Name: 인체 유발 만능 줄기 세포에서 유도 된 체외 신경 근육 정션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 1 s
Description: 학습하세요 인체 유발 만능 줄기 세포에서 체외 신경 근육 정션을 생성하는 방법을. 이 프로토콜은 성숙한 NMJ를 한 달 내에 형성하여 신경근 질환 모델링과 약물 스크리닝에 활용할 수 있습니다.

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사쿠라이 박사에게 201B7MYOD를친절하게 제공해 주셔서 감사합니다. 전자 현미경 연구는 오카모토 후루타 게이코와 코다 하루야스 (전자 현미경 연구 부문, 해부학 연구 센터, 교토 대학 의과 대학)에 의해 지원되었다. 단일 클론 항체는 HHMI /컬럼비아 대학에 의해 개발되었다, 개발 연구 하이브리드 종 은행에서 얻은, NIH의 국립 연구소 아동 건강 및 인간 개발에 의해 생성, 생물학의 학과에서 유지, 아이오와 대학. 또한 오시마 시오리, 나카가와 가즈히로, 마쓰이 에리코에게 모션 벡터 분석을 감사드립니다. 이 작품은 일본 과학진흥협회, 교부금 번호 16H05352 및 20H03642(MKS)의 자금 지원을 통해 지원되었습니다. iPS 세포 연구 기금 (CYL 및 MKS); 의료 및 제약 연구를위한 모치다 기념 재단 (MKS; 다케다 과학 재단 (MKS; 일본 의학연구개발처(17935400 ~17935400 ~17935400~17935423 ~17935423~MKS)의 지원을 받은 질병별 iPS 세포를 활용한 난치성 질환 연구 프로그램 보조금이 수여되었습니다.

