Name: 일방적 인 요원 방해와 마우스 신장에서 microRNA 표현의 정량적 실시간 PCR 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 배우세요 마우스 신장에서 microRNA 발현을 정량적 실시간 PCR로 평가하는 방법을. 일방적 요관 폐쇄 모델을 활용하여 신장 섬유증 등 병리 상태에서 microRNA 프로파일링을 정확하고 민감하게 수행할 수 있습니다.

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이 원고의 초안을 편집한 에단츠 그룹(https://en-author-services.edanzgroup.com/)의 미셸 구디 박사에게 감사드립니다.

모든 동물 실험 프로토콜은 지치의과대학의 동물윤리위원회의 승인을 받았으며, 지치의과대학 실험실 동물가이드의 실험동물 사용 및 관리 지침에 따라 시행되었다.
1. 가짜 수술
<ol><li>이소플루란, 코르크 시트, 탈취 크림, 실험실 물티슈, 인산염 완충식살린 살린 페트리 접시(PBS), 4-0 나일론, 핀셋, 수술 가위, 면봉, 8주된 C57BL/6 수컷 마우스 를 준비한다.</li>
	<li>1.5%의 이소플루란으로 마우스를 마취하고 1.5%로 유지합니다. 그런 다음, 마우스의 복부에 디필 크림을 바르습니다. 몇 분 후, PBS에 흠뻑 젖은 실험실 닦아로 탈모 크림을 닦아.</li>
	<li>마우스의 복부에 70% 에탄올을 주입한 다음 마우스를 마우스 시트에 놓습니다.</li>
	<li>외과 가위와 핀셋을 사용하여 복부의 피부에 절개를하고 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 아래 가장자리까지 근육과 복막을 잘라냅니다.</li>
	<li>PBS로 두 면봉을 적신 다음 내장을 조심스럽게 옆으로 당깁니다. 왼쪽 신장과 요관을 식별하기 위해 촉촉한 면봉을 놓습니다.</li>
	<li>회막을 닫은 다음 4-0 나일론으로 절개를 닫습니다.</li>
</ol>2. UUO 수술
<ol><li>이소플루란, 코르크 시트, 탈필 크림, 실험실 물티슈, PBS를 곁들인 페트리 접시, 4-0 실크, 4-0 나일론, 2.5mL 주사기, 면 봉합, 핀셋, 수술 가위, 8주 된 C57BL/남성 마우스 를 준비한다.</li>
	<li>1.5%의 이소플루란으로 마우스를 마취하고 1.5%로 유지합니다. 그런 다음 마우스의 복부에 디필 크림을 바부합니다. 몇 분 후, PBS에 흠뻑 젖은 실험실 닦아로 탈모 크림을 닦아.</li>
	<li>마우스의 복부 마우스에 70% 에탄올을 주입한 다음 마우스를 코르크 시트의 척추 위치에 놓습니다.</li>
	<li>외과 가위와 핀셋을 사용하여 복부의 피부에 절개를하고 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 아래 가장자리까지 근육과 복막을 잘라냅니다.</li>
	<li>마우스 아래에 2.5 mL 주사기를 놓습니다. 두 면 봉면을 가지고 PBS로 적신다. 핀셋으로 창자를 조심스럽게 옆으로 당기고 촉촉한 면봉을 적절히 배치하여 왼쪽 요관자를 식별합니다. 핀셋을 사용하여 왼쪽 신장을 들어 올립니다.</li>
	<li>4-0 실크를 사용하여 왼쪽 요관을 약 1cm 떨어진 두 곳에서 리게이트합니다. 두 결찰의 중심 지점에서 요소를 잘라 낸 다음 4-0 나일론 봉합사를 사용하여 회막과 절개를 닫습니다.</li>
</ol>3. 신장 샘플 의 수집
<ol><li>다음 준비: 1.5 mL 마이크로 센트심분리기 튜브, 이소플루란, 코르크 시트, 70% 에탄올, PBS를 곁들인 페트리 접시, 핀셋, 외과 가위.</li>
	<li>1.5%의 이소플루란으로 마우스를 마취하고 1.5%로 유지합니다. 복부에 70% 에탄올을 주입하고 마우스를 스핀 위치에 있는 코르크 시트에 놓습니다.</li>
	<li>외과 가위와 핀셋을 사용하여 복부의 피부에 절개를하고 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 아래 가장자리까지 근육과 복막을 잘라냅니다.</li>
	<li>핀셋으로 회막을 들어 올립니다. 외과 가위를 사용하면 회막의 상단 가장자리에 옆으로 절개를하고 갈비뼈의 가장 낮은 가장자리를 따라 절개를 계속합니다.</li>
	<li>다음으로, 왼쪽 신장을 확인하고, 신장이 혈관에서 혈액을 씻어 내기 위해 노란색 흰색으로 변할 때까지 PBS로 역류하고, 수술 가위로 왼쪽 신장 동맥과 정맥을 절단하여 신장을 제거합니다. 페트리 접시에 신장을 놓고 PBS로 조심스럽게 씻으시다.</li>
	<li>외과 가위와 핀셋으로 신장을 10 mg 샘플로 잘라냅니다 (10 mg은 다음 단계에 적합한 크기입니다). 신장의 각 조각을 자체 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브에 넣고 튜브의 캡을 닫습니다.</li>
	<li>각 미세 원심 분리기 튜브를 액체 질소로 옮기고 튜브를 -80 °C로 유지하여 사용하기 전에 장기 보관하십시오.</li>
</ol>4. 신장 샘플에서 총 RNA 추출
