Name: 식물 MicroRNAs의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 41 s
Description: 학습하세요 식물 microRNA를 정밀하게 검출하고 정량화하는 RNA 블롯 분석법을 배우세요. 15% 아크릴아미드 겔을 사용하여 20-24 뉴클레오티드 길이의 소형 RNA를 고해상도로 분석하고 차세대 시퀀싱 데이터를 검증하는 방법입니다.

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저자는 방사선 동위 원소를 위한 호스트 연구소 및 BRIT에 의해 제공된 방사선 실험실에 접근을 인정합니다. PVS 실험실은 국립 생물 과학 센터, 기본 연구 및 보조금타타 연구소 (BT / PR12394 / AGIII / 103/891/2014; BT/IN/스위스/47/JGK/2018-19; BT/PR25767/GET/119/151/2017) 인도 정부 생명공학부. MP는 DBT 연구 준회원, DBT, 인도 정부를 인정한다.

1. 15% 데니링 폴리아크라이알라미드 젤 준비
<ol><li>무게와 우레아 4.8 g을 추가, 40 % 아크릴아미드의 3.75 mL을 추가 : 비사 크라이 라미드 (19:1) 용액과 멸균 50 mL 튜브에 10x TBE pH 8.2의 1 mL을 추가합니다.</li>
	<li>60°C에서 설정된 수조를 사용하여 우레아를 맑은 용액으로 녹입니다.</li>
	<li>신선 자동 살균수를 사용하여 10mL로 볼륨을 구성하고 젤 믹스를 실온으로 냉각시하십시오.</li>
	<li>신선한 10 % (w / v) 아황 산액을 준비하십시오.</li>
</ol>2. 유리 판 및 전기 전구 장치의 조립
<ol><li>젤 전기 포하 및 전기 블로팅에 필요한 모든 장치를 세제로 세척하십시오. 부드러운 스폰지를 사용하여 부드럽게 스크러빙하여 잔류 버퍼와 아크릴아미드를 제거하고 물로 헹구고 건조시키십시오.</li>
	<li>유리 판을 함께 조립하고 스폰지에 단단히 놓습니다. 이 설정에 1mm 두께의 플레이트를 사용합니다. 플레이트가 누출을 방지하기 위해 동일한 수준에 있는지 확인합니다.</li>
	<li>10mL 젤 믹스에 8 μL의 TEMED와 80 μL을 새로 준비한 10% (w/v) 아황 아황염 용액을 추가합니다.</li>
	<li>지체 없이 부드럽게 섞어서 조립된 유리 접시 사이에 붓습니다. 빗을 조심스럽게 놓습니다. 이 단계에서기포를 생성하지 마십시오.</li>
	<li>젤이 약 45분 동안 중합되도록 허용합니다.</li>
	<li>젤 러닝 셋업 내부에 넣기 전에 폴리머로 화된 젤을 멸균물로 씻으세요.</li>
	<li>러닝 카세트 안에 접시를 조립하고 빗을 부드럽게 제거합니다.</li>
	<li>갓 준비된 멸균 1x TBE, pH 8.2를 탱크에 붓습니다.</li>
	<li>버퍼를 파이프로 사용하여 우물을 조심스럽게 씻어 소금 결정을 제거합니다. 이 단계는 RNA 견본이 젤을 가로질러 균일하게 달리는 것을 돕습니다.</li>
	<li>30분 동안 80V에서 사전 실행을 수행합니다.</li>
</ol>3. 염색및 시료 적재 준비
<ol><li>젤 로딩 염료 10mL의 경우, 브로모페놀 블루 5 mg, 자일렌 시아놀 5 mg의 무게를 달고, 10mL의 탈이온화된 포름아미드를 조심스럽게 넣고 잘 섞는다.</li>
	<li>Aliquot 10 μg의 총 RNA를 멸균 1.5 mL 튜브로 넣고 스피드박을 사용하여 시료를 건조시킵니다. 샘플을 과도하게 건조시키지 마십시오.</li>
	<li>8 μL의 적재에서 RNA 샘플을 다시 중단합니다.</li>
	<li>샘플을 98°C에서 2분간 가열하고 RT, 소용돌이에서 1분 동안 식히고 샘플을 3회 회전시합니다. 이 단계는 적절한 재서스펜션에 필수적이며, 이는 시료를 동등한 로딩하는 데 도움이 됩니다.</li>
</ol>4. 겔 전기 전광
<ol><li>미리 실행을 중지하고 샘플 로딩하기 전에 우물을 세척합니다.</li>
	<li>샘플을 98°C에서 1분 동안 가열하고 모세관 팁을 사용하여 샘플을 우물에 뜨겁게 적재합니다. 팁이 우물 의 바닥에 삽입하여 샘플이 우물에서 하나의 얇은 층을 차지하도록 합니다.</li>
	<li>모든 샘플의 완전한 로딩. RNA 10년 마커를 로드하는 것을 포함한다.</li>
	<li>브로모페놀 블루 염료가 거의 완전히 실행될 때까지 80 V에서 젤을 실행합니다. 브로모페놀 블루는 아크릴아미드 젤을 15% 데니링하여 10bp로 주행합니다.</li>
</ol>5. 전기 블로팅 준비
<ol><li>N+나일론 멤브레인을 유리 판의 치수로 자르고 오른쪽 상단 모서리에 있는 멤브레인에 HB 연필로 라벨을 붙입니다.</li>
	<li>살균 수의 표면에 멤브레인을 부드럽게 놓고 라벨이 부착된 면을 수면쪽으로 향하게 합니다. 15 분 동안 멤브레인을 미리 흡수하십시오.</li>
	<li>섬유 패드의 치수에 나는 블로팅 종이 4 조각을 잘라.</li>
	<li>젤 샌드위치를 준비하여 카세트의 회색 면을 깨끗한 트레이에 놓습니다.</li>
	<li>섬유 패드를 미리 적시고 카세트 위에 놓습니다. 기포를 제거합니다.</li>
	<li>1x TBE에 1장의 블로팅 페이퍼를 미리 적시고 섬유 패드 위에 놓습니다. 플라스틱 파이펫을 종이 위에 굴려 기포를 제거합니다. 젖은 미리 젖은 얼룩지의 또 다른 조각을 놓고 기포를 제거합니다.</li>