1. 세포 외 매트릭스 (ECM) 코팅 플레이트의 준비
<ol><li>얼음 차가운 1x PBS로 ECM(재료표참조)을 최종 농도2%로 희석합니다.<ol>
<li>50mL 플라스틱 튜브에 1x PBS의 49mL에 ECM 1mL를 추가합니다. 여러 번 위아래로 파이프를 통해 잘 섞으세요.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6웰 플레이트의 각 웰에 1 개의 커버 슬립을 놓습니다. 각 웰에 2% ECM의 1.5mL를 추가합니다.</li>
	<li>37°C에서 2시간 동안 2% ECM로 웰 플레이트를 배양한다.</li>
	<li>웰 플레이트에서 ECM을 흡입하고 사용하기 전에 4 °C에서 플레이트를 저장합니다.</li>
</ol>2. NMJ를 향한 iPSC의 차별화
<ol><li>종자 4 x 105 iPSC의 잘 섹션 1에 준비 된 6 웰 플레이트에. 우물에 미리 증착 된 커버 슬립에 세포를 시드해야합니다. 참고: 이 연구에서는 사쿠라이 박사의 연구실에서 선물한 201B7MYOD iPS세포주(15)를사용했습니다.<ol>
<li>6cm 배양 접시에 iPSC에서 매체를 제거하고 1x PBS로 한 번 iPSC를 세척합니다.</li>
		<li>접시에 세포 분리 용액 1mL을 추가하고 37 °C에서 10 분 동안 배양하십시오.</li>
		<li>접시에 영장류 배아 줄기 (ES) 세포 배지 3 mL을 넣고 부드럽게 3 번 넣습니다.</li>
		<li>분리된 iPSC를 포함하는 상체를 50mL 플라스틱 튜브와 원심분리기의 160 x g에서 4°C에서 5분 동안 수집합니다.</li>
		<li>수퍼네티드를 신중하게 흡습하고, 10 μM Y27632로 3mL 영장류 ES 세포 배지에서 iPSC를 재보중단하고, 혈류계를 사용하여 세포 수를 계산한다.</li>
		<li>영장류 ES 세포 배지및 10 μM Y27632를 2 x 105 셀/mL의 농도로 iPSC를 희석시. 섹션 1에 설명된 우물에 미리 기탁된 커버슬립에 iPSC 2mL를 추가합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NMJ에 iPSC의 유도<ol>
<li>1일째, 24h는 iPSC를 6웰 플레이트에 시드한 후 배양 배지를 제거하고 각각 1 μg/mL 독시클린을 함유한 신선한 영장류 ES 세포 배지 2mL로 교체한다.</li>
		<li>근생 분화 배지(MDM)의 2mL(MDM)(표1)로매질을 각각 양호하게 1 μg/mL 독시클린(최종 농도)을 함유한다. 매일 2일부터 10일까지 매디지리를 새로 고칩니다.</li>
		<li>11일부터, 중간을 NMJ배지(표 1)의2mL로 각각 양으로 전환한다. 30일까지 3\u20124일마다 배지를 새로 고칩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30일째에 단계 반전 현미경검사법에 의해 분화된 NMJ를 관찰한다. NMJ는 다음 분석에 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>3. 면역 형광 (IF) 염색
<ol><li>30일째에, 6웰 플레이트에서 배양 배지를 흡인한다. 실온에서 30분 동안 각 웰에 4% 파라포름알데히드의 2mL를 추가하여 NMJ 문화를 수정합니다.</li>
	<li>각 웰(각 세척당 3분)에 1x PBS 2mL을 추가하여 샘플을 3회 세척합니다.</li>
	<li>10 분 동안 0.1 % 트리톤 / PBS로 샘플을 permeabilize.</li>
	<li>3.2 단계를 반복합니다.</li>
	<li>실온에서 1시간 동안 0.5%의 BSA로 샘플을 차단합니다.</li>
	<li>3.2 단계를 반복합니다.</li>
	<li>하룻밤 사이에 4°C에서 1차 항체로 샘플을 배양한다. 항체의 희석은 다음과 같습니다: 아일렛 1 (1 μg/mL), myosin 무거운 사슬 (MYH) (1/300), 신경 필라멘트 (NF) (1 μg/mL), S-100 (1/300), 시냅스 소포 단백질 2 (SV2) (1 μg/mL), Tuj11(10).</li>
	<li>3.2 단계를 반복합니다.</li>
	<li>1시간 동안 실온에서 이차 항체로 샘플을 배양한다. 사용되는 이차 항체의 농도는 다음과 같습니다: 항마우스 IgG 488 공주(0.1 μg/mL), 안티래빗 IgG 488 공주(0.1 μg/mL).</li>
	<li>3.2 단계를 반복합니다.</li>
	<li>AChR 염색을 위한 aBTX-647(0.5 μg/mL)과 핵 염색을 위한 DAPI(1 μg/mL)로 샘플을 배양한다.</li>
	<li>3.2 단계를 반복합니다.</li>
	<li>6웰 플레이트의 집게로 커버슬립을 집어 들고 현미경 슬라이드에 50% 글리세롤/PBS 용액에 장착합니다.</li>
