,이 동물 모델은 본질적으로 비용이 많이 들며 시간이 많이 걸리고 처리량이 적기 때문에 대규모 스크리닝에는 적합하지 않습니다. PDX는 면역 손상 된 자연4로인해 면역 종양학 (IO) 테스트에도 바람직하지 않다. 따라서 PDX의 사용 가능한 대형 라이브러리를 최대한 활용하는 것은 비실용적입니다.
한스 클레버의 실험실5에의해 개척 된 최근의 발견은 상피 기원의 대부분의 인간 기관에서 성인 줄기 세포에서 생성 된 오르가노이드의 체외 배양의 설립을 주도하고있다5. 이러한 프로토콜은 다양한 징후6,7의인간 암종에서 가정된 CSC에서 장기형의 성장을 허용하기 위해 더욱 정제되었다. 이러한 환자 유래 오르가노이드(PdOs)는 genomically 안정된8,9이며 임상 치료결과(10, 11,12)를높게 예측하는 것으로 나타났다. 또한, PdPo의 체외 특성은 높은 처리량 스크리닝(HTS)13을가능하게 하여 생체 내 모델보다 우위를 제공하고 환자 집단의 대리로서 대형 오르간성 라이브러리를 활용할 수 있다. PdSo는 위에서 설명한 PDF의 많은 한계를 극복하는 중요한 발견 및 번역 플랫폼이 될 태세입니다.
PDO와 PDX는 모두 환자 유래 및 CSC 구동 모델이며 개인화된 치료 또는 임상 시험 형식의 맥락에서 치료법을 평가할 수 있습니다. 기존 대형 PDF 라이브러리는 >3000PDXs 14,15,16,17의독점 컬렉션과 같이 종양 오르가노이드(PDX 유래 오르가노이드 또는 PDXO)의 신속한 라이브러리 생성에 적합하므로 PDX 및 PDXO 모델의 일치하는 라이브러리를 생성합니다. 본 보고서는 부모 PDX-CR2110 모델16과관련하여 대장암 PDXO-CR2110을 만들고 특성화하는 절차를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634028</td><td>Base medium</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243.01</td><td>Washing medium</td></tr><tr><td>Collagenese type II</td><td>Invitrogen</td><td>17101015</td><td>Digest tumor</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Organoid culture matrix (Basement Membrane Extract, growth factor reduced)</td></tr><tr><td>N-Ac</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>오가노이드 배양 배지</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>오가노이드 배양 배지</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>오가노이드 배양 배지</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>오가노이드 배양 배지</td></tr><tr><td>Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>오가노이드 배양 배지</td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마</td><td>N0636</td><td>오가노이드 배양 배지</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7076</td><td>오가노이드 배양 배지</td></tr><tr><td>Gastrin</td><td></td><td>Sigma G9145</td><td>오가노이드 배양 배지</td></tr><tr><td>Rspondin</td><td>Peprotech</td><td>120-38-1000</td><td>오가노이드 배양 배지</td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>오가노이드 배양 배지</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Life Technologies</td><td>15630056</td><td>오가노이드 배양 배지</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>오가노이드 배양 배지</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Abmole</td><td>M1817</td><td>오가노이드 배양 배지</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Life Technologies</td><td>17105041</td><td>스크리닝 분석</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td>스크리닝 분석(발광 ATP 지표)</td></tr><tr><td>멀티드롭 디스펜서</td><td>Thermo Fisher</td><td>Multidrop 콤비</td><td>도금 오가노이드/CellTiter-Glo 3D 추가</td></tr><tr><td>디지털 디스페너</td><td>Tecan</td><td>D300e</td><td>화합물 추가</td></tr><tr><td>Envision Plate reader</td><td>Perkin Elmer</td><td>2104</td><td>발광 판독</td></tr><tr><td>Balb/c 누드 마우스</td><td>Beijing HFK Bio-Technology Co</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>tRNA 정제 키트</td></tr><tr><td>DNAeasy 블러드 & 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>DNA 정제 키트</td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Fisher</td><td>HG-4000-012</td><td>오가노이드 임베딩</td></tr></tbody></table>

암 약리학 연구를 위한 pdx 및 pdx 유래 오르가노이드의 생체내/생체외 환자 유래 모델 쌍 생성

Creating Matched In vivo/In vitro Patient-Derived Model Pairs of PDX and PDX-Derived Organoids for Cancer Pharmacology Research