<ol><li>다음 품목을 준비하십시오: 1.5 mL 마이크로센트심심분리기 튜브, 2.0mL 마이크로센트심분리기 튜브, 100% 에탄올, 클로로폼, 실리콘 균질화, 얼음, 소용돌이 믹서, 바이오 폴리머 스핀 컬럼 2.0 mL 수집 튜브11,,12,멤브레인 고정 스핀 컬럼 2.0 mL 컬렉션 튜브12,,13,페놀 / 구니딘 기반 리시스 시약, 과니딘 과탄 을 함유 한 세척 완충제 (세척 완충제 1), 세척 완충제 (세척 완충제 1), 세척 완충제 (세척 완충제 1), 세척 완충제 (세척 완충제 1), 세척 완충제 (세척 완충제 1), 세척 완충제 (세척 완충제 1), 세척 완충제</li>
	<li>실리콘 균질화제에 10 mg 신장 샘플을 넣습니다. 페놀/구아니딘 기반 용해 시약의 700 μL을 균질제에 넣습니다.</li>
	<li>균질화를 준비한 다음, 균질화제의 봉제기를 신장 샘플에 대해 천천히 누르고 비틀어 샘플을 균질화합니다. 신장 샘플이 페놀/구아니딘 기반 용해 시약에 완전히 용해될 때까지 누르기/비틀기 반복합니다.</li>
	<li>시료를 균질화하기 위해 균질화된 용액(2.0mL 수집 튜브)을 생체 중합체 스핀 컬럼으로 이송한다.</li>
	<li>실온(RT)에서 3분 동안 14,000 x g에서 균질화된 용액을 회전한 다음 침전된 용액을 사용하지 않는 1.5mL 미세 원심 분리튜브로 옮긴다.</li>
	<li>튜브에 140μL의 클로로폼을 결합한 다음 튜브 캡을 단단히 닫습니다. lysate와 클로로폼을 혼합하려면 튜브를 15 번 반전시하십시오. 참고: 클로로폼은 후드 없이 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>각 샘플을 RT에서 2-3분 동안 배양한 다음 각 샘플을 12,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 회전시합니다.</li>
	<li>침전을 방해하지 않고, 새로운 1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브로 상체(일반적으로 ~300 μL)를 전송한 다음 100% 에탄올의 부피(일반적으로 ~450 μL)를 1.5배 추가한다. 5 s에 대 한 혼합물을 소용돌이.</li>
	<li>2.0mL 수집 튜브에서 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 시료의 700 μL을 적재합니다. 열 캡을 닫고 15s에 대해 15,000 x g로 열을 회전합니다. 수집 튜브에 침전 된 lysate를 버리십시오.</li>
	<li>2.0mL 수집 튜브에서 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 700 μL의 세척 버퍼 1을 추가하여 샘플을 철저히 세척하십시오. 열 캡을 닫고 15s에 대해 15,000 x g로 열을 회전합니다. 수집 튜브에 침전 된 lysate를 버리십시오.</li>
	<li>2.0mL 수집 튜브의 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 500 μL의 세척 버퍼 2를 적재하여 미량염을 제거합니다. 열 캡을 닫고 15s에 대해 15,000 x g로 열을 회전합니다. 수집 튜브에 침전 된 lysate를 버리십시오. 참고: 멤브레인 고정 스핀 컬럼은 RNA와 DNA를 분리할 수 있습니다.</li>
	<li>4.11 단계를 다시 수행합니다.</li>
	<li>멤브레인 고정 스핀 컬럼을 2.0 mL 수집 튜브에서 1분 동안 15,000 x g로 다시 회전합니다. 수집 튜브에 침전 된 lysate를 버리십시오.</li>
	<li>멤브레인 고정 스핀 컬럼을 새로운 1.5 mL 수집 튜브로 전송합니다. 컬럼에 RNase 가 없는 물의 30 μL을 추가하여 총 RNA를 용해하십시오. 열 한도를 닫고 실온에서 5분 기다립니다. 그런 다음 1분 동안 15,000 x g에서 열을 회전합니다.</li>
	<li>총 RNA를 포함하는 샘플의 총 량을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮는다. 각 튜브를 얼음에 넣고 분광광법에 의한 총 RNA의 농도를 측정합니다.</li>
	<li>사용하기 전에 장기 저장을 위해 샘플이있는 튜브를 -80 °C에서 보관하십시오.</li>
</ol>5. 총 RNA의 역 전사와 cDNA의 합성
참고: MIQE(양적 실시간 PCR 실험 의 출판을 위한 최소 정보) 지침은 더 나은 실험 관행을 장려하고 신뢰할 수 있고 명백한 결과를 얻는 데 도움이 되는가이드라인(19. 본 프로토콜에서, cDNA는 역전사, 폴리(A) 폴리머라제 및 올리고-dT 프라이머를 이용한 2단계 절차에서 정제된 총 RNA의 1.0 μg로부터 합성된다.
<ol><li>다음 준비: 1.5 mL 마이크로 센트심분리기 튜브, 캡이 있는 8웰 스트립 튜브, 각 8스트립 튜브의 캡, 증류수, 얼음, 역실제 키트(재료표참조)14,,15, 용융 상태의 열 사이클러 및 소용돌이 믹서.</li>
	<li>열 사이클러를 시작합니다.</li>