</ol>4. 전자 현미경 검사 (SEM)
<ol><li>NMJ 배양을 4% 파라포름알데히드와 1%의 글루타랄데히드로 1시간 동안 실온에서 0.1M 칼륨 인산염 버퍼로 제조하였다.</li>
	<li>실온에서 0.1M 칼륨 인산염 버퍼에 침지하여 샘플을 3번 세척하십시오(각 세척당 10분).</li>
	<li>에탄올의 상승 농도로 샘플을 탈수 (50%, 70%, 90%, 95%, 100% 두 번). 에탄올의 각 농도에 샘플을 10 분 동안 담그면 하십시오.</li>
	<li>임계 점 건조기 (-30 °C, 0.1 토르)로 샘플을 건조.</li>
	<li>Pt(플래티넘) 이온 코터(3분 동안 30mA, Pt두께는 약 20nm)로 샘플을 코팅합니다.</li>
	<li>5 kV에서 SEM에 의해 샘플을 관찰한다.</li>
</ol>5. 전염 전자 현미경 검사법 (TEM)
<ol><li>세포 스크레이퍼를 사용하여 NMJ 배양 판에서 조직을 수확하십시오. 작은 펠릿 (3mm3)로조직을 면도날과 젤레이션에 의한 접착제로 모양을 만들어 젤로 감싼 조각을 형성합니다. 겔 로 싸인 조각을 2% 파라포름알데히드와 2% 글루타랄데히드로 고정하여 하룻밤 사이에 0.1M 칼륨 인산염 버퍼로 준비합니다.</li>
	<li>실온에서 0.1M 칼륨 인산염 버퍼(각 세척당 15분)에 침지하여 시료를 3회 세척합니다.</li>
	<li>실온에서 1시간 동안 이중 증류H2O로제조된 1% 오스뮴 테트산화물으로 샘플을 후정합니다. 주의: 이 단계는 화학 적 후드에서 수행해야합니다.</li>
	<li>5.2 단계를 반복합니다.</li>
	<li>에탄올의 상승 농도로 샘플을 탈수 (50%, 70%, 90%, 95%, 100% 두 번). 에탄올의 각 농도에 샘플을 10 분 동안 담그면 하십시오.</li>
	<li>100% 에탄올을 흡인합니다. 에폭시 수지의 상승 부피 비율로 시료에 침투하여 100% 에탄올 혼합물(1:3, 1:1 및 3:1). 각 혼합물을 실온에서 1시간 동안 10rpm에서 부드럽게 교반합니다.</li>
	<li>에폭시 에탄올 혼합물을 순수한 에폭시 수지로 대체하고 실온에서 4 시간 동안 10 rpm에서 부드럽게 동요하십시오.</li>
	<li>4 시간 후, 신선한 에폭시 수지로 에폭시 수지와 함께 새로 고침하고 실온에서 하룻밤 10 rpm에서 부드럽게 동요합니다.</li>
	<li>신선한 에폭시 수지와 캡슐을 포함 캡슐에 샘플을 포함하고 하룻밤 65 °C에서 오븐에서 샘플을 치료.</li>
	<li>초미세 절제술<ol>
<li>올바른 방향을 위해 해부 현미경으로 샘플 블록을 거칠게 다듬습니다.</li>
		<li>굵게 손질된 블록을 초미세토메에 유리 칼로 미세하게 다듬어 매끄러운 표면을 얻습니다.</li>
		<li>다이아몬드 나이프로 잘 손질된 블록에서 70nm 초박형 섹션을 준비합니다. 200 메쉬 탄소 폼바 코팅 구리 그리드와 초박형 섹션을 검색합니다.</li>
		<li>포화 우라일 아세테이트가 함유된 초박형 섹션은 30분 동안 이중 증류H2O로 제조하고 더블 증류H2O(각세척당 10분)로 그리드를 3번 세척합니다.</li>
		<li>또한, 초박형 섹션을 레이놀드의 납 구연산 19(2.5%)와 대조합니다.19 5 분 동안 삶은 H2O로 씻어 3 번 (각 세척당 10 분)으로 미리 냉각됩니다. 섹션에 CO2 강수량을 방지하기 위해 염색 영역 주위에 여러 개의 수산화 나트륨 펠릿을 넣습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>70 kV에서 TEM에 의해 초박형 섹션을 관찰하십시오.</li>
</ol>6. 근육 수축 및 큐레어 치료
<ol><li>심피튜브 수축을 트리거하려면 2.3단계에서 배양 배지에 25mM CaCl2를 추가합니다. myotube의 움직임은 1\u20122 분에서 관찰 할 수 있습니다.</li>
	<li>반전 된 현미경의 무대에 6 웰 플레이트를 놓습니다. 라이브 셀 현미경 검사법에 의한 myotube 수축 의 영화를 기록합니다.</li>
	<li>심오튜브 수축을 중지하려면 배양 배지(300 ng/mL)에 큐라레를 추가합니다. 그런 다음 영화를 6.2 단계로 기록합니다.</li>
	<li>모션 벡터 분석 소프트웨어로 동영상 파일을 연다음 모션 분석 버튼을 클릭하여 동영상을 분석합니다. 참고: myotube 수축은 시간 동작 그래픽으로 표시됩니다. 영화는 myotube의 이동 속도를 보여주기 위해 색상으로 구분됩니다. 색상으로 구분된 반짝이는 신호는 붉은 색이 가장 빠른 움직임 속도를 나타내고 파란색이 가장 느린 이동 속도를 나타내는 myotubes의 움직임을 나타냅니다.</li>
</ol>