	<li>조심스럽게 실행 카세트에서 젤을 제거하고 샌드위치 설정 위에 배치, 첫 번째로드 RNA 샘플이 오른쪽을 향해 있도록.</li>
	<li>미리 담근 멤브레인을 1x TBE에 부드럽게 담그고 젤 위에 놓고 라벨이 부착된 면을 아래로 향합니다. 기포를 제거하기 위해 밖으로 굴립니다.</li>
	<li>얼룩지는 종이 한 조각을 찍어 멤브레인 위에 놓고 기포를 제거합니다. 또 다른 블롯 페이퍼를 찍어 샌드위치 셋업 위에 놓고 기포를 제거합니다.</li>
	<li>미리 젖은 섬유 패드를 셋업 위에 놓고 카세트를 단단히 닫습니다.</li>
	<li>트랜스블롯 카세트를 모듈에 놓고 1배 TBE, pH 8.2를 블로팅 마크까지 채웁니다.</li>
	<li>10V에서 전송, 4 °C에서 하룻밤.</li>
	<li>전이 후, 젖은 멤브레인을 종이 시트에 놓고 254-nm UV 광 (120,000 μjoles/cm²)으로 조사하여 RNA를 멤브레인에 즉시 연결합니다. 교차 연결된 블롯은 추가 혼성화를 위해 4°C에 저장될 수 있습니다.</li>
</ol>6. 방사성 라벨 프로브 준비
<ol><li>검출될 작은 RNA에 완전히 보완되는 프로브를 설계한다.</li>
	<li>최종 레이블은 표 1에제공된 레시피에 따라 구성 요소를 결합하여 5'엔드에서 ƳP32ATP(BRIT에서 얻은)를 사용하여 프로브에 라벨을 부착합니다.</li>
	<li>위의 반응 혼합물을 37°C에서 30분 동안 배양한다.</li>
	<li>제조업체의 프로토콜에 따라 Sephadex G-25 열을 사용하여 레이블이 지정되지 않은 ƳP32ATP를 프로브에서 분리합니다.</li>
</ol>7. 블롯의 혼성화
<ol><li>교차 연결된 블롯을 배치, 하이브리드화 병 안에 상단을 향한 RNA 측.</li>
	<li>매우 민감한 혼성화 버퍼를 적극적으로 혼합하고, 10mL를 추가하고, 35°C에서 유지된 혼성화 오븐 내부에 블롯을 회전과 함께 배양한다.</li>
	<li>20분 동안 사전 혼성화를 수행합니다.</li>
	<li>오븐에서 병을 제거하고 레이블이 지정된 프로브를 하이브리드화 버퍼에 부드럽게 넣습니다.</li>
	<li>12시간 동안 회전하여 35°C에서 블롯을 혼성화합니다.</li>
	<li>혼성화 후 하이브리드화 용액을 15mL 튜브로 조심스럽게 이송한다. 이 용액은 재사용전까지 4°C로 저장할 수 있다.</li>
	<li>2x SSC 버퍼와 0.5% SDS를 추가하여 과도한 혼성화 용액을 제거하기 위해 2분 동안 블롯을 빠르게 세척합니다. 솔루션을 폐기합니다.</li>
	<li>2배 SSC 버퍼와 35°C의 0.5% SDS로 블롯을 배양하고 30분 동안 회전합니다.</li>
	<li>0.5배 SSC 버퍼와 0.5% SDS로 35°C의 회전을 30분 동안 세척합니다.</li>
	<li>블롯을 혼성화 커버 안에 놓고 여분의 버퍼를 제거하고 밀봉합니다.</li>
	<li>카세트 내부에 하룻밤 동안 방사선 프리 인광기 이미저 화면에 노출.</li>
	<li>생체 분자 이미저를 사용하여 혼성화 신호를 감지하고 적합한 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다.</li>
	<li>0.5 X SSC 버퍼 플러스 0.1% SDS 및 0.1 X SSC 버퍼 플러스 0.1% SDS 플러스 0.1% SDS 30 분 과 함께 30 분 동안 회전과 함께 80 °C에서 배양하여 얼룩을 제거합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Baulcombe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RNA silencing in plants.</a> Nature. 431, 356-363 (2004).</li>
<li>Anushree, N., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Plant+miRNA+Biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Indian+National+Science+Academy%22%5BJournal%5D)">Regulation of Plant miRNA Biogenesis.</a> Proceedings of the Indian National Science Academy. 95, (2017).</li>
<li>Narjala, A., Nair, A., Tirumalai, V., Hari Sundar, G. V., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+sequence+signature+is+essential+for+robust+plant+miRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A conserved sequence signature is essential for robust plant miRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. , (2020).</li>