	<li>마스터 믹스 솔루션 준비: 역실사 믹스 2.0 μL(키트에 포함) 및 10배 핵산 믹스의 2.0 μL을 5배 의 5배 하이스펙 버퍼4.0 μL에 추가합니다(튜브당 총 8.0 μL 마스터 믹스를 얻습니다).</li>
	<li>마스터 믹스 용액의 8.0 μL을 8웰 스트립 튜브의 각 튜브에 넣습니다.</li>
	<li>총 RNA 밀도를 조정합니다. RNase 가 없는 물의 12 μL에서 신장 샘플로부터 총 RNA의 1.0 μg를 분리하기 위해, 4.15 단계에서 설명된 밀도 데이터를 사용하여 총 RNA를 증류수로 이송한다. 참고: DNA 오염이 있는 경우 오염된 DNA는 qRT-PCR에서 공동 증폭됩니다.</li>
	<li>각 튜브에 총 RNA의 12 μL 알리쿼트를 넣고 튜브의 캡을 닫습니다. 15 x튜브원심분리.</li>
	<li>튜브를 열 사이클러에 넣고 37 °C에서 60 분 동안 샘플을 배양하십시오. 다음으로, 즉시 cDNA의 합성을 위해 95°C에서 5분 동안 샘플을 배양한다.</li>
	<li>인큐베이션이 완료되면 cDNA를 새로운 1.5mL 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 증류수로 10회(1:10)를 희석시한다. 소용돌이와 원심분리기 튜브를 5초동안 분리합니다.</li>
	<li>희석된 cDNA를 얼음에 일시적으로 저장하고 시료를 -80°C로 이동하여 사용하기 전에 장기 보관합니다.</li>
</ol>6. miRNA의 qRT-PCR
참고 : 우리는 miRNA의 qRT-PCR을 수행하기 위해 인터칼레이터 방법을 사용했다. RNA를 위한 프라이머는 U6 소형 핵 2(RNU6-2), miRNA-3070-3p, miRNA-6401, miRNA-7218-5p, 및 miRNA-7219-5p를 사용되었다.
<ol><li>다음 준비: 1.5 mL 마이크로 센심 분리기 튜브, 소용돌이 믹서, qRT-PCR용 96웰 반응 플레이트, 96웰 반응 플레이트용 접착 필름, 접착 필름 어플리케이터, 96웰 원심분리기 로터, miRNA 특이프라이머, 실시간 PCR 기기, 그린 염료 기반 PCR 키트(재료의 표참조)14, 15개,프라이머 1,15개 보편형 PCR 용.</li>
	<li>1.5mL 마이크로센심심분리기 튜브에 혼합한 후, 증류수 6.25 μL, 5μM miRNA 프라이머 의 1.25 μL, 2× PCR 마스터 믹스, 10x 유니버설 프라이머의 2.5 μL 등 다음과 같은 항목을 소용돌이시다.</li>
	<li>5단계에서 설명된 대로 합성된 cDNA를 준비하고 녹입니다. 소용돌이와 원심분리기는 5s에 대한 cDNA를 분리합니다.</li>
	<li>96웰 플레이트의 각 웰에 시약(단계 6.2에 설명된 대로 작성됨)의 22.5 μL 알리쿼트(단계 6.2에 설명됨)를 넣습니다.</li>
	<li>플레이트의 각 웰에 cDNA의 2.5 μL 알리쿼트를 넣습니다.</li>
	<li>접착 필름 어플리케이터를 사용하여 96웰 플레이트에 접착제 필름을 단단히 고정하십시오. 30s용 1,000x g의 96웰 원심분리기 로터로 플레이트를 원심분리하여 각 웰의 하단에 있는 반응을 해결합니다.</li>
</ol>7. PCR 사이클링
<ol><li>실시간 PCR 시스템을 시작하고 6.6단계에서 설명한 대로 생성된 플레이트를 배치합니다. 실시간 PCR 시스템에서. 다음에 실험 속성을 설정합니다. 실험 이름을 식별합니다. 다음을 선택하십시오: 시스템의 실험 유형으로 "96-well(0.2 mL)", "비교 CT(ΔΔCT)"를 수량 방법으로, "SYBR 그린 시약"은 목표 시퀀스를 검출하기 위한 시약으로서, 그리고 시스템의 실행으로 "표준"을 선택한다.</li>
	<li>샘플 및 표적 miRNA에 이름을 할당한 다음 각각의 양상에서 샘플 및 표적 miRNA에 이름을 할당합니다. 결과를 확인하기 위해 적절한 데이터를 얻으려면 샘플을 중복으로 할당해야 합니다. 참조 샘플과 내인성 제어를 선택하고 수동 참조로 사용할 염료에 대해 "없음"을 선택합니다. 시약의 교차 오염을 제거하기 위해 miRNA 발현에 대한 음의 역전사 및 비템플릿 제어를 설정해야 합니다.</li>
	<li>반응 부피 설정이 "20 μL"이고 PCR 사이클링 조건이 15분 동안 95°C로 설정되고, 그 다음에는 94°C에서 40사이클의 데우라우가 15초이고, 55°C에서 30초, 연장이 30s에 70°C로 설정되어 있는지 확인한다.</li>
	<li>qRT-PCR 프로세스가 완료되면 시스템의 소프트웨어 프로그램을 사용하여 qRT-PCR 데이터를 분석합니다. 소프트웨어 프로그램에서 자동으로 선택되는 임계값 선이 각 웰에 적합한지 확인합니다.</li>
	<li>각 샘플에서 분석된 내인성 제어 및 표적 miRNA의 임계값(CT) 값을 확인합니다. CT 값은 증폭 곡선과 임계값 선의 교차점에 의해 결정됩니다. 본 연구에서는, RNU6-2를 표적 miRNA 발현 수준에 대한 내인성 대조군으로 사용했으며, ΔΔCT 방법을 사용하여 각 표적miRNA(20)의상대적 발현 수준을 결정하였다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