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</ol>

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이전 연구는 장기 문화를 필요로하는 정교한 방법으로 시험관내 NMJ 형성을위한 방법을보고8,,10, 12,,12,13,,20. 이러한 성과는 시험관 내 NMJ의 진행을 이끌고 있습니다. 그러나 복잡한 방법론은 NMJ 연구의 접근을 방해했습니다. 당사의 프로토콜은 단일 웰에서 NMJ를 효율적이고 강력하게 생성하기 위해 공동 배양을 방지합니다. NMJ내의 3가지 세포 유형은 심오튜브, 운동 뉴런 및 슈완세포(18)를포함한 우리의 유도 시스템에서 관찰되었다. 또한 성숙한 형태와 기능이 검증되었습니다.
우리의 이전 연구에 기초하여, 초기 세포 밀도는 NMJ 형성을 위한 중요한 인자이고, 상이한 세포 밀도는배양18에서다양한 수의 NMJ를 유도한다. 낮은 세포 밀도(&1 x410 4/cm2)는 NMJ 형성에 불리한 낮은 수의 뉴런을 유도하였다.2 더 높은 세포 밀도(> 1 x 105/cm2)를준비하는 데는 훨씬 더 많은 시간과 자원이 걸리지만, 당사의 프로토콜을 사용하여 세포 밀도가 1.5 x 104/cm2와 5 x 104/cm2 사이가 되는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에 의해 생성된 NMJ는 생리적 조건을 모방하는 것에 가까운 다중 세포 모형을 가진 이기종 조직입니다. myotube는 문화 접시에 균등하게 분배하는 것으로 발견되지만 모터 뉴런은 무작위로 나타나며, 그 현상은 문화에서 NMJ의 고르지 않은 분포를 초래합니다. 이 NMJ는 균일한 배양 시스템을 요구하는 분석 대신 질적 연구에 적합합니다. 우리는 또한 다른 세포주, eq., H9 (ES 세포주)18 및 A11 (iPS 세포주, 도시되지 않은 데이터)를 이 프로토콜에 의해 NMJ를 생성했습니다. NMJ는 형태학 및 기능에서 성공적으로 생성될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 배양 상태는 다른 세포주를 위해 최적화되어야 합니다.
화학적으로 촉발된 심오튜브 수축 및 큐레에 의존하는 억제는 우리의 시험관 NMJ가 기능적이고 잠재적으로 실용적인 분석을 위해 적용될 수 있다는 것을 확인했습니다. 자발적인 근육 수축은 3\u20124 주 문화권에서 무작위로 관찰되었지만 문화 시간을 2개월18개월로연장하여 피할 수 있었다.
다양한 성숙 단계의 시험관 NMJ를 생성하기 위한 다양한 전략이 발표되었지만, 우리 시스템에서 생성된 시험관 NMJ는 문화18시 AChR의 epsilon 하위 단위로 감마의 전환을 관찰할 수 있기 때문에 상당한 성숙도를 보였다. 성숙도는 시험관 내 NMJ21을가진 질병 모델링을 위한 중요한 고려 사항입니다. 결론적으로, 통합 된 구조 구성 요소, 성숙 및 기능을 갖춘 시험관 내 NMJ는 치료 개발을위한 잠재적 인 사용입니다.