<li>Chen, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((22-Nucleotide+RNAs+trigger+secondary+siRNA+biogenesis+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">22-Nucleotide RNAs trigger secondary siRNA biogenesis in plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 15269-15274 (2010).</li>
<li>Shivaprasad, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+superfamily+regulates+nucleotide+binding+site-leucine-rich+repeats+and+other+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A microRNA superfamily regulates nucleotide binding site-leucine-rich repeats and other mRNAs.</a> Plant Cell. 24, 859-874 (2012).</li>
<li>Shivaprasad, P. V., Dunn, R. M., Santos, B. A., Bassett, A., Baulcombe, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraordinary+transgressive+phenotypes+of+hybrid+tomato+are+influenced+by+epigenetics+and+small+silencing+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Extraordinary transgressive phenotypes of hybrid tomato are influenced by epigenetics and small silencing RNAs.</a> The EMBO Journal. 31, 257-266 (2012).</li>
<li>Akbergenov, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+geminivirus-derived+small+RNAs+in+different+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of geminivirus-derived small RNAs in different plant species.</a> Nucleic Acids Research. 34, 462-471 (2006).</li>
<li>Tirumalai, V., Swetha, C., Nair, A., Pandit, A., Shivaprasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR828+and+miR858+regulate+VvMYB114+to+promote+anthocyanin+and+flavonol+accumulation+in+grapes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">miR828 and miR858 regulate VvMYB114 to promote anthocyanin and flavonol accumulation in grapes.</a> Journal of Experimental Botany. , (2019).</li>
<li>Li, C., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Small+RNAs+by+Northern+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of Small RNAs by Northern Hybridization.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (8), (2018).</li>
<li>Swetha, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Major+domestication-related+phenotypes+in+indica+rice+are+due+to+loss+of+miRNA-mediated+laccase+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Major domestication-related phenotypes in indica rice are due to loss of miRNA-mediated laccase silencing.</a> The Plant Cell. , (2018).</li>
</ol>

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

이 방법은 덜 풍부한 miRNA를 포함하여 작은 RNA의 검출 및 정량화에 광범위하게 사용될 수 있습니다. 프로토콜은 주로 로딩 버퍼에서 총 RNA를 분해하는 단계를 설명하고, 겔 전기포에 의한 크기 분리, 멤브레인으로 RNA의 전달, RNA를 멤브레인에 교차 연결하고 원하는 방사성 표지된 올리고 프로브를 사용하여 혼성화한다.