qRT-PCR을 사용하는 전술한 프로토콜은 표적 miRNAs의 발현 수준을 성공적으로 결정했습니다. 추출된 miRNAs의 평가는 의미 있는 qRT-PCR 데이터를 얻기 위하여 길들이기 위하여, qRT-PCR를 수행하기 전에 miRNAs의 질을 확인하기 위하여, 280 nm에서 그280 nm에 흡수의 비율을 분광광계로 검사되어야 합니다. 예상 길이및 용융 온도 또는 모노모달 용융 곡선의 단일 PCR 증폭이 qRT-PCR에 의해 얻을 수 없는 경우, 반응 플레이트의 각 웰에 DNA 오염 또는 프라이머 이크머가 있을 수 있다.
miRNAs의 발현 수준은 마이크로어레이, 북부 블로팅 및 ribonuclease 보호 분석 방법을 포함하는 qRT-PCR 이외의 여러 방법에 의해 평가될 수 있다. 그러나 qRT-PCR은 정확하고 민감하며, 북부 블로팅 및 리보누벨리스 보호어마어마(22)에비해 qRT-PCR에 더 작은 샘플 볼륨을 사용할 수 있는 간단...

MicroRNAs (miRNA) - 메신저 RNA (mRNA)1의 분해 및 전사 억제를 일으키는 짧은 비코딩 RNA -는 생리학 과 질병 (예를 들어, 염증, 섬유증, 대사 장애 및 암)에서 중요한 역할을하는 다양한 mRNA의 발현을 조절하는 것으로 나타났습니다. 일부 miRNAs는 따라서 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커 및2치료 대상이 될 수 있다2,3,,4,,5. 마우스 장기 및 뇌, 심장, 폐, 간 및 신장을 포함하는 조직에서 miRNA 발현 프로파일이6,7,,8,,9,,10을기재했지만 신장 간 섬유증을 가진 마우스 신장에서 miRNAs의 추출 및 평가를 위한 표준 방법이 없었습니다.6
우리는 신장 간질 섬유증을 가진 마우스의 신장에 있는 miRNAs의 표정을 안정적으로 정화하고 검출하기 위하여 프로토콜을 디자인했습니다. 프로토콜에는 다음과 같이 다섯 가지 주요 단계가 포함됩니다. (1) 8주 된 C57BL/6 수컷 마우스는 신장 간질 섬유증에 연결되는 일방적인 요관 방해(UUO)를 제공하는 수술을 받는 가짜 작동(대조군) 및 마우스의 그룹으로 나뉩니다. (2) 신장 샘플은 샴 과 UUO 마우스로부터 추출되고, 실리콘 균질화로 별도로 균질화한 다음, 마이크로센심분리기 스핀컬럼(11,,12)에바이오 폴리머 분쇄 시스템으로 이송된다. (3) miRNA를 함유하는 총 RNA는 실리카 막 계 스핀컬럼(12,,13)에의해 신장 샘플로부터 추출된다. (4) 이 추출된 총 RNA를 이용하여, 상호 보완적인 DNA(cDNA)는 역전사, 폴리(A) 폴리머라제, 및 올리고-dT 프라이머14,,15를사용하여 총 RNA로부터 합성된다. (5) miRNAs의 발현은 상호염료(14,,15)를이용하여 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응(qRT-PCR)에 의해 평가된다.
본 프로토콜은 다양한조직(11,12,,13,,14,,15)에서miRNAs의 의미 있는 추출 및 평가를 획득한 조사에 기초하여, 프로토콜에 사용된 생체 중합체 분쇄 시스템은 2006년조직으로부터고품질, 총 RNA를 정제하는 것으로 나타났다., 또한, 선행 연구는 계열염,14,15를갖는 qRT-PCR에 의한 miRNA 발현의 판정을 위해 프로토콜(즉, 역실래, 폴리(A) 폴리머라제 및 올리고-dT 프라이머를 갖는 cDNA 합성의 양태의 정확성 및 민감도를 확인하였다. 새로운 프로토콜은 단순성, 시간 절약 및 기술적 오류의 감소의 장점을 가지고 있기 때문에, 프로토콜은 마우스 신장에서 miRNA 프로필의 정확하고 민감한 식별을 필요로하는 연구에서 사용할 수 있습니다. 또한, 프로토콜은 많은 병리학 적 조건의 조사에 적용 될 수있다.
우리는 신장 간질 섬유증에 연결되는 UUO를 가진 마우스에 있는 miRNA 발현 단면도의 결정을 기술합니다. 인간에서, 신장 간질 섬유증은 그들의 병인학에 관계없이 만성 신장 질환과 말기 신장 질환 모두의 일반적이고 중요한 특징이다16,,17. 이러한 신장 간질 섬유증은 신부전의 진행과 관련이 있으며, 간질 공간에서 세포외 매트릭스 성분의 증가된 발현(예를 들어, 콜라겐, 섬유넥틴 및 α-부드러운 근육 액틴)을 특징으로 한다.17,18