신경근육 접합(NMJ)은 모터 뉴런에서 골격 근육으로 신호를 전송하여 자발적인 근육 운동1,2를2제어하는 전문 시냅스입니다. 이 시냅스는 시냅스 전 및 시냅스 후 부분으로 구성됩니다. 시냅스 전 부분에서, 모터 뉴런은 외세포증에 의한 시냅스 소포로부터 아세틸콜린(ACh)을 방출한다. ACh는 시냅스 갈라진 부분을 교차하고 시냅스 후 부분에 AChR에 결합하여 근육 수축3,,4에대한 작용 잠재력을 유발하기 위해 시냅스 소포에서 방출된다. 이 섬세한 구조의 오작동은 척추 근육 위축 (SMA), 선천성 근상 증후군 (CMS), 근상증 (MG)5,6,6,7등을 포함하여 NMJ 질병을 일으킬 수 있습니다. 이 질병은 환자의 삶의 질을 크게 손상시키고 불행히도 병리학 적 메커니즘을 이해하지 못하기 때문에 효과적인 치료 접근 법이 없습니다. 이 연구에서는, 정확한 질병 모델링및 치료 화합물 검열을 위한 인간 iPSCs에서 체외 인간 NMJ를 생성하는 것을 목표로 했습니다.
이전 연구는 공동 문화 전략에 의해 시험관 NMJ에서 생성의 가능성을 입증했다. 운동 뉴런과 골격 근투는 각각 생성됩니다. 2개의 세포 모형은 인간 또는 마우스 1차 조직 배양에서 생성될 수 있거나 줄기 세포8,,9,,10,,11에서 유도된 다음 NMJ 형성을 위해 공동 배양될 수 있다. 추가 적용은 공동 배양된 NMJ를 미세유체 3D 장치로 병합하고 정량화 가능한 기능 성작용제(12,,13)를위해 광유전학 단위를 사용하는 것을 포함한다. 그러나, 이러한 전략은 긴 배양 기간을 가지고 동시에 운동 뉴런 또는 골격 근투 중 NMJ의 주요 구성 요소를 얻기 위해 투쟁을 필요로한다. 그러나 NMJ의 또 다른 중요한 구성 요소인 슈완 셀은 이러한 배양 시스템에서 생성될 수 없습니다. Myotube, 모터 뉴런 및 슈완 세포를 포함하는 고급 배양 시스템은 NMJ 연구를 위한 안정적이고 견고한 모델을 제공할 수 있기 때문에 바람직합니다.
근생 분화 1 (MYOD1)은 근발생(14)에대한 잘 알려진 근생 조절제이다. MYOD1을 적용하여 iPSC를 심튜브로 구동하는 효율적인 근생 분화 방법은 이전 연구15에서구축되었다. 따라서, iPSC15에서MYOD1을 과발발현함으로써 myotube를 유도하고, 근생 분화의 고효율이 나타났다. 흥미롭게도, 신경 세포는 10 일 후에 자발적으로 myotube와 함께 나타났습니다. 근생 배양에서 신경 세포의 출현은 단일 접시에 시험관 NMJ를 생성하기위한 전략을 개발하는 우리를 주도하고있다. 여기서는 동일한 배양 접시에 있는 근생 및 운동 신경 유도를 위해 인간 iPSC에서 MYOD1을 과발로 표현하여 NMJ를 생성하는 전략을 제공합니다. 모터 뉴런은 여러 신경 영양요인(GDNF, BDNF, NT3 등)으로 자발적으로 유도됩니다. 도 8,한편, 슈완 세포는또한 16,,17을유도할 수 있다. 심코튜브, 운동 뉴런 및 슈완 세포 간의 상호 작용을 통해 성숙한 NMJ가형성된다 18. 이 방법은 기능성 NMJ를 효율적으로 생성하여 병리학 적 메커니즘 및 치료 화합물 스크리닝의 잠재적 연구를 가능하게 합니다.