환자 유래 종양 이종이이식(PDXs)은 종래의 암 약물 평가를 위해 암 줄기세포(CSC)에 의해 구동되는 것으로 여겨지는 가장 예측적인 전임상 모델로 여겨진다. PDXs의 큰 라이브러리는 환자 인구의 다양성을 반영하고 따라서 인구 기반의 전임상 시험 ("단계 II 와 같은 마우스 임상 시험");; 그러나 PDX는 낮은 처리량, 높은 비용 및 긴 기간의 실질적인 한계를 가지고 있습니다. 종양 오르가노이드는 환자 유래 CSC 구동 모델이기도 하며, PDX의 체외 동등한 것으로 간주될 수 있으며, 오르가노이드 또는 화합물의 대형 라이브러리를 다루기 위한 특정 PDX 제한을 극복한다. 이 연구는 PDX 유래 오르가노이드 (PDXO)를 만드는 방법을 설명하므로 시험관 내 및 생체 내 약리학 연구를위한 페어링 된 모델을 초래합니다. 피하 이식 PDX-CR2110 종양은 종양이 승인된 부검 절차에 따라 200-800mm3에도달했을 때 종양 을 낳은 마우스로부터 수집되었으며, 그 다음으로 인접한 비종양 조직을 제거하고 작은 종양 단편으로 해리하였다. 작은 종양 파편은 세척하고 파편을 제거하기 위해 100 μm 세포 여과기를 통과했다. 세포 클러스터는 지하 멤브레인 추출물(BME) 용액에서 수거 및 중단되었고CO2 인큐베이터에서 성장을 위한 주변 액체 매체를 가진 고체 액적물로서 6웰 플레이트에 도금하였다. 오르가노이드 성장은 가벼운 현미경 검사법에 따라 매주 두 번 모니터링되고 사진에 의해 기록되었으며, 액체 중간 크기 변화는 일주일에 2 또는 3 번 변경되었습니다. 재배된 오르가노이드는 1:2 비율로 기계 전단을 사용하여 BME 임베디드 오르가노이드를 방해하여 1:2 비율로 더 통과되었으며, 트립신을 추가하고 10 μM Y-27632를 첨가했습니다. 오르가노이드는 원심분리에 의해 BME에서 방출된 후 장기 저장을 위해 냉동 튜브에서 보존되었으며, 또한 추가 특성화를 위해 샘플링(예: DNA, RNA 및 FFPE 블록)을 샘플링하였다.

빛 현미경 검사법의 경우 오간노이드의 전형인 PDXOs의 형태학, H&amp;E 염색당 부모 PDX와 일치 가벼운 현미경 검사법하에서 PDXO-CR2110은 환자 유래 오르가노이드(PDO)에 대해 이전에 설명한 바와 같이 일반적인 낭포성형태(도 1A)를보여 주며, 동일한 배양 조건하에서 PDXO와 PDO 간의 유사성을 뒷받침하는 증거를 제시한다.
H&amp;E 염색에 의한 조직 병리학 검사는 PDXO-CR2110(도1B)의조직 구조 및 세포 유형이 원래 PDX-CR2110(도1C)을반사한다는 것을 밝혀내고 PDX와 PDXO가 동일한 기원으로부터 개발되었다는 것을 뒷받침한다: CR2110. 이 관찰은 PDXO의 부모 PDX의 유사성을 뒷받침하는 조직 병리학 증거를 제공합니다.
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시험관 내 스크리닝을 위해 환자 유래 제노이식(PDX)을 사용하여 오가노이드를 생성하여 생체내/생체 외 모델의 쌍을 매칭하는 방법을 설명합니다. PDX 종양은 기계적 또는 효소적으로 작은 조각으로 수확/처리되었으며, 원래 PDX에 대해 처리, 냉동 보존 및 특징인 종양 오르가노이드를 성장시키는 영리한 방법.

암 약리학 연구를 위한 PDX 및 PDX 유래 오르가노이드의 생체내/생체외 환자 유래 모델 쌍 생성

Patient-derived tumor xenografts (PDXs) are considered the most predictive preclinical models, largely believed to be driven by cancer stem cells (CSC) ...