<table><tbody><tr><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>세척 버퍼 2</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>세척 버퍼 1</td><td></td></tr><tr><td>Tokyo Laboratory Animals Science</td><td>할당</td><td></td><td></td>되지 않음</tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4316813</td><td>96웰 반응 플레이트</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>96웰 반응 플레이트</td><td></td></tr><tr><td>용 접착 필름Qiagen</td><td>MS00001701</td><td>5'-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3'Qiagen</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MS00065141</td><td>5'-UUACACUCCAGUGGUGUGGU-3'Qiagen</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MS00068067</td><td>5'-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG-3'Qiagen</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>MS00068081</td><td>5'-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGAGA-3'Qiagen</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>217004</td><td>멤브레인 앵커 스핀 2.0mL 수집 튜브</td><td></td>의 컬럼</tr><tr><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>역전사 효소 키트</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Green 염료 기반 PCR 키트</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>2.0mL 수집 튜브의 바이오폴리머 스핀 컬럼</td> Qiagen 79306 Phenol/guanidine 기반 용해 시약 Thermo Fisher Scientific 4472380 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Real-time PCR 기기</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>Real-time PCR 기기 소프트웨어</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>공개</td><td></td>되지 않음</tr><tr><td>Takara Bio</td><td>9790B</td><td>실리콘 균질화 ASKUL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GA04SW</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1</td><td>ER1004NA45-KF2,62 - 9968-32</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>년

일방적 인 요원 방해와 마우스 신장에서 microrna 표현의 정량적 실시간 pcr 평가

Quantitative Real-Time PCR Evaluation of microRNA Expressions in Mouse Kidney with Unilateral Ureteral Obstruction