<table><tbody><tr><td>Medium, 성장 인자 및 시약</td><td>Item</td><td>Brand</td><td>Cat. 번호</td></tr><tr><td></td><td>2-mercaptoethanol</td><td>Nacalai tesque</td><td>21418-42</td></tr><tr><td></td><td>B27, Gibco</td><td>Gibco</td><td>12587-001</td></tr><tr><td></td><td>BDNF</td><td>R & D Systems</td><td>248-BD</td></tr><tr><td></td><td>세포 분리 솔루션, Accumax</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>#07921</td></tr><tr><td></td><td>임계점 건조기</td><td>Hitachi</td><td>ES-2030</td></tr><tr><td></td><td>Doxycycline</td><td>Takara</td><td>631311</td></tr><tr><td></td><td>ECM, Matrigel (성장 인자 감소)</td><td>Corning</td><td>356230</td></tr><tr><td></td><td>GDNF</td><td>R & D Systems</td><td>212-GD</td></tr><tr><td></td><td>겔화, IP 겔</td>, <td>Geno Staff</td><td>PG20-1</td></tr><tr><td></td>, <td>이온 코터,</td><td>JEOL</td><td>JEC3000FC</td></tr><tr><td></td><td>iPSC 매체, mTeSR</td>, <td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td></tr><tr><td></td>, <td>KnockOut SR (KSR)</td><td>Gibco</td><td>10828-028</td></tr><tr><td></td><td>라이브 셀 현미경</td>, <td>Nikon</td><td>Eclipse Ti 현미경</td></tr><tr><td></td>, <td>MEM-alpha</td><td>Gibco</td><td>12571-071</td></tr><tr><td></td><td>모션 벡터 분석 소프트웨어</td><td>Sony</td><td>SI8000</td></tr><tr><td></td><td>N2, Gibco</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td></tr><tr><td></td><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td></tr><tr><td></td><td>NT3</td><td>R & D Systems</td><td>267-N3</td></tr><tr><td></td><td>영장류 ES 세포 매체</td><td>ReproCell</td><td>RCHEMD001</td></tr><tr><td></td><td>SEM</td><td>Hitachi</td><td>S-4700</td></tr><tr><td></td><td>TEM</td><td>Hitachi</td><td>H7650</td></tr><tr><td></td><td>Y27632</td><td>Wako Chemicals GmbH</td><td>253-00513</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td>Brand </td><td><강한>고양이. 번호</td><td>희석</td></tr><tr><td></td><td>Molecular Probes</td><td>B3545</td><td>0.5 ug/ml</td></tr><tr><td>Islet 1</td><td>DSHB</td><td>40.2D6</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Myosin heavy chain (MYH)</td><td>MilliporeSigma</td><td>A4.1025</td><td>1/300</td></tr><tr><td>Neurofilaments (NF)</td><td>MilliporeSigma</td><td>MAB5254</td><td>1/500</td></tr><tr><td>S-100</td><td>Abcam</td><td>ab14849</td><td>1/300</td></tr><tr><td>시냅스 소포 단백질 2 (SV2)</td><td>DSHB</td><td>SV2</td><td>1/50</td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>Covance</td><td>MMS435P</td><td>1/1000</td></tr></tbody></table>

인체 유발 만능 줄기 세포에서 유도 된 체외 신경 근육 정션

In vitro Neuromuscular Junction Induced from Human Induced Pluripotent Stem Cells