이 프로토콜은 쌍환자 유래 제노이식, 또는 PDX, 및 해당 환자 유래 오르가노이드 라인의 일치하는 라이브러리를 설정하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 장점은 생체 내 검사를 위해 PDX를 사용하여 오가노이드를 만드는 데 사용할 수 있으며 생체 내/생체 외 모델의 쌍을 일치시키는 것입니다. 종양을 수확하고 텍스트 원고에 설명된 대로 조직을 처리하는 것으로 시작합니다.조직 소화 후, 5 밀리리터 멸균 플라스틱 파이펫으로 조직을 위아래로 피펫합니다. 그런 다음 20 밀리리터의 AD+를 균주에 넣고 100 마이크로미터 세포 여과기로 필터링합니다. AD+로 여과물을 두 번 세척한 다음 플라스틱 튜브로 옮기고 원심분리기를 5분 동안 450회 G로 옮긴다.BME에서 세포를 다시 중단하고 얼음에 보관하십시오. 오르가노이드 배양을 준비하기 위해 셀 서스펜션 200마이크로리터를 6웰 플레이트의 각 웰에 옮기고 30분 동안 37°C에서 플레이트를 배양한다. 각 웰에 오르가노이드 미디어의 2 밀리리터를 추가하고 현미경으로 대표가 떨어뜨립니다.3~4일마다 중간 변화가 있는 오르가노이드 배양을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 유지하고 7일마다 1대2비율로 통과한다. 오르가노이드를 분리한 후 70마이크로미터 필터를 통해 50밀리리터 플라스틱 튜브로 실행합니다. 현미경으로 오르가노이드를 계산하고 얼음에 BME에서 다시 중단하여 5%의 최종 농도를 위해 200 CR2110 PDXOs의 파종 밀도를 위해 액체 디스펜서가 있는 각 384웰 플레이트에 50 마이크로리터를 추가합니다.디지털 디스펜서를 사용하여 직렬 희석에 각각 SN38을 추가합니다. 디지털 디스펜서 소프트웨어 도구를 사용하여 플레이트 맵을 만듭니다. 처리는 0%의 생존성을 가진 5개의 micromolar Staurosporine의 100%의 생존및 긍정적인 통제를 가진 음성 통제 차량을 포함해야 합니다.완료되면, 약물 처리 384 웰 플레이트를 다시 37섭씨 인큐베이터로 놓습니다. 가벼운 현미경 검사법하에서 PDXO CR2110은 동일한 배양 조건하에서 PDX 유래 오르가노이드와 환자 유래 오르가노이드 사이의 유사성을 보여주는 전형적인 낭포성 형태를 보여줍니다. H&E 염색에 의한 조직 병리학 검사는 PDXO CR2110의 조직 구조 및 세포 유형이 원래 PDX CR2110과 유사하다는 것을 보여줍니다.PDX와 PDXO의 유전체 프로파일 비교는 전사 발현의 94.92%와 DNA 돌연변이의 97.67%의 일치를 나타내며, 이는 이 모델 들 사이의 전반적인 게놈 유사성을 시사한다. 약물 감도 는 384 웰 플레이트에서 PDXO CR2110에서 수행되었다. PDXO CR2110은 irinotecan에 민감하고 시스플라틴에 내성이 있으며 PDX 치료 결과와 일치했습니다.시험관 내 및 생체 내 모델의 일치 쌍은 생체 내 시험관 내 선별 및 유효성 검사에 대해 서로를 칭찬할 수 있으며, 약물 발견의 성공률을 개선하고 임상 개발의 감소율을 잠재적으로 감소시킬 수 있습니다.

creating-matched-vivoin-vitro-patient-derived-model-pairs-pdx-pdx

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

췌장 덕트 선암의 환자 유래 오르가노이드 배양은 높은 충실도를 가진 상피 종양 세포 구획을 나타내는 급속하게 확립된 3차원 모형, 이 치명적인 악성에 번역 연구를 가능하게 합니다. 여기에서, 우리는 이 모형을 사용하여 관련 생물학 생물학 생물학 적인 생물학 적인 생물학 적인 생물학 적인 생물학 을 능력을 발휘하기 위하여 오르가노이드를 설치하고 전파하기 위하여 상세한 방법을 제공합니다.