MicroRNAs(miRNAs)는 mRNA의 번역 및 안정성을 감소시키는 메신저 RNA(mRNA)의 3'번역되지 않은 영역(UTR)에서 부분적으로 상호 보완적인 표적 부위에 결합하여 전사 후 수준에서 유전자 발현을 전형적으로 조절하는 단일 좌초, 비코딩 RNA 분자이다. 마우스의 다양한 장기 및 조직에서 miRNA 발현 프로파일을 조사하였지만 마우스 신장에서 miRNA의 정제 및 정량화를 위한 표준 방법은 제공되지 않았다. 우리는 정량적 역전사 폴리머라제 연쇄 반응 (qRT-PCR)에 의해 신장 간질 섬유증을 가진 마우스 신장에서 miRNA 발현을 추출하고 평가하기위한 효과적이고 신뢰할 수있는 방법을 설립했습니다. 프로토콜은 다섯 단계를 필요로: (1) 가짜와 일방적 인 요관 방해 (UUO) 마우스의 생성; (2) UUO 마우스로부터 신장 시료의 추출; (3) 신장 샘플에서 miRNA를 포함하는 총 RNA의 추출; (4) miRNA에서 역 전사를 가진 보완 DNA (cDNA) 합성; 및 (5) cDNA를 사용하여 qRT-PCR. 이러한 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 대조군과 비교하여, miRNA-3070-3p의 발현이 현저하게 증가되었고 miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p의 발현이 신장 간질 섬유증의 마우스 모델의 신장에서 현저히 감소되었다는 것을 확인했습니다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스의 신장에 있는 miRNA 발현을 결정하기 위하여 이용될 수 있습니다.

UUO 마우스 모델은 20-25g의 8주 된 수컷 마우스에서21에 설명된 바와 같이 왼쪽 요관 결찰에 의해 만들어졌습니다. 우레는 4-0 실크 봉합사로 더블 리그에 완전히 막혀 있었다. 진통제 (멜록시캠 5 mg/kg, 피하 주사) 수술 전과 수술 후 2 일 동안 매일 투여되었습니다. 수술 후 8일 동안 신장을 채취하고, PBS로 헹구고, 해부하고, 추가 분석을 위해 액체 질소에 저장하였다. 샴 작동 마우스는 대조군역할을 합니다. 왼쪽 신장에 수성 신증이있는 경우 이중 결찰이 성공합니다. 이러한 UUO 모델을 사용하여 얻은 miRNA qRT-PCR 데이터를 기반으로, miRNA-3070-3p의 수준이 크게 증가하여 miRNA-7218-5p 및 miRNA-7219-5p의 수준이 대조군(도1)에비해 UUO 마우스의 신장에서 상당히 감소하였다.
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우리는 양적 역전사 중합효소 연쇄 반응에 의해 일방적인 요원 방해(UUO)를 가진 마우스의 신장에서 마이크로RNA 발현을 평가하는 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 UUO를 가진 마우스에 있는 신장 microRNA 발현 단면도및 그밖 병리학 조건의 맥락에서 공부하기 에 적합합니다.

일방적 인 요원 방해와 마우스 신장에서 microRNA 표현의 정량적 실시간 PCR 평가

MicroRNAs (miRNAs) are single stranded, non-coding RNA molecules that typically regulate gene expression at the post-transcriptional level by binding to ...