신경 근육 접합 (NMJ)은 모터 뉴런에서 기계적 움직임을위한 골격 근육으로 작용 잠재력을 전달하는 전문 시냅스입니다. NMJ 구조의 아키텍처는 뉴런, 근육 및 상호 상호 작용의 기능에 영향을 미칩니다. 이전 연구는 복잡한 유도 과정과 긴 문화 기간체에서 NMJ를 생성하기 위해 모터 뉴런과 근투를 공동 배양하여 많은 전략을보고했지만 성숙한 NMJ 형태와 기능을 재구성하는 데 어려움을 겪고있다. 당사의 시험관 NMJ 유도 시스템은 인간 iPSC를 단일 문화 요리로 차별화하여 구성됩니다. 유도를 위한 근생 및 신경 유발 유도 배지를 전환함으로써, 생성된 NMJ는 한 달 배양에서 운동 뉴런, 골격 근 및 슈완 세포를 포함한 사전 및 시냅스 성분을 함유하고 있었다. NMJ의 기능적 분석법은 또한 자극 신호가 NMJ를 통해 전달되는 큐레어, 아세틸콜린 수용체(AChR) 억제제인 카+++에 의해 심오튜브 수축을 유발할 수 있음을 보여주었다. 이 간단하고 견고한 접근 방식은 기능적 연결을 통해 NMJ의 복잡한 구조를 성공적으로 파생시켰습니다. 이 체외 인간 NMJ, 그것의 통합 된 구조 와 기능, 병리학 메커니즘 및 화합물 스크리닝을 공부에 대 한 유망한 잠재력을 가지고.

우리의 차별화 전략을 사용하여, 문화는 30 일에 NMJ의 사전 및 시냅스 후 구성 요소를 보여 주었다. NMJ 성분은 단일 우물에서 유도및 잘 발달되었고, NMJ내의 형태및 위치는 IF 현미경검사법(도1)에의해 입증되었다. 도 1A의 흐름 도는 NMJ 차별화 진행의 시간 과정을 요약합니다. 신경필라멘트(NF), 시냅스 소포(SV2) 및 AChR(도1B, C)의염색은 뉴런을 나타낸다. NF 및 SV2의 단일 염색 이미지는 보충 도 1에표시됩니다. 알파-분가로톡신 염색은 AChR(도1C)을나타낸다. 병합된 이미지는 NMJ(도1D,E)에서모터 뉴런 및 AChR의 상대위치를 나타낸다. IF 염색의 두 번째 세트는 Tuj1 및 Islet 1(도 1G, H)에의한 운동 뉴런과 미오신 중형 체인에 의한 시냅스 후 근시튜브(도1I)를나타낸다. 슈완 세포는 또한 NMJ 배양에서 S-100 항체에 의해 표지되었다(보충도 2).
NMJ 구성 요소의 ID를 추가로 확인하기 위해 자세한 형태 학적 분석을 위해 SEM을 사용했습니다. 확장된 축축단, 축축기 및 근육 섬유를 가진 성숙한 NMJ 형태는 도 2A,B에도시된다. TEM은 시냅스 소포를 함유한 시냅스 축종 전 말단과 시냅스 후 부분을 포함하는 NMJ 성분의 성숙한 초구조를 드러내기 위해 수행되었으며, 이는 시냅틱 갈라진(그림2C\u2012E)에의해 분리되었다. 접합은 뉴런과 근육 섬유의 접합을 표시하는 노란색 파선(도2C)으로표시됩니다. 시냅스 소포를 포함하는 성숙한 축축 단자는 도 2D,E(노란색 화살표)에 도시된다. 형태학적 결과는 NMJ 성분이 잘 유도되고 성숙되었다는 것을 보여줍니다.
시험관 내 NMJ의 기능을 평가하기 위해, 우리는 근관 수축을 트리거하기 위해 CaCl2로 모터 뉴런을 자극하여 모션 분석을 수행했습니다. 결과는 Ca2+ 근육 수축을 시작할 수 있다는 것을 보여주었습니다. 수축은 큐레어에 의해 중단 될 수 있습니다. NMJ는 큐레어처리(그림 3)로사라진 눈에 띄는 모션 신호를 보였다. 이 효과는 운동 신경 신호가 근육 수축을 트리거하기 위해 NMJ를 통해 전달되었다는 것을 확인합니다. 함께 종합하면, IF 현미경검사, SEM 및 TEM 데이터는 전술한 프로토콜에 의해 생성된 시험관 NMJ에서 NMJ 성분의 공간 분포, 형태 및 성숙을 입증했다. 모션 분석은 치료 전략을 개발하는 데 잠재적 인 응용 프로그램을 의미 시험관 NMJ의 기능을 검증.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61396/61396fig01.jpg"> 그림 1: NMJ 유도및 NMJ 문화의 IF 이미지에 대한 플로우 차트. (A)NMJ 차별화 진행을 위한 플로우차트. (B\u2012F) NMJ 성분, 신경필라멘트(NF), 시냅스 소포(SV2) 및 AChR의 검출. 패널 D의 흰색 화살표는 NMJ를 나타냅니다. (G\u2012K) NMJ의 시냅스 전 및 시냅스 후 구성 요소. Tuj1 및 Islet1은 운동 뉴런을 나타내고, myosin 중형 체인(MYH)은 근관을 나타낸다. a-BTX, 알파 분가로톡신. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61396/61396fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61396/61396fig02.jpg"> 그림 2: 성숙한 NMJ의 SEM 및 TEM 이미지. (A)NMJ 성분의 공간 분포는 근육 섬유(Mf)의 표면에 고정된 축축단단을 보여준다. (B)NMJ의 배율이 높을수록 축축단단이 나타난다. (C)시냅스 축산 단자(빨간 화살촉) 및 시냅스 소포(Sv), 시냅틱 갈라진(Sc) 및 시냅스 후 부품(적색 화살표)을 가진 성숙한 NMJ의 초구조. 접합(jf)은 노란색 파선으로 표시됩니다. 도끼, 축산. (D, E) 높은 배율 이미지는 축산 단자 (노란색 화살표)의 시냅스 소포를 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61396/61396fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61396/61396fig03.jpg"> 그림 3: 시험관 내 NMJ의 Myotubes 수축 분석. Myotubes 수축은 25 mM CaCl2 솔루션 (녹색 선)으로 트리거되었습니다. 수축은 큐레레(노란색 선)로 처리된 후에 억제되었다. 또한 보충 영화 1 및 보충 영화 2를참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61396/61396fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보조 영화 1 : Ca++에의해 트리거 된 myotube수축 . <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61396/Suppl_movie_1_Before_add_curare.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보조 영화 2: 큐레어 치료 후 myotube의 훨씬 약한 수축이 표시됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61396/Suppl_movie_2_After_add_curare.mp4" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 도 1: NMJ 문화에서 신경 필라멘트 (NF, 흰색 화살표)의 단일 염색 이미지. NMJ 문화에서 시냅스 소포 (SV2, 흰색 화살표)의 단일 염색 이미지. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61396/61396supfig01.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 도 2: NMJ 배양에서 S-100 항체에 의해 표지된 슈완 세포. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61396/61396supfig02.jpg" target="_blank">이 그림을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>근생 분화 물질 (MDM)</td>
			<td>MEM 알파</td>
			<td>500mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>100mM 2-ME</td>
			<td>1117μL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>독시사이클린</td>
			<td>1μg/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>KSR</td>
			<td>56mL (최종 10%)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>펜/스트렙</td>
			<td>2.5mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>총</td>
			<td>560mL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>100mM 2-메르카토에탄올</td>
			<td>2-메르카토에탄올</td>
			<td>7μL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>d.d. 물</td>
			<td>993μL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>총</td>
			<td>1000μL</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3"></td>
		</tr>
<tr>
<td>NMJ 매체</td>
			<td>신경 물질 배지 (NB)</td>
			<td>500mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>B27</td>
			<td>1x(50x 재고)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>BDNF</td>
			<td>10ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>GDNF</td>
			<td>10ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>N2</td>
			<td>1x(100x 재고)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>NT3</td>
			<td>10ng/mL</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>펜/스트렙</td>
			<td>2.5mL</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 중간 식수.