모든 블로팅 실험에 대한 중요한 단계는 샘플 준비를위한 양질의 RNA를 사용하는 것입니다. 젤을 로드하기 전에 샘플이 자유롭게 흐르고 로딩 팁을 고수하지 않아야 합니다. 샘플을 로드하는 동안주의를 기울여야하며, 샘플이 우물에서 하나의 얇은 층을 차지되도록 팁은 우물 의 바닥 바로 위에 삽입해야합니다. 혼성화 오븐의 온도는 매우 덜 풍부한 miRNA의 검출을 위해 35 °C에서 유지되어야합니다. 블롯의 반복혼성화를 위해, 2배 SSC에서 축축함을 유지하여 멤브레인을 4°C로 저장하십시오.
이 방법은 다당류와 ...

작은 규제 RNA의 최근 발견, microRNA, 그(것)들을 이해하는 연구 및 식물과 동물에 있는 그들의 역할1을지도했습니다. miRNAs의 긴 전구체는 HYL1 및 특정 dicer 같이 단백질2,,3에의해 21 에서 24 nt 성숙한 miRNAs로 가공됩니다. 22 nt miRNA는 이차 siRNAs4를생성하여 캐스케이드 침묵을 시작할 수 있습니다. 연구 결과는 발달, 세포 운명 및 응력반응에서miRNAs 및 이차 siRNAs의 역할을 보여주었습니다5,6.
북부 혼성화는 특정 RNA 분자를 검출하기 위해 일상적으로 사용되는 실험 방법입니다. 이 방법은 총 RNA 7의 풀에서 약 19-24 nt 긴 작은 RNA의 검출에 그것의 사용을 사용자 정의한다. 이 데모에서는 miRNA의 검출 및 정량화를 위해 이 기술의 사용을 설명합니다. 이 방법은 방사성 동위원소를 사용하여 프로브의 라벨링을 사용합니다. 따라서, 샘플내의 miRNA 수준은 감도증가로 검출될 수 있다. PCR 기반 방법과 달리 이 메서드는 miRNAs의 크기 결정뿐만 아니라 식의 정량화를 보장합니다. 이 프로토콜에서는 miRNA 탐지를 개선하는 중요한 단계를 보여줍니다. 우리는 miRNA의 고해상도 신호 검출을 얻기 위한 블로팅 및 혼성화단계를 수정했습니다. 이 기술은 또한 siRNAs, 타시 보조 RNA 및 snoRNAs와 같은 그밖 내인성 작은 RNA를 검출하기 위해 사용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>40% 아크릴아미드-비스아크릴아미드 용액</td><td>시그마</td><td>A9926</td><td></td></tr><tr><td>과황산암모늄(APS)</td><td>BioRad</td><td>1610700</td><td></td></tr><tr><td>블로팅 페이</td>퍼 <td>Whatmann 블로팅 페이퍼 I</td><td>1001-125</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>시그마</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>모세관 로딩 팁</td><td>BioRad</td><td>2239915</td><td></td></tr><tr><td>탈이온화 포름아미드</td><td></td><td>Ambion AM9342</td><td></td></tr><tr><td>가열 블록</td><td>Eppendorff</td><td>5350</td><td></td></tr><tr><td>Hybond N+nylon 멤브레인</td><td>GE</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>하이브리드화 병</td><td>Sigma</td><td>Z374792-1EA</td><td></td></tr><tr><td>하이브리드화 오븐</td><td>Thermo Scientific</td><td>1211V79</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>Sigma</td><td>T7024-25ml</td><td></td></tr><tr><td>PhosphorImager</td><td>GE- 태풍 스캐너</td><td>29187194</td><td></td></tr><tr><td>PhosphorImager 화면 및 카세트</td><td>GE 헬스케어</td><td>GE28-9564-75</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Gilson, 모델: P20 및 