이 방법은 신장 섬유증과 같은 광범위한 병리학 적 조건을 가진 마우스의 신장에서 microRNA 발현을 제공할 수 있게 합니다. 이 기술의 주요 장점은 시간을 절약하고 기술적 오류를 방지하는 간단한 프로세스를 사용하여 높은 정확도와 감도로 마이크로RNA 발현 프로파일링을 가능하게 한다는 것입니다. 가짜 수술을 수행하려면 외과 가위와 핀셋을 사용하여 복부의 피부에 절개를하고 방광에서 갈비뼈의 왼쪽 아래 가장자리까지 근육과 복막을 자른다.PBS로 두 면봉을 적시고 창자를 조심스럽게 옆으로 당깁니다. 왼쪽 신장과 요관을 식별하기 위해 촉촉한 면봉을 놓습니다. 회막을 닫은 다음 4-0 나일론으로 절개를 합니다.일방적인 요도 방해, 또는 UUO를 수행하기 위해 복부의 피부에 절개를하고 가짜 수술에 대해 입증 된 바와 같이 근육과 복막을 잘라냅니다. 마우스 아래에 2.5 밀리리터 주사기를 놓습니다. PBS로 두 면 봉기를 모은 다음 핀셋으로 창자를 조심스럽게 옆으로 당기고 면봉을 놓아 왼쪽 요관자를 식별합니다.핀셋을 사용하여 왼쪽 신장을 들어 올립니다. 4-0 실크를 사용하여 왼쪽 요관을 두 곳에서 약 1센티미터 떨어진 곳에 장식합니다. 두 결찰의 중심 지점에서 요관을 잘라 한 다음 4-0 나일론 봉합사를 사용하여 회막과 절개를 닫습니다.이전에 설명한 대로 회막을 절단한 후 핀셋으로 들어 올려 외과 가위를 사용하여 상단 가장자리에서 옆으로 절개를 한 다음 갈비뼈의 가장 낮은 가장자리를 따라 절개를 계속합니다. 왼쪽 신장을 확인하고 신장이 황백색으로 변할 때까지 PBS로 역류합니다. 왼쪽 신장 동맥과 정맥을 수술 가위로 절단하여 신장을 제거하고 페트리 접시에 넣은 다음 PBS로 조심스럽게 씻으신다.수술 가위와 핀셋으로 신장을 약 10밀리그램 샘플로 자르고 신장의 각 조각을 자체 1.5 밀리리터 미세 센트심분리기 튜브에 넣고 튜브의 캡을 닫습니다. 실리콘 균질화에 신장 샘플을 넣고 페닐 / 구아니딘 기반 용액 시약의 700 마이크로 리터를 추가합니다. 신장 샘플에 대해 균질화제의 봉헌을 천천히 누르고 비틀어 균질화합니다.샘플이 용해 시약에 완전히 용해 될 때까지 누르고 비틀기 반복합니다. 시료를 균질화하기 위해 균질화된 용재를 생체 폴리머 스핀 컬럼으로 옮기고 3분 동안 14, 000회 G로 회전한 다음 침전된 용액을 사용하지 않은 1.5밀리리터 미세원심분리튜브로 이송한다. 튜브에 140 마이크로리터의 클로로폼을 결합하고 튜브를 단단히 덮습니다.lysate와 클로로폼을 혼합하려면 튜브를 15 번 반전시하십시오. 실온에서 2~3분 동안 샘플을 배양한 다음 섭씨 4도에서 15분 동안 12, 000배 G로 회전합니다. 침전을 방해하지 않고, 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 상체를 전송하고, 100 % 에탄올의 1.5 배를 추가합니다.혼합물을 5초 동안 소용돌이시다. 2밀리리터 수집 튜브의 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 시료 700 마이크로리터를 적재합니다. 컬럼 캡을 닫고 컬럼을 15, 000회 G로 15초 간 돌린 다음 수집 튜브에 침전된 용액을 버리십시오.2밀리리터 수집 튜브의 멤브레인 고정 스핀 컬럼에 700 마이크로리터의 세척 버퍼를 추가하여 샘플을 철저히 세척하십시오. 그런 다음 원심 분리를 반복하고 수집 튜브를 버리십시오. 워시 당 2 개의 세척 버퍼 500 마이크로 리터로 두 번 세척을 반복하십시오.마지막 세척 후 멤브레인 고정 스핀 컬럼을 15, 000회 G에서 1분 동안 000회 회전하고 침전된 용액을 버리십시오. 멤브레인 고정 스핀 컬럼을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮킵니다. 총 RNA를 컬럼에 RNase 가 없는 물 30마이크로리터를 추가하여 녹이고 컬럼 캡을 닫고 실온에서 5분간 둡니다.그런 다음 1분 동안 15, 000회 G로 컬럼을 회전시합니다. 총 RNA를 함유한 샘플을 얼음 위에 새로운 미세원심분리기 튜브로 옮기고, 분광광법에 의한 총 RNA의 농도를 측정한다. 원고 방향에 따라 마스터 믹스 솔루션을 준비하고 8웰 튜브 스트립의 각 튜브에 8 개의 마이크로 리터를 추가하십시오.총 RNA 밀도를 조정한 후, 각 튜브에 총 RNA의 12 마이크로리터 알리쿼트를 배치하고 캡을 닫습니다. 튜브를 15초 동안 원심분리합니다. 튜브를 온도 순환기에 넣고 섭씨 37도에서 60 분 동안 배양하십시오.완료되면, 즉시 cDNA의 합성을 위해 섭씨 95도에서 5 분 동안 배양하십시오. cDNA를 새로운 1.5 밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 옮기고 증류수로 10회 희석합니다. 소용돌이와 원심분리기를 5초 동안 튜브에 대고 텍스트 원고에 설명된 대로 정량적 실시간 PCR을 수행합니다.이 프로토콜은 20~25그램의 8주된 수컷 마우스에서 좌측 요관 결찰을 통해 일방적인 요도 방해 마우스 모델을 만드는 데 사용되었다. 우레는 4-0 실크 봉합사로 더블 리그에 완전히 막혀 있었다. 신장은 수술 후 8 일 에서 수집되었다.microRNA qRT-PCR 데이터는 마이크로RNA 3070-3p의 수준이 현저하게 증가하고 마이크로RNA, 7218-5p 및 microRNA 7219-5p의 수준이 대조군과 비교하여 UUO 마우스의 신장에서 감소되었다는 것을 나타냈다. 이 프로토콜을 시도할 때, 좋은 RNA 추출을 달성하기 위하여 페닐/구아니딘 기지를 둔 용해 시약에 완전히 용해될 때까지 신장 견본을 비틀기 반복하는 것을 기억하십시오.

quantitative-real-time-pcr-evaluation-microrna-expressions-mouse

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

이 비디오는 편측 요관 폐쇄 마우스 모델을 생성하는 절차를 보여줍니다. 이 절차에는 소변 흐름을 막기 위해 마우스의 요관 중 하나를 절단하는 것이 포함됩니다.