여기서 우리는 인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)에서 시험관 내 NMJs를 생성하는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 단일 우물에서 1 개월에 성숙한 형태와 기능을 가진 NMJs를 유도할 수 있다. 결과 NMJs 잠재적으로 관련 질병을 모델링 하는 데 사용할 수 있습니다., 병리학 메커니즘을 공부 하거나 치료에 대 한 약물 화합물을 검사.

The neuromuscular junction (NMJ) is a specialized synapse that transmits action potentials from the motor neuron to skeletal muscle for mechanical ...

이 인간 신경 근육 접합 유도 시스템은 운동 뉴런, 골격 근 및 슈완 세포를 포함한 시냅스 전 및 시냅스 구성 요소의 형성을 유도하는 데 사용할 수 있습니다. 성숙하고 복잡한 NMJ 구조는 단일 시작 세포 집단으로부터 단일 배양 접시에서 얻을 수 있을 뿐만 아니라, 그 결과 NMJ는 또한 계약할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이 방법은 척추 근육 위축과 같은 신경 근육 질환을 연구하고 치료 화합물 검사를 할 가능성이 있습니다.분화 된 NMJ는 매우 두껍고 복잡한 조직이며 시각화하기가 어렵습니다. 절차를 시연함으로써 독자에게 특정 구조를 식별하는 방법을 지시할 수 있습니다. 페트리 접시에 세포 분리 용액 1 밀리리터를 추가하기 전에 PBS의 3 밀리리터로 세포를 씻으시다.섭씨 37도에서 10분 후, 각 웰에 3밀리리터의 영장류 배아 줄기 세포 배지를 넣고 세 번 부드럽게 파이펫을 추가하여 커버립에서 세포를 해리시합니다. 다음으로, 분리된 줄기 세포 함유 슈퍼나티를 원심분리를 위한 50밀리리터 원전 튜브로 풀링하고, 10 마이크로몰라 Y-27632 ROCK 억제제로 보충된 신선한 영장류 배아 줄기 세포 배지의 3밀리리터에서 줄기 세포 펠릿을 재연한다. 그런 다음 ROCK 억제제 농도로 보충된 배지의 밀리리터 당 5개의 세포로 세포를 2회 10으로 희석시키고 세포외 매트릭스 코팅 6웰 플레이트의 각 웰에 있는 각 커버슬립에 2밀리리터의 세포를 반환한다.24 시간 후에, 민체배스 배아 줄기 세포의 2밀리리터로 각각의 우물을 독시사이클린의 밀리리터 당 1 마이크로그램으로 보충하고 24 시간 동안 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 반환합니다. 인큐베이션의 끝에서, 슈퍼네이션을 2밀리리터의 분화 배지로 잘 보충하고 10일 동안 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 되돌린다. 인큐베이션이 끝나면, 수퍼네티츠를 양분균 분화 배지의 2밀리리터로 잘 보충하고 10일 동안 세포 배양 인큐베이터로 플레이트를 반환한다.인큐베이션이 끝나면, 슈퍼네이션을 신경근육 접합 배지의 2밀리리터로 교체하고 30일 동안 세포 배양 배양배로 플레이트를 되돌려 놓는다. 인큐베이션의 끝에서, 반전 된 현미경 검사법에 의해 차별화 된 신경 근육 접합을 시각화. 근피 수축을 트리거하려면, 분화 된 신경 근육 접합 세포의 각 우물에 25 밀리몰러 칼슘 염화 칼슘을 추가합니다.그리고 치료 1~2분 이내에 반전된 현미경의 무대에 접시를 놓습니다. 살아있는 세포 현미경 검사를 사용하여 20 초 동안 myotube 수축의 영화를 기록하십시오. 레코딩이 끝나면 큐레어 밀리리터당 300나노그램을 배양 배지에 추가하고 분석을 위한 적절한 모션 벡터 분석 소프트웨어 프로그램에서 영화 파일을 열기 전에 20초 동안 영화를 녹화합니다.신경필라멘트 시냅스 혈관및 아세틸콜린 수용체의 면역형염색은 뉴런을 식별하기 위해 수행될 수 있다. 모터 뉴런은 TUJ 1 과 Islet 1 염색에 의해 규명될 수 있고, 시냅스 후 근시 결핵은 미신 중형 체인에 대한 염색을 통해 식별할 수 있다. 슈완 세포는 S-100 항체로 표지될 수 있다.이러한 스캐닝 전자 현미경 이미지에서, 성숙한 신경 근육 접합의 형태는 확장된 축축단, 축축및 근육 섬유의 명확한 시각화로 관찰될 수 있다. 전염 전자 현미경 검사는 시냅스 소포와 시냅스 갈라진 부위를 가진 사전 시냅스 축슨 말단과 시냅스 후 영역을 포함한 신경 근육 성분의 성숙한 울트라 구조를 시각화하는 데 사용될 수 있다. 접합은 뉴런과 근육 섬유 사이의 접합을 표시합니다.여기서, 시냅스 소포를 포함하는 성숙한 축축 단말이 도시된다. 종합하면, 이러한 형태학적 특징은 신경 근육 성분이 잘 유도되고 성숙되었음을 나타냅니다. 세포의 기능적 평가는 눈에 띄는 신경 근육 접합 모션 신호가 염화칼슘에 의해 유도될 수 있고 이러한 수축은 운동 뉴런 신호가 근육 수축을 유발하기 위해 신경 근육 접합을 통해 전달된다는 것을 확인하는 큐라레에 의해 중단될 수 있음을 보여준다.세포 파종 밀도는 NMJ 형성의 효율성에 영향을 미칩니다. 실험 목적에 따라 프로토콜에 적응하도록 수정할 수 있다. 이 신경 근육 접합 배양은 다중 세포 모형을 포함하고, 이 분대는 신경 근육 접합 발달 도중 또는 특정 질병 병리에 응하여 이 세포 사이 상호 작용을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.

in-vitro-neuromuscular-junction-induced-from-human-induced

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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Differentiating human-induced pluripotent stem cells into neurons on micro-electrode arrays (인간 유도 만능 줄기세포를 마이크로 전극 어레이의 뉴런으로 분화)

이 실험은 인간이 유도한 만능 줄기 세포에서 신경근 접합부를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 그것은 단계적 분화 과정을 사용하여 근관과 운동 뉴런 발달 및 시냅스 형성을 촉진하여 기능적 신경근 접합을 생성합니다.

In Vitro Induction of Neuromuscular Junctions from Engineered Human-Induced Pluripotent Stem Cells

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