P10</td><td>FA10002M, FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 피펫</td><td>Falcon</td><td>357550</td><td></td></tr><tr><td>폴리아크릴아미드 겔 장치</td><td>BioRad</td><td>1658003EDU</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 열</td><td>GE 헬스케어</td><td>27532501</td><td></td></tr><tr><td>Speed Vac Concentrator</td><td>Thermo Scientific</td><td>20-548-130</td><td></td></tr><tr><td>Spinwin</td><td>Tarsons</td><td>1010</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(PNK)</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>트랜스블롯 장치</td><td>BioRad</td><td>1703946</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAHyb 혼성화 완충액</td><td>Ambion</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>Fischer Scientific</td><td>15985</td><td></td></tr><tr><td>UV-가교제</td><td>UVP</td><td>CL-1000L</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Tarsons</td><td>3020</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>NEOLAB</td><td>D-8810</td><td></td></tr><tr><td>자일렌 시안올</td><td>시그마</td><td>X4126-10G</td><td></td></tr></tbody></table>

식물 micrornas의 검출 및 정량화를 위한 rna 블롯 분석

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

MicroRNAs(miRNAs)는 내인성 발현비의 클래스로, ~21nt 소형 RNA는 식물과 동물 모두에서 유전자 발현의 조절에 관여한다. 대부분의 miRNAs는 주요 유전자를 표적으로 하는 유전자 발현의 음성 스위치로 작동합니다. 식물에서, 1 차 miRNAs (pri-miRNAs) 전사체는 RNA 폴리머라제 II에 의해 생성되고, 그(것)들은 pre miRNAs에게 불린 안정한 줄기 루프 구조물의 다양한 길이를 형성합니다. 엔도누클레스, 디커 와 같은1, miRNA-miRNA * 이중으로 사전 miRNA를 처리합니다. miRNA-miRNA* 듀플렉스에서 가닥 중 하나가 선택되고 Argonaute 1 단백질 또는 그 동형로그에 적재되어 표적 mRNA의 분열을 중재합니다. miRNAs는 주요 신호 분자이지만, 그들의 검출은 수시로 민감한 북부 얼룩 분석 대신 최적 PCR 기지를 둔 방법에 의해 실행됩니다. 우리는 모든 식물 조직에서 매우 높은 감도로 miRNA 수준의 정량화에 이상적인 간단하고 신뢰할 수 있으며 매우 민감한 북부 방법을 설명합니다. 또한 이 방법을 사용하여 miRNAs 및 전구체의 크기, 안정성 및 풍부를 확인할 수 있습니다.

본 시연에서는, 인디카 라이스 바 화이트폰니(그림1)의다양한 조직에서 miR397의 표현을 검출하고 정량화하였다. miR397은 22 nt miRNA및 보존 된 miRNA입니다. miR397의 발현은 모든 테스트된 샘플에서 검출될 수 있다. 차세대 시퀀싱 데이터에 따라 샘플 1(모종 조직)은 miR397에서 백만(rpm)당 5개의 판독을 합니다. 우리는 그 신호를 편안하게 감지하여 방법이 매우 민감하고 매우 낮은 풍부한 miRNAs를 감지하는 데 사용할 수 있음을 나타냅니다. 이 실험에서는 miR168 및 U6을 로딩 컨트롤로 사용했습니다.
이 블롯(도1)에서는ImageJ를 사용하여 신호강도를 정량화시켰다. miR397의 발현은 식물성 잎 칼집에서 가장 높습니다.