편측성 요관 폐색 쥐 모델: 마우스 모델에서 신장의 소변 흐름을 막는 수술 절차

이 문서는 포르말린 고정 신장 섹션의 마이크로 RNA 발현 colormetric 검출에 최적화의 현장 하이브리드 프로토콜을 설명합니다.

마이크로 RNA<em&gt; 현장에서</em&gt; 포르말린 고정 신장 조직에 대한 하이브리드

비가역적 편측성 요관 폐색(unlateral ureteric obstruction, UUO)의 쥐 모델(murine model)은 절단된 요관을 방광으로 문합하여 요관 폐색이 완화되는 가역적 UUO 모델과 함께 제시됩니다. 이러한 모델은 신장 염증 및 흉터뿐만 아니라 조직 리모델링에 대한 연구를 가능하게 합니다.

돌이킬 수 및 가역 일방적 Ureteric 폐색의 쥐 모델

이 논문은 정량적 실시간 역전사 중합효소 연쇄 반응을 사용하여 급성 신장 손상 마우스 모델의 신장에서 microRNA 발현을 검출하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 허혈성 신장 손상 마우스 모델과 microRNA 샘플의 신중한 추출을 강조합니다.

허혈성 신장 손상 마우스 모델의 신장에서 MicroRNA에 대한 정량적 검출 방법

microRNA는 IgA 신병증의 발병기전에 관여합니다. 우리는 IgA 신병증 마우스 모델(HIGA 마우스)의 신장에서 microRNA 발현 수준을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 개발했습니다. 이 새로운 방법은 IgA 신병증에 대한 miRNA의 관여를 확인하는 것을 용이하게 할 것입니다.

면역글로불린 A 신병성 마우스의 신장에서 MicroRNA 발현 검출

우리는 정량적 역전사 중합 효소 연쇄 반응에 의해 연령 의존적 신장 손상이있는 마우스의 신장 및 혈청에서 microRNA 발현을 평가하는 방법을 제시합니다.

연령 의존적 신장 장애가 있는 마우스의 신장 및 혈청에서 MicroRNA 발현의 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응 평가

여기에서는 표면 사구체가있는 뮌헨 Wistar Fromter 쥐에서 2 광자 현미경을 사용하여 사구체 역학 및 기능에 대한 장기간의 요관 폐쇄의 영향을 정량화하는 프로토콜을 제시합니다.

2광자 현미경을 사용하여 만성 일방적 요관 폐쇄가 사구체 과정에 미치는 영향을 정량화

본 프로토콜은 편측 요관 폐색의 단계적이고 재현 가능한 모델을 설명합니다.

가역적 일방적 요관 폐색의 미성숙한 쥐 모델(An Immature Murine Model of Reversible Unilateral Ureteral Obstruction)

이 프로토콜은 폐쇄성 신병증에서 조직 섬유증의 진행을 연구하기 위해 마우스에서 편측 요관 폐쇄(UUO)를 유도하는 방법을 설명합니다. 여기에는 수술 절차, 수술 후 관리 및 섬유증 평가 방법이 포함됩니다.

신장 간질성 섬유증(Kidney Interstitial Fibrosis) 조사를 위한 일측성 요관 폐쇄 모델(Unilateral Ureteral Obstruction Model for Investigating Kidney Interstitial Fibrosis)

이 논문은 연구자가 장기간의 요관 폐쇄 후 장기적인 구조적 및 기능적 결과를 분석할 수 있는 표준화된 모델을 사용하여 마우스에서 가역적 편측 요관 폐쇄를 수행할 수 있도록 하는 자세한 지침을 제공합니다.

장기간의 일측성 요관 폐색의 역전 후 장기적인 구조적 및 기능적 결과를 평가하기 위한 마우스 모델

배우세요 마우스 신장에서 microRNA 발현을 정량적 실시간 PCR로 평가하는 방법을. 일방적 요관 폐쇄 모델을 활용하여 신장 섬유증 등 병리 상태에서 microRNA 프로파일링을 정확하고 민감하게 수행할 수 있습니다.

일방적 인 요원 방해와 마우스 신장에서 microRNA 표현의 정량적 실시간 PCR 평가

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