환자 유래 췌장 선암 조직형 모델의 격리 및 특성 분석

여기서 우리는 종양의 게놈 메이크업에 기초하여 선택된 표적 치료의 효능을 시험하기 위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 구조적인 DNA 재배열의 확인 그리고 검증, 마우스로 환자의 종양의 이식 및 해당 약에 대한 반응을 시험하는 것을 기술합니다.

구조적 DNA 변경 분석 및 환자 유래 제노이식을 사용하여 암에 있는 표적으로 한 치료 시험

다음 작업에서는 대장암과 췌장암의 대형 바이오뱅크 설립에 필요한 연속적인 단계를 설명합니다.

살아있는 바이오 뱅크의 창조 및 유지 보수 - 우리가 그것을 하는 방법

매우 정확한 체외 고처리량 분석 시스템은 암 조직과 유사하지만 96웰 및 384웰 플레이트를 가진 체외 고처리량 분석 시스템에 적합하지 않은 환자 유래 종양 오르가노이드(PdOs)를 사용하여 항암제를 평가하기 위해 개발되었다.

환자 유래 종양 오르가노이드를 사용하여 시험관 분석에서 높은 처리량

이 프로토콜은 종양 내 이질성을 포착하기 위해 다중 매개변수, 단일 오가노이드 약물 반응을 정량화하고 시각화하기 위한 중간 및 고처리량 오가노이드 약물 스크리닝 및 현미경에 구애받지 않는 자동 이미지 분석 소프트웨어를 위한 반자동 방법을 설명합니다.

벌크 및 단일 오가노이드 분석을 위한 광시야 라이브 셀 이미징을 사용한 다중 파라미터 종양 오가노이드 약물 스크리닝

PDX 모델이 중개 종양학 분야에서 빠르게 표준이 되고 있기 때문에 현재 프로토콜은 역형성 갑상선 암종(ATC) 및 두경부 편평 세포 암종(HNSCC)의 환자 유래 이종이식(PDX) 모델을 설정하고 특성화합니다.

역형성 갑상선 암종 및 두경부 편평 세포 암종의 환자 유래 이종 이식 모델의 확립 및 특성화

환자 유래 난소암 오가노이드로 치료 약물 테스트를 수행하는 데 사용할 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

전임상 약물 검사를 위한 난소암 환자 유래 오가노이드 모델

종양 오가노이드는 암 연구와 개인 맞춤형 의학에 대한 접근 방식에 혁명을 일으켰습니다. 이는 임상적으로 관련성이 높은 종양 모델을 나타내며 이를 통해 연구자들은 임상에서 종양보다 한 발 앞서 나갈 수 있습니다. 이 프로토콜은 신선한 췌장 종양 조직 샘플과 췌장 선암 기원의 환자 유래 이종이식에서 종양 오가노이드를 확립합니다.

췌장암 유래 종양 오가노이드 및 섬유아세포를 신선한 조직에서 확립

환자 유래 종양 오가노이드는 기초 및 중개 연구를 위한 정교한 모델 시스템입니다. 이 방법 기사에서는 다양한 오가노이드 표현형의 동시 역학 평가를 위한 다중 형광 라이브 셀 이미징의 사용에 대해 자세히 설명합니다.

암의 환자 유래 오가노이드 모델에서 약물 반응을 위한 다중 라이브 셀 이미징

여기에서는 신선한 흑색종 조직에서 분리된 세포 현탁액을 배양하여 흑색종 환자 유래 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 오가노이드는 in vitro 에서 환자 특이적 종양을 충실하게 재현하여 종양 면역억제 메커니즘, 약물 스크리닝, 약물 내성 메커니즘 및 암 감시 접근법을 탐구하기 위한 혁신적인 접근 방식을 제공합니다.

흑색종 환자 유래 오가노이드 모델을 통한 치료 기회 발굴

학습하세요 PDX에서 오르가노이드를 생성하여 생체내/생체외 쌍 모델을 구축하는 방법을. 효소 소화와 기계적 처리를 통해 암 약리학 연구에 활용할 수 있는 일치된 모델 라이브러리를 만듭니다.

암 약리학 연구를 위한 PDX 및 PDX 유래 오르가노이드의 생체내/생체외 환자 유래 모델 쌍 생성

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