<p class="jove_content" fo:keep...

이 방법은 전체 RNA 추출물로부터 miRNAs를 검출하기 위해 북부 혼성화 기술의 사용을 보여줍니다.

식물 MicroRNAs의 검출 및 정량화를 위한 RNA 블롯 분석

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

안녕. 그래서 이것은 작은 RNA 북부 프로토콜입니다. 그것은 원래 박사 라시드 Akbergenov에 의해 최적화 된 프로토콜의 파생.이 방법에서, 하나는 길이20-24 뉴클레오티드 사이의 작은 RNA의 어디에서나 검출할 수 있습니다, 아주 정밀하고 매우 높은 해상도. 프로토콜은 기본적으로 전통적인 북부 분석의 수정 된 형태이지만, 여기에 아크릴아미드의 비율은 매우 높다, 그것은 15 %. 이 북부는 이미 알려진 작은 RNA, 마이크로 RNA 또는 다른 작은 RNA 세트를 검출하는 데 사용될 수 있으며, 시퀀스가 알려지거나 차세대 시퀀싱 데이터 세트에서 나오는 작은 RNA의 풍부성을 확인하는 데 사용될 수 있다.이 방법의 장점은, 마이크로 RNA 풍부뿐만 아니라 전구체의 풍부도 볼 수 없다는 것입니다, 예를 들어 마이크로 RNA는 약 30 내지 수백 뉴클레오티드 길이일 수 있는 전구체를 남길 수 있고, 이것은 또한 마이크로 RNA와 함께 동시에 검출될 수 있다. 프로토콜은 매우 간단하고 매우 직선적이지만 이 프로토콜의 끝에 나열된 몇 가지 중요한 단계를 수행하는 동안 매우 신중해야 합니다. 10mL 젤 믹스를 준비하기 위해 4.8 그램의 우레아, 40 % 아크릴아미드 용액의 3.75 mL, 갓 준비된 10X TBE, pH 8.2를 넣고 부드럽게 혼합하십시오.용액이 명확해 보일 때까지 수조에 혼합물을 가열하여 우레아를 완전히 녹입니다. 멸균 밀리Q 물을 사용하여 10mL로 볼륨을 구성하고 실온으로 젤 믹스를 냉각시하십시오. 필요한 장치를 세제로 씻고 부드럽게 문질러 서완 TBE와 아크릴아미드를 제거하십시오.또한 밀리Q 물로 헹구고 건조시키십시오. 유리 판을 함께 조립하여 둘 다 동일한 레벨에 있는지 확인합니다. 스폰지에 단단히 놓습니다.8 마이크로 리터의 TEMED와 80 마이크로 리터의 10 % 갓 준비 된 APS를 젤 믹스에 추가합니다. 젤 믹스를 조립된 접시에 부드럽게 섞고 붓습니다. 젤이 누출되지 않도록 하십시오.빗을 조심스럽게 놓습니다. 젤이 약 45분 동안 중합되도록 허용합니다. 젤의 중합 후, 어셈블리에서 유리 판을 제거합니다.유리 판을 MilliQ 물로 씻으시면 됩니다. 그리고 실행 카세트에 배치합니다. 실행 중인 카세트를 탱크 내부에 놓습니다.새로 준비된 1X TBE, pH 8.2를 붓습니다. 빗을 조심스럽게 제거합니다. 버퍼를 피펫하여 젤의 우물을 철저히 씻으십시오.이 단계는 우물에서 우레아의 침전을 제거하고 RNA가 젤을 가로 질러 균일하게 실행되도록 완화합니다. 장치의 뚜껑을 닫고 빈 젤을 80 볼트에서 30 분 동안 미리 실행하여 버퍼 누설을 확인합니다. 10mL 로딩 염료를 준비하기 위해 브로모페놀 블루 5 mg, 자일렌 시안놀 5 mg의 무게를 달고 10mL의 디오이니화 포름아미드를 넣고 잘 섞는다.염료를 알리쿼트하고 추가 사용을 위해 4도에 보관하십시오. Aliquot 10 멸균 1.5 mL 튜브에 총 RNA의 마이크로 그램. RNA의 품질, 즉 확인하십시오.260:230 비율은 2보다 크거나 두 개에 가깝습니다. 튜브를 speedVac 내부에 놓고 샘플을 진공 건조시킵니다. 건조 된 RNA 샘플을 8 마이크로 리터의 적재 염료로 다시 중단합니다.샘플을 98도에서 2분간 가열합니다. 실온에서 1분 동안 식힙니다. 냉각된 RNA 샘플을 소용돌이로 하여 적재염에 적절한 재서스펜션을 보장합니다.튜브를 회전합니다. 무료 흐르는 RNA를 얻기 위한 3회 동안 가열, 냉각 및 소용돌이의 단계를 반복하십시오. 젤의 사전 실행을 중지합니다.우물 내부의 우레아의 퇴적물을 제거하기 위해 샘플을적재하기 전에 우물을 철저히 씻으십시오. 다시 중단된 RNA 샘플을 98도에서 1분간 가열합니다. 모세관 팁을 사용하여 샘플을 우물에 뜨겁게 적재합니다.기포를 도입하지 마십시오. 모든 샘플을 완벽하게 적재하고 뚜껑을 조립합니다. 젤을 80볼트에서 3시간 동안 또는 브로모페놀 블루가 완전히 실행될 때까지 실행합니다.이송에 양전하 나일론 멤브레인을 사용하십시오. 유리 판의 치수로 잘라. 오른쪽 상단 모서리에 멤브레인에 라벨을 부착합니다.살균 밀리큐 물 표면에 멤브레인을 부드럽게 배치하여 라벨 측면을 물 표면을 향하여 아래쪽으로 놓습니다. 깨끗한 트레이를 가지고 전기 전송젤 샌드위치를 준비합니다. 카세트의 회색 면을 아래로 놓습니다.카세트 의 수준 보다 약간 높은 1X TBE를 붓습니다. 섬유 패드를 1X TBE로 미리 적시고 짜서 기포를 제거합니다. 버팅 페이퍼 2장을 섬유 패드 크기로 자른다.1X TBE에 블로팅 페이퍼 를 미리 적시고 섬유 패드 위에 놓습니다. 플라스틱 파이펫을 종이 위에 굴려 기포를 제거합니다. 1X TBE에 또 다른 블로팅 페이퍼를 미리 적시고 카세트 위에 놓습니다.기포를 제거하기 위해 롤오버합니다. 이제 샌드위치 설정이 전기 전송을 위한 준비가 되었습니다. 전기 전도가 완료 된 후, 실행을 중지하고 장치에서 뚜껑을 제거합니다.설정에서 실행 중인 카세트를 제거합니다. 달리는 카세트에서 유리 판을 꺼내십시오. 조심스럽게 조립에서 젤을 제거합니다.첫 번째 로드 된 RNA 샘플이 오른쪽쪽으로 있도록 얼룩종이 위에 놓습니다. 미리 담근 멤브레인을 1X TBE에 부드럽게 담그고 젤 위에 놓고 라벨이 부착된 면을 아래로 향합니다. 멤브레인과 젤이 건조되는 것을 허용하지 마십시오.부드럽게 롤오버하여 기포를 제거합니다. 1X TBE에 얼룩진 종이 한 조각을 찍어 멤브레인 위에 놓습니다. 기포를 제거합니다.다른 조각을 얼룩지는 종이를 놓고 기포를 제거합니다. 조립에 섬유 패드를 놓고 샌드위치를 완료합니다. 카세트를 단단히 닫습니다.모듈에 트랜스 블롯 카세트를 배치합니다. 탱크를 1X TBE, pH 8.2로 채우고 블로팅 마크까지. 장치의 뚜껑을 닫고 4도 또는 차가운 방에서 하룻밤 사이에 10 볼트로 옮춥습니다.UV 크로스 링커를 준비 상태로 유지하고 전기 전달이 완료되기 직전에 1200으로 설정합니다. 전송이 완료된 후 모듈에서 카세트를 제거합니다. 젖은 멤브레인을 A4 시트에 놓고 표시된 면을 위쪽으로 놓습니다.120 밀리 주에서 254 나노 미터 UV 빛으로 조사하여 RNA를 멤브레인에 교차 연결합니다. 교차 연결된 블롯은 4도에서 저장되거나 혼성화에 사용될 수 있다. 검출해야 하는 작은 RNA에 완전히 무료프로브를 설계한다.PNK 효소를 사용하여 5개의 프라임 엔드에서 프로브를 최종 라벨로 표시하고 표시된 대로 구성 요소를 결합합니다. 반응 혼합물을 37도에서 30분 동안 배양합니다. 30분 동안 배양한 후 G-25 컬럼을 사용하여 표지되지 않은 프로브를 반응 혼합물과 분리합니다.프로브의 라벨을 개선하면 사용하기 전에 G-25 열을 준비하십시오. 블롯, RNA 측을 위쪽으로 향하여 혼성화 병 안에 놓습니다. 사용하기 전에 하이브리드화 버퍼를 적극적으로 혼합합니다.10mL의 혼성화 버퍼를 내부에 추가하고 혼성화 오븐 내부에 혼성화 병을 배치하고 회전시 35도에서 유지합니다. 20~30분 동안 사전 혼성화를 수행합니다. 사전 혼성화 후 오븐에서 병을 제거합니다.레이블이 표시된 프로브를 하이브리드화 버퍼에 부드럽게 추가합니다. 기포가 생성되지 않았는지 확인합니다. 오븐 내부의 블롯을 35도에서 12시간 동안 회전하여 배양합니다.혼성화 후 병에서 혼성화 버퍼를 제거합니다. 워시 버퍼-I를 사용하여 블롯을 빠르게 세척하십시오. 이 단계는 슬롯에서 과도한 혼성화 용액을 제거하기 위해 수행됩니다.세척 버퍼-I를 사용하여 30분 동안 35도에서 블롯을 추가로 배양합니다. 30분 동안 35도에서 완충II를 사용하여 또 다른 세척을 수행합니다. 블롯을 세척한 후 혼성화 커버 안에 놓고 여분의 버퍼를 제거하고 밀봉합니다.카세트 안에 놓고 12 시간 동안 방사선 없는 인인- 이미저 화면에 노출시세요. 태풍 생체 분자 이미저를 사용하여 혼성화 신호를 감지하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석합니다. 다른 프로브와 블롯의 혼성화를 위해 그림과 같이 제거 단계를 수행합니다.이 기술로 마이크로 RNA의 풍부뿐만 아니라 길이를 추정 할 수 있습니다. 이 이미지로부터, 마이크로 RNA(397)의 발현은 모든 샘플에서 검출될 수 있다. 이 블롯에서, 샘플 하나의 풍부는 백만 당 약 5 읽기, 차세대 시퀀싱 데이터에 따라, 우리의 기술도 덜 풍부한 마이크로 RNA를 감지 할 수 있음을 시사.또한 ImageJ 정량화 소프트웨어를 사용하여 샘플 중 마이크로 397의 발현을 정량화할 수 있다. 여기에서 우리는 적재 제어로 U6 및 마이크로 RNA 168을 사용했습니다. 나는 실험을 수행하는 동안 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계에 대해 이야기 할 것입니다.샘플 준비를 위해 양질의 RNA를 사용해야 합니다. 진공 건조 시 료를 건조 하는 동안, 그들을 건조 이상 하지 마십시오. 로딩 염료에서 RNA의 재현탁은 매우 중요합니다.흐르는 무료 샘플을 준비하십시오. 젤을 적재하는 동안주의를 기울여야 합니다. 젤의 우물은 세척해야하며 샘플은 우물 내부의 직선으로로드해야합니다.전기 전이 중, 물에 멤브레인의 확산, 1X TBE에 담그기 직전에 필수적이다, 그것은 전송을 향상시킨다. 블롯의 혼성화는 35도에서 수행해야 합니다. 혼성화 오븐의 온도를 유지합니다.얼룩을 반복적으로 사용하려면 멤브레인을 4도에 저장해야합니다. 그들은 2 배 SSE에 습기를 유지해야합니다. 다른 PCR 기반 방법과 달리,이 방법은 마이크로 RNA의 크기의 결정뿐만 아니라 식의 정량화를 보장합니다.

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